Dans le cadre de la bioévaluation de matrices polluées, les objectifs de cette thèse ont d’abord été de mettre au point deux tests de génotoxicité sur les racines secondaires de la fève Vicia faba. D’abord, le test des micronoyaux, dont les résultats prometteurs ont permis l’initiation d’un processus de normalisation internationale par l’ISO. Ensuite, l’essai des comètes, avec des résultats moins encourageants en termes de faisabilité et de précision. Nous avons également tenté d’éclaircir les conséquences de la formation de micronoyaux sur le cycle de vie de la plante. Les résultats obtenus avec le cadmium, le cuivre et l’hydrazide maléique suggèrent un lien entre la présence de micronoyaux à court terme et une modification à long terme des traits d’histoire de vie de la plante. Le test des micronoyaux a aussi été appliqué parmi d’autres biomarqueurs pour évaluer l’écotoxicité de matrices contaminées, liquides ou solides. Dans le cadre du Groupement d’Intérêt Scientifique pour les Friches Industrielles (GISFI), nous avons évalué la génotoxicité de sols pollués par d’anciennes activités de cokerie. Nous avons également participé au projet « Ecotoxicité des sous-produits d’altération de Nanomatériaux » (Nanoalter), dans le cadre duquel nous avons évalué les dangers potentiels posés par la dégradation dans l’environnement de crèmes solaires comprenant des nanoparticules de dioxyde de titane. Enfin, les mécanismes de tolérance des plantes aux toxiques ont été étudiés par le dosage des phytochélatines et des enzymes du stress oxydant. / In the context of optimizing plant tests for polluted soil materials bioassessment, the objectives of this thesis were firstly the development of two genotoxicity tests on the secondary roots of a plant model, the broad bean Vicia faba. The first test was the micronucleus assay and gave promising results that lead to an international ISO standardizing process. The second test named comet assay and brought us less encouraging results because of problems with feasibility and precision. .To improve our knowledge about the consequences of micronuclei formation on plant life cycle, we studied life-history traits of beans developing from germination in a soil containing a sufficient quantity of genotoxic (cadmium, copper and maleic hydrazide) to induce micronuclei without provoking short-term (48h) growth retardation. The obtained results evoked a link between micronuclei presence after 48h and plant life cycle change or impairments.Besides, the micronucleus assay was applied among other assays or biomarkers to evaluate ecotoxicity of liquid or solid contaminated matrix. As part of the French Scientific Interest Group on Industrial Wasteland (GISFI), we evaluated the genotoxicity of soils polluted by a former coke-factory. Furthermore, we took part to the project “Ecotoxicity of nanomaterial alteration byproducts”, also called Nanoalter. Our goal was to assess the potential hazards attached to the environmental degradation of titanium dioxide-containing sunscreen nanocomposites. Then, the tolerance mechanisms of plants towards chemicals were studied by phytochelatins and oxidative stress enzymes measurements.

Le Cuivre (Cu) appartient aux métaux majeurs contaminant les écosystèmes dulcicoles européens. Les bivalves sont des filtreurs qui bioaccumulent fortement les métaux lourds comme le Cu, lequel, en excès cause de graves troubles métaboliques, et physiologiques. Le but de cette thèse est d'étudier les mécanismes de toxicité et de détoxication du cuivre chez Anodonta cygnea et Anodonta anatina, bivalves largement répandus dans les eaux continentales. L'effet du Cu a d'abord été étudié sur le transport cellulaire du calcium (Ca). Le Ca intervient dans de nombreux processus biologiques et le métabolisme calcique est connu pour être perturbé par le Cu chez les mollusques. L'inhibition par le Cu de l'activité de la Ca2+-ATPase de la membrane plasmique (PMCA) a été observée après 4 jours d'exposition. La récupération totale de l'activité enzymatique a été notée dans les reins et les branchies, après 7 jours d'exposition à concentration environnementale, mais pas à plus forte concentration. L'inhibition des PMCA pourrait entraîner des perturbations de l'osmorégulation et de la réabsorption rénale du calcium chez les moules et conduire à une carence. La récupération de l'activité enzymatique suggère l'induction de mécanismes de détoxications. Les composés riches en thiol, impliqués dans l'homéostasie et la détoxication des métaux ont donc été étudiés dans une seconde étape. Nos résultats montrent la présence d'un peptide riche en cystéine, différent du glutathion, et détecté dans la glande digestive et les branchies des bivalves exposés ou non au Cu. Ce peptide, augmente significativement dans les branchies, après exposition au Cu suggérant son implication dans sa détoxication / Copper (Cu) belongs to the major metals causing environmental contamination in European fresh water ecosystems. Filter feeding bivalves have a high bioaccumulation potential for heavy metals as Cu, which at high concentration can cause serious metabolic, physiological impairments. The objectives of this thesis are to acquire knowledge about toxic effects and detoxification mechanisms of Cu in Anodonta cygnea and Anodonta anatina, two mussels species widely distributed in continental waters. Because calcium (Ca) plays a fundamental role in numerous biological processes, Cu effect was studied first on cellular calcium transport which is known to be disturbed by Cu in molluscs. In a second step, investigations have been carried out on Cu detoxification mechanisms by thiol compounds known to be involved in homeostasis of essential trace metals and in metals cell detoxification. Cu inhibited plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA) activities upon 4 days of exposure was obtained. Total recovery was observed at day 7 in kidneys and gills under exposure to environmental Cu concentration but not at higher level of exposure. PMCA inhibition may entail disturbance of osmo-regulations and calcium renal re-uptake in mussels and lead to continuous under-supply of Ca. Recovery of the enzyme function suggests that metal-detoxification is induced. Our results showed the presence of a cysteine-rich peptide different from glutathione, detected in the digestive gland and the gills from controls and Cu exposed bivalves. This peptide, observed in absence of metal exposure in both organs, increased significantly in gills after Cu exposure suggesting its implication in Cu detoxification mechanisms

Les mécanismes de complexation et d'accumulation des radionucléides au niveau cellulaire et moléculaire sont complexes et mal connus car les études sur ces sujets sont peu nombreuses. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié les interactions de l'europium (analogue des actinides trivalents) et d'un actinide : l'uranium (VI), avec des molécules biologiques d'intérêt : les phytochélatines. Leur rôle est de protéger les cellules contre les intrusions de métaux lourds non essentiels (donc toxiques). Ces protéines sont donc susceptibles d'être impliquées dans les mécanismes de séquestration des radionucléides chez le vivant. Elles ont toutefois une structure complexe, c'est pourquoi, afin de mieux comprendre leur réactivité, nous avons étendu nos études aux sous entités qui les constituent (acides aminés et glutathion). <br />Nous avons en particulier déterminé la spéciation en solution (stoechiométrie, structure) ainsi que les constantes d'équilibre associées à la formation de ces espèces. Ces études ont été menées par Spectrofluorimétrie Laser à Résolution Temporelle (SLRT), ElectroSpray-Spectrométrie de Masse (ES-SM), Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IRTF) et Spectroscopie d'Absorption X (EXAFS). La détermination des constantes d'équilibre nous a permis de conclure que le pouvoir complexant de ces molécules vis-à-vis des radionucléides était modéré (log10K1 < 3, à pH 3 ou 6), les espèces formées sont mononucléaires avec une seule molécule de ligand (1:1). L'interaction se fait via les groupements durs (oxygénés). La complexation directe de l'europium par des molécules de phytochélatines à pH acide a été étudiée conjointement par SLRT et ES-SM. Le pouvoir complexant de ces molécules est bien supérieur à celui du GSH dont elles sont pourtant issues. Outre les travaux menés sur des solutions synthétiques reproduisant les conditions « biologiques » (pH proche de la neutralité, force ionique 0,1 mol/L, etc.), des tests de contamination cellulaire ont été réalisés. La quantification de l'europium intégré a montré que celles-ci sont capables d'incorporer significativement l'europium.

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii. / Phytochelatins (PC) are polypeptides having the general structure, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, where n = 2 to 11. Many plants respond to an elevated concentration of metals in environment, particularly Cd, by synthesizing PC. The purpose of this study was to develop a tool to assess the bioavailability of the Cd in fresh water by determining phytochelatins in algae, C. reinhardtii, by online HPLC-ESI-MS/MS. The gold of this work was the validation of the analytical method i.e. the determination of the calibration curves and the limits of detection. The addition of dithiothreitol (DTT), 25 mM, was found to be necessary to maintain the PC in their reduced form for analysis. It was shown that the liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) technique has excellent potential for PC analysis, however, it will still requires some more work with respect to sample purification. Furthermore, the stability of the PC was evaluated for different sample storage temperatures. At all temperatures studied, some degradation of PC was observed possibly due to physical rather than chemical or bacterial reasons. Finally, the induction of phytochelatins (PC2, PC3 and PC4) was observed in C. reinhardtii for two Cd concentrations (10-7 M and 10-6 M) and for several induction times (1, 2, 4, and 6 h).

Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS). / In contaminated environments, organisms are often exposed to multiple contaminants at the same time. Based upon the current models for predicting metal effects on organisms (e.g., Biotic Ligand Model, BLM, the free ion model, FIAM), the presence of a second metal is predicted to decrease the bioaccumulation and biological effects of the first. In contrast to this prediction, antagonistic, synergistic and additive effects have been well documented in the literature. Phytochelatins (PCs) are a family of thiol-rich peptides with a general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly with n=2-11. PCs are involved in both metal homeostasis and the protection of plants from metal toxicity, through their role as metal chelators. Their synthesis depends upon the metal exposure, the duration of exposure and the biological species involved. Therefore, the objective of this study was to determine, in binary mixtures of metals, if the synthesis of phytochelatins could be predicted using equilibrium models, such as the BLM. The study initially examined binary mixtures: Cd-Ca, Cd-Pb and Cd-Cu by comparing the quantity of internalized metal to the amount of phytochelatins produced by Chlamydomonas reinhardtii in response to a metal stress. The bioaccumulation results, after six hours of exposure, showed that Cd decreased in the presence of Ca and very high concentrations of Pb and Cu. In contrast, it increased in the presence of Cu and remained unchanged in the presence of moderate concentrations of Pb. For mixtures of Cu and Cd, a good correlation was observed between the production of PC2, PC3 and PC4 and the quantity of internalized metals. Both bioaccumulation and phytochelatin synthesis were considered to be synergistic. For mixtures of Cd and Ca, the amount of PC3 and PC4 produced decreased with the internalized metal (antagonistic effect); however, in the presence of added Ca, GSH and PC2 production was much higher than predicted. The detection and quantification of the PCs were performed using an optimized protocol for high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection (HPLC-FL); metal uptake was determined using atomic absorption spectrometry (AAS) or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii. / Phytochelatins (PC) are polypeptides having the general structure, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, where n = 2 to 11. Many plants respond to an elevated concentration of metals in environment, particularly Cd, by synthesizing PC. The purpose of this study was to develop a tool to assess the bioavailability of the Cd in fresh water by determining phytochelatins in algae, C. reinhardtii, by online HPLC-ESI-MS/MS. The gold of this work was the validation of the analytical method i.e. the determination of the calibration curves and the limits of detection. The addition of dithiothreitol (DTT), 25 mM, was found to be necessary to maintain the PC in their reduced form for analysis. It was shown that the liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) technique has excellent potential for PC analysis, however, it will still requires some more work with respect to sample purification. Furthermore, the stability of the PC was evaluated for different sample storage temperatures. At all temperatures studied, some degradation of PC was observed possibly due to physical rather than chemical or bacterial reasons. Finally, the induction of phytochelatins (PC2, PC3 and PC4) was observed in C. reinhardtii for two Cd concentrations (10-7 M and 10-6 M) and for several induction times (1, 2, 4, and 6 h).

Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS). / In contaminated environments, organisms are often exposed to multiple contaminants at the same time. Based upon the current models for predicting metal effects on organisms (e.g., Biotic Ligand Model, BLM, the free ion model, FIAM), the presence of a second metal is predicted to decrease the bioaccumulation and biological effects of the first. In contrast to this prediction, antagonistic, synergistic and additive effects have been well documented in the literature. Phytochelatins (PCs) are a family of thiol-rich peptides with a general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly with n=2-11. PCs are involved in both metal homeostasis and the protection of plants from metal toxicity, through their role as metal chelators. Their synthesis depends upon the metal exposure, the duration of exposure and the biological species involved. Therefore, the objective of this study was to determine, in binary mixtures of metals, if the synthesis of phytochelatins could be predicted using equilibrium models, such as the BLM. The study initially examined binary mixtures: Cd-Ca, Cd-Pb and Cd-Cu by comparing the quantity of internalized metal to the amount of phytochelatins produced by Chlamydomonas reinhardtii in response to a metal stress. The bioaccumulation results, after six hours of exposure, showed that Cd decreased in the presence of Ca and very high concentrations of Pb and Cu. In contrast, it increased in the presence of Cu and remained unchanged in the presence of moderate concentrations of Pb. For mixtures of Cu and Cd, a good correlation was observed between the production of PC2, PC3 and PC4 and the quantity of internalized metals. Both bioaccumulation and phytochelatin synthesis were considered to be synergistic. For mixtures of Cd and Ca, the amount of PC3 and PC4 produced decreased with the internalized metal (antagonistic effect); however, in the presence of added Ca, GSH and PC2 production was much higher than predicted. The detection and quantification of the PCs were performed using an optimized protocol for high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection (HPLC-FL); metal uptake was determined using atomic absorption spectrometry (AAS) or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).