A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

Ingeniero Civil en Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la gran demanda de proteínas recombinantes y en particular de anticuerpos para el uso terapéutico en humanos, se busca optimizar los cultivos celulares para obtener mayor producción de proteínas y menores costos de producción. Uno de los métodos utilizados en el mejoramiento de los cultivos es la ingeniería celular donde, mediante la inserción o eliminación de un gen, se modifican las vías metabólicas de las células. Las líneas celulares animales tienen la desventaja de que su metabolismo es incapaz de oxidar la glucosa completamente a CO2 y H2O. La mayor parte de la glucosa, es oxidada a piruvato y finalmente a lactato, el que tiene un impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de proteínas. El trabajo consistió en caracterizar los clones CHO MDHII y CHO PYC generados a partir de una línea celular CHO productora de IgG, que sobreexpresan los genes MDHII y PYC2 las cuales han mostrado mejorar la eficiencia del metabolismo en otras líneas celulares, produciendo menos lactato y aumentando el flujo de carbonos desde la glicólisis hacia el ciclo del TCA. Para ello fue necesario hacer una selección previa de clones, de tal forma de escoger a los que presentaran mayor productividad específica de IgG y mayor eficiencia metabólica, caracterizada por valores bajos de producción de lactato por glucosa consumida (ΔL/ΔG). Luego se procedió a realizar las curvas de crecimiento para los clones y las células CHO wild-type que se utilizó como control. Para la caracterización del metabolismo, se midió la glucosa consumida, la producción de lactato, IgG y amonio, y se calcularon las tasas de consumo y producción de los metabolitos. La caracterización de la expresión transcripcional se realizó mediante un PCR en tiempo real, para el que fue previamente necesario extraer el RNA de las muestras, seguida de la síntesis de cDNA. Los resultados mostraron una menor producción de biomasa y anticuerpo IgG en los clones en comparación al control CHO wild-type, debido a un aumento inesperado en la producción de este último. Por otro lado, sí fue posible demostrar una mayor eficiencia metabólica de los clones debido a la disminución en la producción de lactato, en el caso del clon CHO MDHII y a una menor diferencia entre las tasas de producción de lactato y consumo de glucosa, en el clon CHO PYC. Al comparar las eficiencias de ambos clones, las células CHO MDHII mostraron una mayor eficiencia metabólica lo que se debería a un mayor flujo de carbonos desde la glicólisis al ciclo del TCA. Se cree que el clon CHO PYC no mostró una mayor eficiencia metabólica debido a que se generaría una acumulación de malato que no podría ser procesada por la enzima MDHII en el ciclo del TCA. Los cálculos de productividad específica de IgG demostraron que la producción de proteína recombinante estaría asociada al crecimiento celular y se cree que el consumo de glutamina cumpliría un rol importante en la producción de biomasa e IgG debido a que se obtuvieron mayores concentraciones de amonio en las células con mayor densidad y producción de proteína. El análisis de la expresión transcripcional no permitió detectar diferencias en la amplificación de los genes MDHII y PYC2, principalmente debido a la variación en los resultados obtenidos y a que no fue posible amplificar un producto específico para el gen PYC2. Del trabajo se puede concluir que el clon CHO MDHII presentó una mayor eficiencia metabólica debido a la menor producción de lactato y exhibió mayor producción de biomasa e IgG que el clon CHO PYC. Para comprender mejor el comportamiento de estos clones, se debe llevar a cabo un estudio de los flujos en las vías metabólicas y buscar métodos de cultivo que optimicen el crecimiento celular y la producción de proteína, para obtener el máximo beneficio de los clones. Por otro lado, es importante que en el proceso de la selección de clones, la productividad de proteína recombinante de los clones se compare con una muestra control, de tal manera de verificar que estos presentan una mejora. Además se deben seleccionar los clones que presenten una mayor densidad celular y menor producción de lactato, ya que se ha visto que estas características mejoran la productividad.

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:28:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ohanna_bezerra_ioc_mest_2015.pdf: 4663444 bytes, checksum: 4247a27130a3c1e033f6b0fe1051e5c3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica provocada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae. Dado à baixa variabilidade desse bacilo, aliado à variedade de formas clínicas desenvolvidas na hanseníase, sugere-se que o componente genético do hospedeiro é o grande responsável pelo desenvolvimento da doença. Até o momento, polimorfismos de base única (SNPs) em diversos genes foram associados com a predisposição à hanseníase em estudos independentes em diferentes populações. Recentemente, SNPs no gene PKLR foram associados ao risco de desenvolvimento da hanseníase pelo nosso grupo. Na tentativa de melhor investigar o efeito de suscetibilidade desse gene a patógenos intracelulares, o presente estudo avaliou a associação de SNPs adicionais do PKLR com a hanseníase na população Brasileira e com a tuberculose na população de Moçambique. Os parâmetros funcionais relacionados aos marcadores do PKLR também foram avaliados. Inicialmente, foi feita uma seleção de SNPs a partir da busca nos dados do HapMap. Estes SNPs foram genotipados em um estudo de associação seguindo um desenho do tipo caso-controle na população do Rio de Janeiro. Os resultados mostraram uma associação significativa de suscetibilidade a hanseníase para os SNPs rs11264355, rs11264359, rs4620533 e rs4971072 na população do Rio de Janeiro, assim como para o haplótipo rs11264355G/rs11264359G/rs4620533G/rs49710729 Em seguida, os SNPs rs4620533 e rs4971072 foram usados para um segundo estudo de associação do tipo caso-controle em uma população de Moçambique, onde não foi verificada associação com a tuberculose. Paralelamente, foi realizado o sequenciamento do éxon 11 do PKLR em populações com diferentes backgrounds genéticos e o perfil de desequilíbrio de ligação destas populações foi caracterizado. O resultado expandiu a análise de SNPs deste trabalho e contribuiu para definir \201Ctag SNPs\201D ligados aos marcadores de risco. Em seguida, a relação genótipo-fenótipo foi avaliada através da análise de parâmetros sanguíneos e da atividade da enzima piruvato quinase (PK). Os genótipos associados no estudo genético mostraram estar relacionados com o aumento de ferritina em indivíduos sadios. Posteriormente, estes genótipos sugeriram associação com o aumento de haptoglobina em indivíduos sadios e em pacientes. Por fim, não foram observadas alterações nos níveis de atividade da PK em função dos genótipos. Os achados do presente estudo confirmam a associação genética do PKLR com suscetibilidade à hanseníase na população do Rio de Janeiro, assim como sugere a correlação entre os marcadores genéticos e os níveis de ferritina e haptoglobina. O dado genético integrado aos resultados funcionais sugere um potencial efeito biológico que poderia propiciar o risco ao desenvolvimento de doenças por patógenos intracelulares / Leprosy is a chronic infectious disease caused by the obligate intracellu lar pathogen Mycobacterium leprae . Given the low variability of the bacile with the variety of clinical phenotype exhibited in leprosy, it is suggested that the genetic componente of the host is responsable to leprosy development. Until now, single nucleot ide polymorphisms (SNPs) in many genes were associated with leprosy predisposition in independente studies and population. R ecently , SNPs in t he PKLR gene wer e associated with leprosy susceptibility by our group. Aiming to investigate the susceptibility to intracellular pathogens, this study evaluated the association of additional SNPs of the PKLR in a Brazilian population , followed by an case - control study with tuberculosis in a Mozambique population. F unctional parameters correlated to the polymorphic var iants were also evaluated. Initially, using the HapMap population data , we performed a n analysis to search for SNPs which were tested in an case - control association study. Results show ed a significant susceptibility associat ion with leprosy within SNPs rs1 1264355, rs11264 359, rs4620533 and rs4971072 in Rio de Janeiro population . In addition, we demonstrated that the haplotype rs11264355G/rs11264359G/rs4620533G/rs4971072G was significantly associated with leprosy susceptibility in this population. Then SN Ps rs4620533 and rs4971072 were tested in a case - control study with a Mozambique population and no association with TB was verified. In parall el, we sequenced the PKLR exon 11 in order to seek new SNPs in the region and characterize the linkage disequilibrium profile in populations with different genetic backgrounds. This result has expanded the SNPs analysis of this work and contributed to define "tag SNPs" linked to risk markers. Also the genotype - phenotype relationship was assessed by the analysis of blood parameters and p YRI vate kinase (PK) activity. The genotypes were correlated with increased ferritin and haptoglobin levels in healthy indivi duals and they were significantly associated with increased haptoglobin in leprosy patients. Posteriorly, no changes were observed in PK activit y within the genotypes . T his study confirmed the genetic association of PKLR with leprosy susceptibility in Rio de Janeiro population. Thus t h ese findings reinforces the genetic association of PKLR with leprosy in the population of Rio de Janeiro , as well as identified a correlation between the genetic markers and ferritin and haptoglobin level s. F unctional results suggest ed a potential biological effect of the variants that could provide risk to the development of intracellular pathogens . / 2016-06-22

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specific organelle damage caused by valinomycin, to maintain cell homeostasis. Interestingly, the loss of Atg32 function only partially affected the respiratory complex specific degradation, while the Atg11 protein was absolutely required in this process. Fission and fusion machinery proteins (Fzo1 and Fis1) and some mitochondrial proteases (Yme1, Pim1 and Afg3) also have a role in the valinomycin-mediated mitophagy. This process might start by Atg11 accumulation in foci close to the mitochondria shortly after valinomycin treatment. In this work, we describe for the first time a specific mechanism of mitophagy mediated by damage in yeast, which opposes to the concept of a generalized degradation of the organelle. / [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condiciones ambientales, se quiso estudiar qué ocurría en los complejos de la cadena de transporte de electrones en estas condiciones. Se observó que los complejos I y III se degradaban ante elevadas tasas respiratorias, al parecer como un mecanismo de reciclaje. Además, ante un daño mitocondrial específico utilizando valinomicina, también existía una degradación específica de los complejos respiratorios I y III, para mantener la homeostasis celular. Este proceso es dependiente de Atg11, e independiente de Atg32. También parecen implicadas proteínas de la maquinaria de dinámica mitocondrial (Fzo1 y Fis1) y algunas proteasas mitocondriales (Yme1, Pim1 y Afg3). El inicio de este proceso parece producirse ante la aparición de foci de Atg11 cercanos a la mitocondria. Se describe por primera vez en levadura un mecanismo específico de mitofagia inducida por daño, que contrasta con el concepto de degradación generalizada del orgánulo. / [CAT] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electrònic a aquestes condicions. Es va observar que els complexes I i III es degradaven davant d'elevades taxes respiratòries, com a mecanisme de reciclatge. A més, davant d'un dany mitocondrial específic utilitzant valinomicina, també existia una degradació específica dels complexes respiratoris I i III, per a mantenir l'homeòstasi cel·lular. Aquest procés és depenent d'Atg11, però independent d'Atg32. També semblen implicades proteïnes de la maquinària de dinàmica mitocondrial (Fzo1 i Fis1) i algunes proteases mitocondrials (Yme1, Afg3 i Pim1). L'inici d'aquest procés sembla produir-se per l'aparició de foci d'Atg11 propers a la mitocòndria. Per primera volta, es descriu en llevat un mecanisme específic de mitofagia induïda per dany, que contrasta amb el concepte de degradació generalitzada de l'orgànul. / Timón Gómez, A. (2016). MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/64873 / TESIS

INTRODUÇÃO: Estudos recentes em modelos experimentais de sepse demonstraram as propriedades antioxidante e anti-inflamatória do etilpiruvato. Diferentes modelos experimentais também demonstraram que pequenos volumes de solução salina hipertônica (7,5%) melhoram a hemodinâmica, a microcirculação e modulam o sistema imunológico. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do etil-piruvato, da solução salina hipertônica e da solução de Ringer lactato sobre a microcirculação mesentérica em modelo de sepse induzida por Escherichia coli viva em ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar machos receberam por via endovenosa uma suspensão de E. coli ou foram submetidos ao procedimento cirúrgico do grupo falso-operado. Após três horas da infusão bacteriana os animais foram randomizados em: grupo controle não tratado, grupo tratado com solução de Ringer lactato (4mL/kg i.v.); grupo tratado com solução de Ringer lactato (4 mL/kg i.v.) associado a etil-piruvato (50mg/kg) e grupo tratado com solução salina hipertônica (7,5%, 4 mL/kg i.v.). Após 24 horas da bacteremia, as interações leucócito-endotélio foram investigadas por microscopia intravital, e a expressão de P-selectina e da molécula de adesão intercelular (ICAM)-1 determinada por imuno-histoquímica. Leucograma e contagem de plaquetas foram realizadas no início do estudo, 3 horas e 24 horas após a inoculação de E. coli. RESULTADOS: Os grupos não tratado e tratado com solução de Ringer lactato exibiram um aumento no número de leucócitos rollers (~ 2,5 vezes), leucócitos aderidos (~ 3,0 vezes), e de leucócitos migrados (~ 3,5 vezes) comparados ao grupo falso operado. O tratamento com etil-piruvato reduziu o número de leucócitos rollers, aderidos e migrados aos níveis obtidos no grupo falso operado (p > 0,05). Efeitos semelhantes foram observados nos animais tratados com a solução salina hipertônica (p > 0,05). A expressão de P-selectina e de ICAM-1 aumentou significativamente na microcirculação mesentérica no grupo não tratado, comparado ao grupo falso operado (p < 0,001). Todos os tratamentos reduziram a expressão de ambas moléculas de adesão, sendo os grupos tratados com etil-piruvato e solução salina hipertônica mais eficazes. A infusão de bactérias provocou leucopenia significante, seguida por leucocitose com granulocitose, e concomitante redução progressiva no número de plaquetas. CONCLUSÕES: Os dados apresentados sugerem que o etil-piruvato e a solução salina hipertônica (7,5%) eficientemente reduziram a resposta inflamatória na microcirculação mesentérica no presente modelo experimental de sepse induzida por E. coli viva; associada, pelo menos em parte, a menor expressão de moléculas de P-selectina e ICAM-1 / BACKGROUND: Experimental studies on sepsis have demonstrated that ethyl pyruvate is endowed with antioxidant and anti-inflammatory properties. It has been shown that small volumes of hypertonic saline solution (7.5%) improve hemodynamics, the microcirculation, and modulate the immune system. This study aimed to investigate the effects of ethyl pyruvate, hypertonic saline and lactated Ringer\'s solution on mesenteric microcirculation in a sepsis model induced by live Escherichia coli in rats. METHODS: Male Wistar rats were underwent an intravenous suspension of E. coli bacteria or submitted to the sham procedure. After 3h of bacteria infusion rats were randomized into: control, without treatment; treated with lactated Ringer\'s solution (4 mL/kg, i.v.); treated with lactated Ringer\'s solution (4mL/kg, i.v.) plus ethyl pyruvate (50mg/kg), and treated with hypertonic saline solution (7.5%, 4 mL/kg i.v.). At 24h after bacteria infusion leukocyte-endothelial interactions were investigated by intravital microscopy, and the expression of P-selectin and intercellular adhesion molecule (ICAM)- 1 evaluated by immunohistochemistry. White blood cell and platelet counts were determined at baseline, 3h and 24h after E. coli inoculation. RESULTS: Both non-treated and lactated Ringer\'s-treated groups exhibited an increase in the number of rolling leukocytes (~2.5-fold), adherent (~3.0-fold), and migrated cells (~3.5-fold) compared to sham. Treatment with Ringer\'s ethyl pyruvate solution reduced the number of rolling, adherent and migrated leukocytes to the levels attained in the sham group (p > 0.05). Similar effects were observed when animals were treated with hypertonic saline (p > 0.05). The expression of P-selectin and ICAM-1 significantly increased on mesenteric microvessels in non-treated group compared with sham (p < 0.001). All treatments reduced the expression of both adhesion molecules being ethyl pyruvate and hypertonic saline solution more effective than lactated Ringer\'s solution. Infusion of bacteria caused a significant leucopenia (3h), followed by a leucocytosis with granulocytosis (24h). There was an intense and progressive reduction in the number of platelets. No differences were observed after treatment with the different solutions. CONCLUSIONS: Data presented suggest that ethyl pyruvate and hypertonic saline solution (7.5%) efficiently reduce the inflammatory response at mesenteric microcirculation in an experimental model of sepsis induced by live E. coli associated, at least in part, with a down-regulation of P-selectin and ICAM-1