A bactéria Escherichia coli é encontrada em diversos habitats e deve estar preparada para sobreviver e crescer em condições desfavoráveis. A adaptação da bactéria a diferentes condições obriga-a a controlar a expressão de genes de forma eficiente. Uma das formas primárias de controle de expressão gênica é a competição entre os diversos fatores sigma pela ligação ao cerne da RNA polimerase. <font face=\"Symbol\">d70 é o fator sigma mais abundante e participa da transcrição da maioria dos genes de E. coli, enquanto que <font face=\"Symbol\">dS é o segundo em importância e reconhece promotores de genes relacionados à resposta geral ao estresse. O gene rpoS, que codifica para <font face=\"Symbol\">dS é altamente polimórfico, e adquiri mutações frequentemente. A mutação pontual C<font face=\"Symbol\">&#174;T na posição 97 da ORF de rpoS, resulta em um códon de parada TAG (âmbar). Um Shine-Dalgarno alternativo e um códon de início de tradução na posição 157 dá início a uma proteína RpoS truncada, que é parcialmente funcional. Uma das situações de estresse na qual <font face=\"Symbol\">dS é ativado corresponde à privação de fosfato inorgânico. Porém, na limitação deste nutriente ocorre também a ativação do regulon PHO, cujos genes são predominantemente transcritos por <font face=\"Symbol\">d70. Neste trabalho, o efeito da versão truncada de RpoS sobre a expressão de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">d70 (lacZ, phoA e pstS) e de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">dS (osmY e proU) foi testado. Foram também realizados ensaios de estresse oxidativo, osmótico e pelo frio. O perfil de atividade parcial descrito para RpoSam pôde ser observado em alguns casos, porém em outros o comportamento deste alelo se assemelhou ao do mutante rpoS nulo. Paralelamente, foi testada também uma cepa de E. coli que carrega a mutação âmbar em rpoS, mas esta é suprimida, resultando na expressão de uma proteína RpoS normal. A proteína RpoS truncada não pôde ser visualizada em immunoblots, provavelmente porque esta é traduzida de forma pouco eficiente a partir do Shine-Dalgarno alternativo. Com o objetivo de incrementar a detecção de RpoS em ensaios de imuno-detecção, foi inserida por recombinação alélica uma etiqueta SPA altamente imunogênica na porção C-terminal da proteína. / Escherichia coli can be found in many different habitats and has to be prepared to survive and grow under unfavorable conditions. Bacteria adaptation to different growth conditions requires an efficient control of gene expression. One of the primary forms of gene expression control is the competition between different sigma factors for the binding to the core RNA polymerase. <font face=\"Symbol\">d70 is the most abundant sigma factor and participates in the transcription of most E. coli genes. <font face=\"Symbol\">dS is the second one in importance and recognizes promoters of genes related to the general stress response. The rpoS gene, which encodes <font face=\"Symbol\">dS, is highly polymorphic and acquires mutations very often. The transition C<font face=\"Symbol\">&#174;T at position 97 in the rpoS ORF results in a stop codon TAG (amber). Due to the presence of an alternative Shine-Dalgarno and a translation initiation codon at position 157 a truncated RpoS protein that is partially functional is translated. One of the stress situations that <font face=\"Symbol\">dS is activated is the starvation for inorganic phosphate. Phosphate limitation also triggers the activation of the PHO regulon, whose genes are predominantly transcribed by <font face=\"Symbol\">d70. In the present study, the effect of the truncated version of RpoS on the expression of <font face=\"Symbol\">d70 dependent genes (lacZ, phoA e pstS) and <font face=\"Symbol\">dS dependent genes (osmY e proU) was tested. Bacteria were also assayed for sensitivity to oxidative, osmotic and cold stress. The profile of partial activity described for the truncated RpoS could be observed in some cases, while in others the behavior of this allele resembled the rpoS null mutant. In parallel, an E. coli strain which suppresses the amber mutation in RpoS, resulting in the expression of a normal protein was also tested. A band correponding to the truncated RpoS could not be detected in immunoblots probably due to inefficient translation from the alternative Shine-Dalgarno. To improve the detection of RpoS, a highly immunogenic SPA tag was inserted in the C-terminal region of the protein.

A bactéria Escherichia coli é encontrada em diversos habitats e deve estar preparada para sobreviver e crescer em condições desfavoráveis. A adaptação da bactéria a diferentes condições obriga-a a controlar a expressão de genes de forma eficiente. Uma das formas primárias de controle de expressão gênica é a competição entre os diversos fatores sigma pela ligação ao cerne da RNA polimerase. <font face=\"Symbol\">d70 é o fator sigma mais abundante e participa da transcrição da maioria dos genes de E. coli, enquanto que <font face=\"Symbol\">dS é o segundo em importância e reconhece promotores de genes relacionados à resposta geral ao estresse. O gene rpoS, que codifica para <font face=\"Symbol\">dS é altamente polimórfico, e adquiri mutações frequentemente. A mutação pontual C<font face=\"Symbol\">&#174;T na posição 97 da ORF de rpoS, resulta em um códon de parada TAG (âmbar). Um Shine-Dalgarno alternativo e um códon de início de tradução na posição 157 dá início a uma proteína RpoS truncada, que é parcialmente funcional. Uma das situações de estresse na qual <font face=\"Symbol\">dS é ativado corresponde à privação de fosfato inorgânico. Porém, na limitação deste nutriente ocorre também a ativação do regulon PHO, cujos genes são predominantemente transcritos por <font face=\"Symbol\">d70. Neste trabalho, o efeito da versão truncada de RpoS sobre a expressão de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">d70 (lacZ, phoA e pstS) e de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">dS (osmY e proU) foi testado. Foram também realizados ensaios de estresse oxidativo, osmótico e pelo frio. O perfil de atividade parcial descrito para RpoSam pôde ser observado em alguns casos, porém em outros o comportamento deste alelo se assemelhou ao do mutante rpoS nulo. Paralelamente, foi testada também uma cepa de E. coli que carrega a mutação âmbar em rpoS, mas esta é suprimida, resultando na expressão de uma proteína RpoS normal. A proteína RpoS truncada não pôde ser visualizada em immunoblots, provavelmente porque esta é traduzida de forma pouco eficiente a partir do Shine-Dalgarno alternativo. Com o objetivo de incrementar a detecção de RpoS em ensaios de imuno-detecção, foi inserida por recombinação alélica uma etiqueta SPA altamente imunogênica na porção C-terminal da proteína. / Escherichia coli can be found in many different habitats and has to be prepared to survive and grow under unfavorable conditions. Bacteria adaptation to different growth conditions requires an efficient control of gene expression. One of the primary forms of gene expression control is the competition between different sigma factors for the binding to the core RNA polymerase. <font face=\"Symbol\">d70 is the most abundant sigma factor and participates in the transcription of most E. coli genes. <font face=\"Symbol\">dS is the second one in importance and recognizes promoters of genes related to the general stress response. The rpoS gene, which encodes <font face=\"Symbol\">dS, is highly polymorphic and acquires mutations very often. The transition C<font face=\"Symbol\">&#174;T at position 97 in the rpoS ORF results in a stop codon TAG (amber). Due to the presence of an alternative Shine-Dalgarno and a translation initiation codon at position 157 a truncated RpoS protein that is partially functional is translated. One of the stress situations that <font face=\"Symbol\">dS is activated is the starvation for inorganic phosphate. Phosphate limitation also triggers the activation of the PHO regulon, whose genes are predominantly transcribed by <font face=\"Symbol\">d70. In the present study, the effect of the truncated version of RpoS on the expression of <font face=\"Symbol\">d70 dependent genes (lacZ, phoA e pstS) and <font face=\"Symbol\">dS dependent genes (osmY e proU) was tested. Bacteria were also assayed for sensitivity to oxidative, osmotic and cold stress. The profile of partial activity described for the truncated RpoS could be observed in some cases, while in others the behavior of this allele resembled the rpoS null mutant. In parallel, an E. coli strain which suppresses the amber mutation in RpoS, resulting in the expression of a normal protein was also tested. A band correponding to the truncated RpoS could not be detected in immunoblots probably due to inefficient translation from the alternative Shine-Dalgarno. To improve the detection of RpoS, a highly immunogenic SPA tag was inserted in the C-terminal region of the protein.

Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl &#946; - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.

Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl &#946; - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.