Contrairement aux mammifères, le système nerveux central du poisson téléostéen adulte possède un potentiel énorme de neurogenèse et de régénération après une lésion cérébrale. Chez le poisson zèbre adulte, de nouveaux neurones peuvent être régénérés à partir de progéniteurs constitutifs ou latents. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée aux capacités de régénération neuronale du cerveau moyen dorsal (le toit optique, TO) chez le poisson zèbre. Le TO présente à sa périphérie une zone de progéniteurs de type neuroépithélial à l’origine des neurones et des cellules épendymogliales qui le constituent. J’ai tout d’abord identifié un enhancer potentiel du gène meis2a, qui m’a permis d’effectuer des lignages cellulaires de progéniteurs neuroépithéliaux. En contexte homéostatique, j’ai montré que ces progéniteurs construisent la totalité du TO pendant le développement et soutiennent sa neurogenèse continue pendant la croissance post-embryonnaire. A la suite d’une lésion cérébrale chez la larve et l’adulte, le TO à la capacité de générer de nouveaux neurones, toutefois sa structure topographique n’est pas restaurée. Chez l’adulte, j’ai montré que les progéniteurs constitutifs neuroépithéliaux et des progéniteurs latents épendymogliaux sont activés lors du processus de régénération. / Unlike mammals, the adult teleost brain exhibits widespread neurogenic activity and can regenerate after injury. The adult zebrafish has the capacity to regenerate neurons from constitutive or latent progenitors. During my PhD, I studied the neuronal regeneration in the zebrafish dorsal midbrain (optic tectum, OT). At adult stage, neuroepithelial-like progenitors at the OT periphery contribute to neuronal and glial lineages during homeostasis.I identified a putative enhancer of meis2a, which allowed me to trace the progeny of neuroepithelial-like progenitors. In a non-regenerative context I showed that enhancer-targeted progenitors were at the origin of the whole structure during development and of its continued neurogenesis during post-embryonic growth.Following lesion, OT displayed reactive neurogenesis, at larval and adult stages, nevertheless its topographical structure remained altered. In adults, I showed that both constitutive neuroepithelial-like progenitors and latent ependymoglial progenitors were activated in a regenerative context.

Un tiers de la thèse couvre la conception et le montage d'une expérience de stimulation tactile chez l'humain. En utilisant la microneurographie, nous avons pu enregistrer la réponse neuronale des mécanorécepteurs lorsqu'ils sont stimulés de façon précise et contrôlable. Notre dispositif permet le contrôle de la position, l¿orientation, la vitesse et de la force d'appui de la stimulation via une texture micro-usinée par nos soins. Ainsi les conditions sont réunies pour étudier de façon systématique la transduction de l'information tactile, qui se trouve d¿abord dans la surface à sonder puis passe dans le codage par les neurones du système nerveux. La seconde partie concerne le montage d'un microscope par nappe laser appliqué à l'enregistrement de l'activité neuronale d¿une larve de poisson-zèbre. Le but est de se doter d'un outil permettant d'observer la totalité de la chaîne de transmission de l'information mécano-sensorielle : du récepteur au cerveau. Les poissons sont génétiquement modifiés pour exprimer le rapporteur calcique GCaMP3 dans chacun de leurs neurones. Le microscope à nappe laser, où l'éclairement du spécimen se fait par le côté avec un faisceau laser scanné et l'observation se fait par le dessus selon un axe perpendiculaire au plan d'éclairement, permet d'augmenter à la fois la fréquence de prise d'images et la taille du champ enregistré par rapport aux techniques usuelles (microscope confocal ou 2-photons). Ces gains sont mis à profit pour étudier les corrélations entre les signaux de neurones distribués dans l'ensemble du cerveau de la larve du poisson-zèbre, et mettre directement à jour les sous-réseaux à l'œuvre au cours de l'activité cérébrale.

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative. / Human sensory and autonomic neuropathy type 2 (HSNA2) is a rare human hereditary pathology characterized by an early onset severe sensory loss (for all modalities) in the distal limbs. It is due to autosomal recessive mutations confined to exon HSN2 of the WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1) serine-threonine kinase; the specific exon confers nervous system specificity to target isoform WNK1/HSN2. While this kinase is widely studied in the kidneys, little is known about its role in the nervous system. Due to its role in HSAN type 2, we hypothesized that the truncating mutations present in the HSN2 exon lead to a loss-of-function of the WNK1 kinase, impairing development of the peripheral sensory system. In order to investigate the mechanisms by which the lack of the WNK1/HSN2 isoform acts to cause HSAN type 2, we examined its expression pattern in our zebrafish model and observed strong expression in neuromasts of the peripheral sensory lateral line system. We then knocked down the HSN2 exon in zebrafish embryos using antisense morpholino oligonucleotides. Our three approaches to knockdown the WNK1/HSN2 isoform led to embryos with a defective lateral line. In order to establish a pathogenic pathway involving the WNK1/HSN2 isoform, we investigated the reported interaction between the WNK1 kinase and neuronal potassium chloride co-transporter KCC2. This transporter is a target of WNK1 phosphorylation and also has a known role in promoting neurogenesis. We have also showed its expression in mature neuromasts of the posterior lateral line, and observed an increased expression of KCC2 in WNK1/HSN2 knockdown embryos by semi-quantitative RT-PCR, lending credence to our interaction hypothesis. Furthermore, overexpression of human KCC2 RNA in embryos led to an impaired mechanosensory lateral line system, phenocopying the WNK1/HSN2 knockdown. We then validated these results by obtaining double knockdown embryos, both for WNK1/HSN2 and KCC2, which alleviated the lateral line defect phenotype. These results led us to suggest a pathway in which WNK1/HSN2 is upstream of the KCC2 co-transporter. WNK1 is believed to regulate the level of activation, and possibly level of expression, of KCC2 and we therefore hypothesize that the loss-of-function of the specific isoform causes an imbalance in the levels of activated KCC2. This would then lead to decreased progenitor proliferation and hindered differentiation of neurons, causing the defects associated with HSAN type 2.

L'acide rétinoïque (AR) régule la myogénèse embryonnaire. Dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons d'une part utilisé l'AR pour moduler la myogénèse embryonnaire, dans la perspective d'étudier les conséquences de cette modulation sur le potentiel ultérieur de croissance et identifier les mécanismes moléculaires mobilisés.D'autre part, nous avons étudié la fonction de deux gènes régulés par l'AR et susceptibles de participer au contrôle de la myogénèse embryonnaire.La première partie du travail a été réalisée sur les modèles truite et poisson-zèbre. Nous avons montré que chez la truite comme chez le poisson zèbre, une incubation dans l'AR entrainait une activation de l'expression de Fgf8et de la différenciation des fibres musculaires rapides. Toutefois, chez la truite, nous n'avons pas pu mettre en évidence de régulation des MRF, indiquant qu'une autre voie est utilisée pour activer la myogénèse chez cette espèce.Dans la seconde partie de ce travail, la fonction de deux gènes régulés par l'AR et exprimés dans le mésoderme a été étudiée chez le poisson-zèbre. Le gène vertnin est exprimé essentiellement dans le tailbud. Quand il est inactivé par injection d'un oligo nucléotide morpholino antisens, on observe une altération de la formation des somites (mais pas de modification apparente du processus de segmentation) et une altération de l'intégrité des fibres lentes. Les fibres lentes sont en effet irrégulièrement espacées et les espaces au niveau des myoseptes verticaux peuvent être anormalement larges et les jonctions myotendineuses mal formées. Le gène arrestine β2aest exprimé dans les somites néo-formés puis également dans le mésoderme présomitique et le tailbud. Son inactivation par injection d'OM antisens entraine l'apparition du phénotype U-type et une altération de la morphologie des fibres lentes avec des fibres qui se détachent des jonctions myotendineuses. / Retinoic acid (RA) regulates embryonic myogenesis. During this thesis project, we first used RA to modulate embryonic myogenesis in order to study consequences of this modulation on the future potential for growth and to identify the underlying molecular mechanisms. Second part deals with the characterisation of the function of two genes regulated by the RA which may be involved in the control of embryonic myogenesis.The first part of the work was performed on the trout and zebrafish models. We have shown that in trout as in zebrafish, incubation in RA produced an activation of Fgf8 expression and differentiation of fast muscle fibers.However in trout, we did not observed regulation of MRF expression indicating that an alternative pathway isused to activate myogenesis in this species.In the second part of this work, the function of two genes regulated by the RA and expressed in the mesodermwas studied in zebrafish. The vertnin gene is expressed primarily in the tailbud. When it is inactivated by injection of antisense morpholino oligonucleotide, there is an alteration in the somites morphogenesis (but no apparent change in the process of segmentation) and impairment of the integrity of the slow muscle fibers. Slowfibers are indeed irregularly spaced and the vertical myosepta can be abnormally large. In addition myotendinous junctions display some abnormal branches. The arrestin β 2a gene is expressed in last formed somites and then also in the presomitic mesoderm and the tailbud. Its inactivation by injection of antisense MO leads to the appearance of the U-type phenotype and alteration of the slow muscle fibers morphology which detach frommyotendinous junctions

Nous présentons dans ce manuscrit une technique d’imagerie basée sur l’holographie numérique. Elle permet d’imager en 3D et dans le temps la circulation sanguine chez une larve de poisson-zèbre. L’information 3D est acquise en une seule image de la caméra, ce qui permet de suivre le mouvement des globules rouges dans le système vasculaire. Nous évoquerons dans un premier temps les techniques de bio-imagerie et d’imagerie du flux sanguin traditionnelles, puis nous rappellerons les principes de l’holographie. Ensuite, nous décrirons la méthode d’imagerie que nous avons développée et les résultats expérimentaux obtenus. Nous compléterons, en présentant les différentes améliorations que nous avons apportées à la technique. Enfin, nous discuterons brièvement de l’application du compressed sensing à l’imagerie de la circulation sanguine dans le poisson-zèbre. / In this manuscript, we present an imaging technique based on digital holography.It enables to image in 3D and in time the blood circulation in a zebrafish larva. The 3D information is acquired in a single frame of the camera, which makes possible to track the movement of red blood cells in the vascular system. We will first discuss the traditional techniques of bio and blood flow imaging, then we will remind the principles of holography. Afterwards, we will describe the imaging method we developed and the experimental results obtained. We will then present the improvements that have been made to the technique. Finally, we will briefly discuss the application of the compressed sensing to the blood flow imaging in zebrafish.

La formation d'un organe repose sur la coordination spatio-temporelle du positionnement et de la différenciation de progéniteurs. La finalité de ces évènements permet la constitution structurelle de l'organe et la production de la diversité cellulaire nécessaire pour assurer ses fonctions. L'épithélium olfactif de l'embryon de poisson-zèbre est issu de la migration de progéniteurs qui vont générer entre autres les neurones olfactifs. Au cours de ma thèse je me suis intéressé aux bases génétiques et moléculaires de la coordination de la morphogenèse et de la neurogenèse de cet épithélium tout en étudiant l'origine de la diversité des types cellulaires olfactifs. L'imagerie en temps réel m'a permis de caractériser la migration de ces progéniteurs en générant une carte morphométrique de leur déplacement. Mon travail de thèse révèle que le proneural Neurog1 régule directement l'expression de cxcr4b, un récepteur au chimiokine, dans les progéniteurs olfactifs assurant leur positionnement. Ainsi, Neurog1 coordonnerait la position et l'identité des progéniteurs olfactifs via ses cibles transcriptionnelles. Au sein de l'épithélium olfactif dans l'embryon, deux populations cellulaires (neurones à GnRH et neurones à microvillosités) ont été décrites comme provenant des crêtes neurales céphaliques (CNC). J'ai pu montrer que l'expression de marqueurs spécifiques de ces populations n'est pas affectée dans un contexte d'absence de différenciation des CNCs (sox10-/-) suggérant que ces types cellulaires ne dérivent pas de ce territoire. Afin d'identifier leur territoire d'origine, j'ai développé une méthode d'imagerie en temps réel, le backtracking, qui m'a permis de déterminer que la région de la placode olfactive, et non les crêtes neurales, génère ces deux types cellulaires. Ainsi j'ai pu définir la source de ces deux populations neuronales tout en minimisant la contribution des crêtes neurales. En conclusion mes résultats suggèrent que la diversité des neurones olfactifs serait produite localement et ceci conjointement à la morphogenèse de l'épithélium. / The correct development of sensory organs relies on the coordination between changes in progenitor positioning over time and the differentiation/specification of different neural subtypes. The outcome of this coordination is proper organ shape and cell diversity, which are required for functionality. The zebrafish embryonic olfactory epithelium arises from progenitor migration and differentiation. During my PhD, I studied the genetic and molecular basis of morphogenesis in this tissue, and how this is coordinated with neurogenesis, as well as revisiting the origin of olfactory cell type diversity.First, I generated a morphometric map of olfactory progenitors through the characterization of their migration in live embryos. Next, I showed that the proneural transcription factor Neurog1 directly regulates cxcr4b expression, a chemokine receptor that has already been shown to govern olfactory progenitor positioning. Thus, Neurog1 orchestrates olfactory progenitor position and the generation of olfactory neurons via distinct transcriptional targets. Secondly, I addressed the origin of olfactory neuron diversity. Within the embryonic olfactory epithelium, two cell populations (GnRH neurons and microvillous neurons) have been described as cephalic neural crest (CNC) derivatives. I found, however, that the expression of specific markers of both populations is unaffected in a genetic context blocking CNC differentiation. To revisit the lineage assignment of these cell types, I developed a backtracking approach through time-lapse live imaging. I found that both populations are derived from classical olfactory placode progenitor and not the CNC. In conclusion, my results indicate that heterogeneity of olfactory cell-types is locally generated, and concomitant with morphogenesis of the placode.

Lors du développement de l'asymétrie gauche droite dans le cerveau du poisson zèbre, un petit groupe de cellules, le parapinéale, migre collectivement depuis la ligne médiane vers la partie gauche de l'épithalamus. Cette migration est défectueuse dans des mutants pour le gène fgf8, indiquant que le facteur Fgf8 (Fibroblast Growth Factor 8), sécrété de part et d'autre de la ligne médiane, est requis pour la migration. Cependant, l'orientation gauche de la migration dépend de l'activation, plus précocement dans l'épithalamus gauche, de la voie de signalisation Nodal/TGFb (Transforming Growth Factor). Par conséquent, la parapinéale est un modèle de choix pour comprendre comment les cellules migrent collectivement en réponse aux Fgf et pour étudier comment d'autres voies de signalisation modulent ce processus. L'imagerie en temps réel d'un transgène rapporteur de la signalisation FGF a révélé que la voie FGF est activée préférentiellement dans quelques cellules de tête, c'est à dire localisées au front de migration. L'expression globale d'un récepteur aux Fgf activé de façon constitutive (CA-FgfR1) interfère avec la migration de la parapinéale en contexte sauvage mais est capable de restaurer à la fois la migration de la parapinéale et l'activation focale de la voie FGF au front de migration dans les mutants fgf8-/-. De plus, l'activation focale de la voie FGF dans seulement quelques cellules de parapinéale est suffisante pour restaurer la migration de tout le collectif dans les mutants fgf8-/-. Finalement, nos données montrent que la signalisation Nodal contribue à restreindre et à biaiser l'activation de la voie FGF afin d'orienter la migration de la parapinéale vers le côté gauche (Manuscript n°1). Par la suite, mes travaux de thèse ont visé à comprendre comment l'activation de la voie FGF est restreinte à quelques cellules, bien que toutes les cellules de parapinéale semblent compétentes pour activer la voie. Nos résultats montrent que la signalisation Notch est capable de restreindre l'activation de la voie FGF. La perte ou le gain de fonction de la voie Notch entrainent respectivement une augmentation ou une diminution de l'activité FGF, associés à des défauts de migration de la parapinéale dans les deux contextes. De plus, la diminution ou l'augmentation artificielle du niveau d'activation de la voie FGF peut respectivement restaurer la migration de la parapinéale ou aggraver les défauts de migration en absence d'activité Notch. Nos données indiquent que la signalisation Notch restreint l'activation de la voie FGF au sein des cellules de parapinéale pour permettre la migration du collectif (Manuscript n°2). La voie Notch est également requise pour la spécification d'un nombre correct de cellules de parapinéale, indépendamment de la voie FGF. En parallèle, nous avons analysé la fonction de MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), une protéine exprimée mosaïquement dans la parapinéale et candidate pour moduler la signalisation FGF. Cependant, nous n'avons observé aucun défaut de spécification ou de migration de la parapinéale dans les embryons mutants pour le gène mmp2 -/- (Manuscript n°3). Mon travail de thèse révèle un rôle de la voie Notch pour restreindre l'activation de la signalisation FGF dans quelques cellules de parapinéale, un processus qui est biaisé par la voie Nodal afin d'orienter la migration du collectif vers la gauche. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre les interactions entre les voies de signalisation FGF, Notch et Nodal dans d'autres modèles de migration cellulaire collective comme, par exemple, la migration des cellules cancéreuses. / During the establishment of left-right asymmetry in the zebrafish brain, a small group of cells, the parapineal, collectively migrates from the dorsal midline of the epithalamus to the left in most wild-type embryos. Parapineal migration requires Fibroblastic Growth Factor 8 (Fgf8), a secreted signal expressed bilaterally in epithalamic tissues surrounding the parapineal. The left bias in the orientation of parapineal migration depends on the activity of Cyclops, a secreted factor of the Nodal/TGFß family that is transiently expressed in the left epithalamus prior to parapineal migration. Therefore, the parapineal provides a powerful new model to understand FGF dependent collective cell migration and to study how other signaling pathways modulate this process. Live imaging of an FGF reporter transgene revealed that the FGF pathway is activated in only few parapineal cells that are usually located at the leading edge of migration. Global expression of a constitutively activated Fgf receptor (CA-FGFR) delays migration in wild-type, while it partially restores both parapineal migration and focal activation of the FGF reporter transgene in fgf8-/- mutant embryos. Importantly, focal activation of FGF signaling in few parapineal cells is sufficient to restore collective migration in fgf8-/- mutants. Finally, Nodal asymmetry contributes to restrict and left-bias the activation of the FGF pathway (Manuscript n°1). Following this work, my thesis project aimed at understanding how the activation of the FGF pathway is restricted to few cells, despite all parapineal cells apparently being competent to activate the pathway. We showed that Notch signaling is able to restrict FGF activity. Loss or gain of function of the Notch pathway respectively triggers an increase or decrease in FGF activity, which correlate with PP migration defects. Moreover, decreasing or increasing FGF activity levels respectively rescues or aggravates parapineal migration defects in Notch loss-of-function context. Our data indicate that Notch signaling restricts the activation of the FGF pathway within parapineal cells to promote their collective migration (Manuscript n°2). We also found that Notch pathway is required for the specification of a correct number of parapineal cells, independently of FGF pathway. In parallel, we analysed the function of MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), a protein mosaïcally expressed in the parapineal and a candidate to modulate FGF signaling. However, we found no significant defects in the specification or migration of parapineal cells in mmp2-/- mutant embryos (Manuscript n°3). My PhD work reveals a role for Notch signaling in restricting the activation of FGF signaling within few parapineal cells, a process that is biased by Nodal pathway to the left and required for the migration of the entire parapineal. These data provide insights into the interaction of FGF, Notch and Nodal/TGFb signaling pathways that may be applicable to other models of collective cell migration, such as cancer cells migration for instance.

Depuis quelques années, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle de choix pour l'étude du système nerveux et de ses fonctions. Récemment, des technologies nouvelles d'édition du génome permettent la génération d'allèles mutés de manière constitutionnelle et l'étude fonctionnelle de gènes chez ce modèle vertébré. Néanmoins, certains loci nécessite une inactivation spatiotemporelle précise et contrôlée. La première partie de ma thèse décrit la mise au point d'une nouvelle stratégie de disruption génétique de manière tissu-spécifique, basée sur la technologie du CRISPR/Cas9 et du système UAS/Gal4. Cette technique permet l'introduction de mutations somatiques dans des tissus, des clones ou des cellules individuelles préalablement génétiquement marqués, rendant ainsi possible le suivi in vivo de l'effet de la mutation générée grâce au gène rapporteur. La seconde partie de ma thèse se centre sur l'étude fonctionnelle d'une famille des gènes, les meteorines, durant le développement du système nerveux et lors du ciblage axonale chez le poisson zèbre. Les Meteorines sont des protéines conservées chez les vertébrés qui ont été impliquées dans la prolifération, la différentiation des progéniteurs de neurones et notamment dans l'élongation axonale in vitro. Nous avons pu mettre en évidence que les meteorines sont exprimées le long de la ligne médiane du système nerveux chez les larves et au niveau du plancher de la partie postérieure du cerveau et de la moelle épinière. Par l'utilisation du CRISPR/Cas9, nous avons généré des lignées mutantes pour chaque gène meteorine et avons ainsi procédé à l'analyse de l'établissement des projections axonales dans ces lignées mutantes. / In recent years, the zebrafish (Danio rerio) has emerged as a powerful model organism to study neuronal circuit development and function. To date, different genome editing technologies allow the generation of constitutive mutant alleles, permitting the study of gene loss-of-function in this vertebrate model. Nevertheless, to assess the role of certain loci it might be required a precise spatiotemporal control of gene inactivation. The rst part of my thesis describes a novel strategy for tissue-specific gene disruption based on the CRISPR/Cas9 and the Gal4/UAS systems. The described technique allows the induction of somatic mutations in genetically labeled tissues, cell clones or single cells, making it possible to follow the effect of gene disruption in vivo via reporter gene expression. The second part of the thesis focuses on the functional analysis of the role of the meteorin gene family during neuronal development and axonal targeting in zebra sh. Meteorin family is conserved among vertebrates and its members have been shown to be involved in neuronal progenitor proliferation and differentiation and axonal elongation, in vitro. We used the zebrafish nervous system as a model to dissect the role of Meteorins during embryonic development, focusing on their potential role as novel guidance molecules. Interestingly, we found that genes belonging to the meteorin family are expressed along the midline of the larval central nervous system and at the floor plate in the hindbrain and spinal cord. We generated CRISPR/Cas9 mutant lines carrying out-of-frame deletions in the coding sequence of each member of the zebrafish meteorin family and we performed a comprehensive analysis of the establishment of axonal projections in the mutants. Our data pointed out that metrns loss-of-function affects the earliest process of axonal development, demonstrating a crucial role in the process of axonal outgrowth for this new family of evolutionary conserved guidance molecules.

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s'associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n'est pas connue. C'est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d'en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l'embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L'absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s'opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l'injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires.

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative. / Human sensory and autonomic neuropathy type 2 (HSNA2) is a rare human hereditary pathology characterized by an early onset severe sensory loss (for all modalities) in the distal limbs. It is due to autosomal recessive mutations confined to exon HSN2 of the WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1) serine-threonine kinase; the specific exon confers nervous system specificity to target isoform WNK1/HSN2. While this kinase is widely studied in the kidneys, little is known about its role in the nervous system. Due to its role in HSAN type 2, we hypothesized that the truncating mutations present in the HSN2 exon lead to a loss-of-function of the WNK1 kinase, impairing development of the peripheral sensory system. In order to investigate the mechanisms by which the lack of the WNK1/HSN2 isoform acts to cause HSAN type 2, we examined its expression pattern in our zebrafish model and observed strong expression in neuromasts of the peripheral sensory lateral line system. We then knocked down the HSN2 exon in zebrafish embryos using antisense morpholino oligonucleotides. Our three approaches to knockdown the WNK1/HSN2 isoform led to embryos with a defective lateral line. In order to establish a pathogenic pathway involving the WNK1/HSN2 isoform, we investigated the reported interaction between the WNK1 kinase and neuronal potassium chloride co-transporter KCC2. This transporter is a target of WNK1 phosphorylation and also has a known role in promoting neurogenesis. We have also showed its expression in mature neuromasts of the posterior lateral line, and observed an increased expression of KCC2 in WNK1/HSN2 knockdown embryos by semi-quantitative RT-PCR, lending credence to our interaction hypothesis. Furthermore, overexpression of human KCC2 RNA in embryos led to an impaired mechanosensory lateral line system, phenocopying the WNK1/HSN2 knockdown. We then validated these results by obtaining double knockdown embryos, both for WNK1/HSN2 and KCC2, which alleviated the lateral line defect phenotype. These results led us to suggest a pathway in which WNK1/HSN2 is upstream of the KCC2 co-transporter. WNK1 is believed to regulate the level of activation, and possibly level of expression, of KCC2 and we therefore hypothesize that the loss-of-function of the specific isoform causes an imbalance in the levels of activated KCC2. This would then lead to decreased progenitor proliferation and hindered differentiation of neurons, causing the defects associated with HSAN type 2.