Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-12-10T12:32:54Z No. of bitstreams: 1 iaralice-souza.pdf: 1338553 bytes, checksum: 59fa26df56bce23aa1b5861c460f716f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-10T12:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 iaralice-souza.pdf: 1338553 bytes, checksum: 59fa26df56bce23aa1b5861c460f716f (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Neisseria meningitidisdo grupo C é uma bactéria encapsulada causadora dediversas doenças, está associada à altas taxas de mortalidade e portanto é de grande importância para a saúde pública. Bio-Manguinhos está desenvolvendo uma vacina conjugada formada pela ligação covalente do polissacarídeo capsular àanatoxina tetânica e esta vacina, atualmente, está sendo avaliada em estudos clínicosde Fase II em crianças de 1 a 9 anos. A quantificação de componentes livres como polissacarídeos e proteínas faz parte do controle de processo de vacinas conjugadas e tem o objetivo de evitar o aparecimento de reações adversas exacerbadas e/ou redução da imunogenicidade do componente vacinal. A Organização Mundial de Saúde preconiza níveis máximos de proteína livre no conjugado vacinal de 5%, mas não estabelece um limite máximo para o polissacarídeo livre para a vacina conjugada contra o grupo C. Desta forma, o objetivo deste estudo foi desenvolver e validar métodos de controle de qualidade adequados para separar e quantificar estes componentes livres presentes na vacina meningocócica C conjugada brasileira, utilizando a técnica de eletroforese capilar (EC). Para a separação da proteína livre foram comparados os modos de eletroforese capilar de zona livre (CZE) e cromatografia eletrocinética micelar (MEKC). Diferentes condições de migração da amostravariando-se parâmetros como pH, temperatura, tensão, concentração do tampão, ciclodextrinas e de surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) foram estudadas. Os resultados demonstraram que a melhor separação do conjugado foi obtida por MEKC utilizando tampão tetraborato de sódio (TBNa) 150 mM, 25 mM de SDS, 60°C, 30 kV e pH 9,3. Entretanto, nos modos de EC estudados não foi possível obter a separação completa dos componentes, sendo necessária a utilização de outro processo. Por outro lado, por CZE foi possível observar a separação da proteína ativada da nativa, demonstrando a necessidade de otimização da reação de ativação da proteína, a fim de aumentar orendimento da reação de conjugação. A separação completa do açúcar livre presente no conjugado foi obtida empregando CZE utilizando tampão TBNa 50 mM, 40°C, 30 kV e pH 10. Com as condições escolhidas foi possível determinar o conteúdo de polissacarídeo livre nos lotes de conjugado e validar o método proposto, que se mostrou linear na faixa de 0,047 a 0,164 mg/mL, apresentou efeito matriz, 0,0154 mg/mL de limite de detecção e 0,0454mg/mL de limite de quantificação. Após as etapas de validação, foram quantificados alguns lotes de conjugado e observou-se um alto teor de açúcar livre nos lotes com longo período de estocagem a 4°C. Desse modo, fez-se a avaliação de um lote recentemente produzido e obteve-se o valor de 19,08% de polissacarídeo livre. A fim de estimar o tempo de estocagem máximo do conjugado foram realizadas análises com 30, 60 e 90 dias de estocagem a 4°C. Os valores encontrados até 60 dias não foram significativamente diferentes dosdeterminados no tempo zero. No entanto, com 90 dias de estocagem ocorreu uma modificação do perfil do conjugado que impossibilitou a sua quantificação. A metodologia desenvolvida e validada será introduzida no controle de qualidade do lote de conjugado que será submetido aos estudos clínicos de Fase III e na rotina da vacina conjugada estudada. Além disto, o conhecimento adquirido poderá ser empregado no controle de qualidade de outras vacinas conjugadas contra bactérias encapsuladas de interesse epidemiológico no país. / Neisseria meningitidisgroup C is an encapsulated bacterium that causes several diseases and is associated with high mortality rates becoming a serious public health problem. Bio-Manguinhos is developing a conjugate vaccine constituted by covalent attachment of capsular polysaccharide to tetanus toxoid, which iscurrently being evaluated in Phase II clinical studies in children between 1-9 years. Free components quantification is a vaccine process control assay and intended to prevent exacerbated adverse reactions occurrence and/or vaccine immunogenicity reduction. The World Health Organization recommends 5% of free protein maximum level in the conjugate vaccine, but does not set a limit for the free polysaccharide contents. Thus, the aim of this study was to develop and validate quality control methods appropriate to separate and quantify free components present in the conjugate vaccine against N. meningitidisgroup C, using capillary electrophoresis (CE) technique. For free protein separation, free capillary zone electrophoresis (CZE) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were compared and different sample migration conditions were studied by varying parameters such as pH, temperature, voltage, buffer concentration, cyclodextrin and surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS). The results showed that the best separation was obtained by MEKC using sodium tetraborate buffer (TBNA) 150 mM, 25 mM SDS, 60°C, 30 kV and pH 9.3. H owever, the CE did not induce a complete separation of the components suggesting that other techniques should be necessary. On the other hand, native and activated protein separation was possible using CZE, demonstrating the necessity of optimize protein activation reaction in order to increase the conjugation reaction yield. The total free sugar conjugate was completely separated from the conjugate by CZE using 50 mM TBNA buffer, 40°C, 30 kV and pH 10. In these conditions it was possible to determine the free polysaccharide content and validate the proposed method, which was linear in 0.047 to 0.164 mg/mL range, showed a matrix effect, 0.0154 mg/mL of detection limit and 0.0454 mg/mL ofquantification limit.After the validation steps, some conjugate batches were quantified and high levels of free sugar were observed in batches storaged at 4°C for long periods. On the other hand a conjugate batch recently produced was evaluated and showed19.08% of free polysaccharide. In order to estimate the maximum storage time a conjugate batch was analyzed30, 60 and 90 days after the production steps. The values found up to 60 days were not significantly different from that one determined at the initial time. However, with 90 days of storage there was a change in the conjugate profile that impaired its quantification. The methodology developed and validated will be used to evaluate the conjugate batch that will be submitted to Phase III clinical studies and in the routine quality controlof the conjugate vaccine. Moreover, the acquiredknowledge could be used in quality control of other conjugate vaccines against encapsulated bacteria of epidemiological importancein the country.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Cristina_Simoes_da_Costa.pdf: 676580 bytes, checksum: 3d29b81ccb9b1d19211d238ccd303fe3 (MD5) Previous issue date: 2009-07-30 / Strawberry is a highly perishable fruit, presenting a post-harvest shelf life relatively short due to physiologic changes and incidence of fungal decay, which limitate its fresh commercialization. Chitosan based edible coating are a good alternative on controlling post harvest changes associated do strawberry decay. This work was divided in two experiments. In first article, the application of chitosan edible coatings added of calcium and fat acid to promote preservation of the quality of strawberry cv. Aromas during refrigerated storage. Three coatings were studied: chitosan + calcium chloridre (QC), . chitosan + calcium chloride + oleic acid (QCAO), and chitosan + calcium chloride + stearic acid (QCAE). After coatings were applied, the fruits were stored at + 2°C e 75 ± 5%HR for 10 days. Firmness, pH, titratable acidity, content of soluble solids and, color weren t affected significantly at the end of storage, and no differences between treatment were observed. Coating affected significantly fungal decay on QC coated fruits when compared to non coated fruits, promoting 83%. Fruits that received QC or QCAE coating obtained same acceptability of control fruits. In the second article, the ability of chitosan edible coating, added of calcium and/or ascorbic acid to maintain strawberry post-harvest quality under refrigerated (0°C) and atmospheric (25ºC) storage was evaluated. Four coatings were studied: chitosan (Q); chitosan + calcium chloridre (QC), chitosan + ascorbic acid (QA), and chitosan + calcium chloride + ascorbic acid (QCA). After coatings were applied, the fruits were stored for 15 days at 0 + 2°C e 75 ± 5%HR (refrigerated) and for 7 days at 25ºC + 2ºC (atmospheric). Firmness, pH, titratable acidity, content of soluble solids and, color weren t affected significantly at the end of storage, and no differences between treatment were observed. On refrigerated condition, chitosan coatings promoted the maintenance of titrable acidity, reduction of loss of firmness and of fungal decay, which was completely inhibited on the fruits covered with QA and QC until the twelve day. Soluble solids content, pH, color (L*, C*, h*), anthocyanins content and phenolic compounds content weren´t affected by coating. On the strawberry stored under atmospheric temperature, coatings promoted retention of firmness and controlled fungal decay, showing no effects on the other attributes evaluated. In general, post-harvest application of chitosan based edible coatings preserve strawberry quality during storage. Incorporation of ascorbic acid or calcium chloride on coating promotes additional gain on the control of fungal decay, being observed a higher acceptability of coatings containing ascorbic acid. The employ of this coating can extend the shelf life of refrigerated or atmospheric stored strawberry until 12 and 3 days, respectively. / O morango é um fruto altamente perecível, apresentando período de conservação pós-colheita relativamente curto em virtude de alterações fisiológicas e incidência de podridão fúngica, o que limita sua comercialização in natura. As coberturas comestíves à base de quitosana tem-se mostrado como alternativas no controle das alterações pós-colheita responsáveis pela deterioração do morango. Este trabalho foi dividido em dois ensaios experimentais. No primeiro artigo, avaliou-se a aplicação de coberturas comestíveis à base de quitosana contendo cálcio e ácidos graxos para promover a manutenção da qualidade pós-colheita de morangos cv. Aromas durante o armazenamento refrigerado. Três coberturas foram estudadas: quitosana + cloreto de cálcio (QC); quitosana + cloreto de cálcio + ácido oléico (QCAO); quitosana + cloreto de cálcio + ácido esteárico (QCAE). Após aplicação das coberturas, os frutos foram mantidos por 10 dias sob condições de 0+2°C e 75+5%UR. A firmeza, o pH, a acidez titulável, o conteúdo de sólidos solúveis e a cor não apresentaram variação significativa ao final do armazenamento, não sendo verificada diferença entre os tratamentos quando comparados ao controle. A cobertura apresentou efeito significativo na redução da podridão fúngica dos frutos cobertos com QC, verificando-se uma redução de 83%. Os frutos que receberam as coberturas QC ou QCAE apresentaram mesma aceitação que os frutos controle. No segundo artigo, avaliou-se o efeito de coberturas comestíveis à base de quitosana, combinada ou não com cálcio e ácido ascórbico, na manutenção da qualidade pós-colheita de morangos durante o armazenamento refrigerado (0°C) e sob temperatura ambiente (25°C). Quatro coberturas foram estudadas: quitosana (Q); quitosana + cloreto de cálcio (QC); quitosana + ácido ascórbico (QA) e quitosana + cloreto de cálcio + ácido ascórbico (QCA). Após aplicação das coberturas, os frutos foram mantidos por 15 dias, a 0+2°C e 75+5%UR (refrigerado) e à 25°C + 2ºC (ambiente) durante 7 dias. Nas amostras refrigeradas, a utilização de coberturas promoveu manutenção da Lacidez titulável, redução de perda de firmeza e do desenvolvimento fúngico, sendo este completamente inibido nos frutos cobertos com QA e QC até o décimo segundo dia de armazenamento. O pH, o conteúdo de sólidos solúveis, a cor (L*, C* e h*), o conteúdo de antocianinas e o de compostos fenólicos não sofreram influência da aplicação da cobertura. Nos frutos armazenados à temperatura ambiente, foi verificado o efeito da cobertura na manutenção da firmeza, e no controle do desenvolvimento fúngico, não sendo observado efeito sobre a perda de massa e demais parâmetros estudados. De forma geral, pode-se concluir que a aplicação pós-colheita de coberturas à base de quitosana em morangos preserva sua qualidade durante o armazenamento. A incorporação de ácido ascórbico ou cloreto de cálcio na cobertura possibilita ganho adicional no controle do desenvolvimento fúngico, obtendo-se maior aceitação para as coberturas contendo ácido ascórbico. O uso dessa cobertura permite estender a vida útil de morangos armazenados sob refrigeração e à temperatura ambiente, por até doze e três dias, respectivamente.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada causadora de doenças infecciosas como pneumonia, bacteremia e meningite, infecções essas que estão entre as principais causas de morte entre crianças, idosos e imunodeprimidos, indivíduos que constituem o grupo de risco para tais infecções. A vacinação tem sido a mais eficaz forma de conter tais infecções. A vantagem das vacinas conjugadas em comparação às polissacarídicas é a capacidade de indução de uma resposta imune T-dependente o que garante proteção mesmo ao grupo de risco para infecções por S. pneumonia. A proposta do projeto foi estabelecer um protocolo para obtenção de um conjugado constituído pelo polissacarídeo capsular de S. pneumonia sorotipo 1 (PS1) e pela proteína de superfície pneumocócica A (PspA). A síntese do conjugado empregou uma metodologia inédita para o sorotipo 1. A avaliação da resposta imune humoral induzida pelo conjugado mostrou a indução de IgG anti-PS1 gerada pelas imunizações com o conjugado PS1-PspA. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacteria causing infectious diseases such as pneumonia, bacteremia and meningitis, these infections are among the leading causes of death among children, elderly and immunocompromised, who constituting individuals of risk group. The vaccination has been the more effective form to counter these infection. The advantage of conjugated vaccines compared to vaccines polysaccharide, is the ability to induce a T-dependent immune response which provides protection even at risk groups for infection by S. pneumoniae. The project proposal was establish a protocol for obtaining a conjugate consisting of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae serotype 1 (PS1) and the pneumococcal surface protein A (PspA). The synthesis of conjugate employed a new methodology for serotype 1. The evaluation of humoral immune response induced by the conjugate showed anti-PS1 IgG induction generated by immunization with the PS1-PspA.

Haemophilus influenzae tipo b é uma bactéria Gram-negativa, patogênica causadora de meningites em crianças. A cápsula polissacarídica (PSb) é o principal fator de virulência e é usado como antígeno vacinal. O método clássico de purificação do PSb envolve várias etapas de precipitação com etanol, fenol e detergente catiônico (inflamável, corrosivo e tóxico), e etapas de ultracentrifugação. O objetivo deste estudo foi substituir total ou parcial as precipitações e/ou uso das centrífugas por cromatografia, digestão enzimática, microfiltração e ultrafiltração tangencial. As cromatografias de troca iônica e de filtração em gel não apresentaram boas purificações, entretanto a hidrofóbica pode eliminar as proteínas contaminantes. As precipitações com etanol foram necessárias para obter a pureza requerida. O etanol de alguma forma favoreceu a ação enzimática e facilitou a posterior ultrafiltração. A separação com etanol em fibra-oca de microfiltração tangencial mostrou melhores purificações do que a centrifugação, mas com uso repetido verificou-se redução na eficiência. / Haemophilus influenzae type b is Gram-negative pathogenic bacterium cause meningitis in children. The capsular polysaccharide (PSb) is the main virulence factor and it is used as vaccine antigen. The classical PSb purification process includes ethanol, phenol and cationic detergent precipitations (explosion prone, corrosive, toxic) and ultracentrifugation steps. The aim of this work was to replace total or partial ethanol precipitations steps and/or elimination of centrifugation by chromatography methods, enzymatic digestion and ultrafiltration (UF) or microfiltration. The results have showed that ion exchange chromatography and gel filtration did not result in good purification, however the hydrophobic can be used for proteins elimination. The ethanol precipitation steps are necessary to achieve the required purity of PSb. In some way ethanol contributed for enzymes action and further improvements in the UF. The ethanol separation with hollow fiber microfiltration exhibited better purification than centrifugation, but after some uses the efficiency has reduced.

O feijão é um alimento nutritivo amplamente consumido no Brasil, porém, apresenta facilidade para desenvolver o defeito textural hard-to-cook (HTC) que torna as sementes resistentes ao amaciamento por cocção e provoca perdas econômicas e nutricionais. A maciez, um atributo importante nos grãos, proporciona melhor aceitabilidade do produto pelo consumidor, melhor qualidade nutricional e organoléptica e menor gasto de tempo e combustível no preparo. Devido à importância da parede celular na textura dos alimentos, foram investigadas alterações na estrutura e composição de seus polissacarídeos causada pelo HTC. Com este intuito, feijões Carioca-Pérola foram armazenados por 8 meses à 30°C / 75% UR e amostras cruas e cozidas tiveram suas paredes celulares extraídas através de tratamento enzimático-químico, produzindo uma fração solúvel em água (FSA) e outra insolúvel, denominada fração insolúvel em água (FIA). A FIA foi fracionada resultando em polímeros solúveis em solução de quelante de CDTA (FCDTA), base fraca (FBF) e álcali 4M (H4). A FSA foi separada em coluna de troca aniônica e os polímeros assim obtidos foram tratados com celulase e endopoligalacturonase e analisados quanto ao conteúdo de açúcares, peso molecular e natureza das ligações através de cromatografia em fase gasosa e a líqüido e por espectrometria de massa. Os resultados revelaram que 75% da parede celular do cotilédone é constituída pelas frações FSA, H4 e FCDTA, ricas em arabinanos ramificados de elevado peso molecular, contendo pequenas quantidades de xiloglicanos (XG), arabinogalactanos tipo II (AGII), galactanos, ramnogalacturonanos (RG) e xilogalacturonanos (XGA). As cascas dos feijões eram compostas por xilanos, celulose, XG, arabinanos e por pequena quantidade de RG. As sementes HTC possuem menor quantidade de polissacarídeos solúveis em água (FSA) e em solução de CDTA (FCDTA) e maior quantidade de material insolúvel em água (FIA), principalmente, polímeros da fração H4. Os feijões normais perdem grande quantidade de material péctico durante a cocção através da despolimerização e solubilização das pectinas hidrossolúveis (FSA) e, principalmente, pela solubilização dos polissacarídeos provenientes da fração H4, entretanto, a perda de material péctico em amostras HTC é mínima. Os feijões envelhecidos podem apresentar menor grau de metil esterificação das pectinas, que impediria a despolimerização. A redução na solubilidade dos polímeros da fração H4 pode estar relacionada com a perda de ramificação dos arabinanos e xiloglicanos resultando em polissacarídeos com cadeias mais lineares, que causam alinhamento das cadeias e formação de interações do tipo ponte de H, tornando os polímeros menos solúveis. O aumento de XGA e AU nas frações pécticas da FSA, bem como na FCDTA e FBF reforçam a suposição. / Beans is a nourishing food source widely consumed in Brazil. However, they show tendency to develop easily the textural defect named Hard-to-cook (HTC) that becomes the seeds resistant to softening by cooking, causing economical and nutritional losses. Softness is an important quality attribute of pulses that increases acceptability by consumer and provides betters nutritional and organoleptical qualities that results in less time and fuel spent. Because the importance of the cell wall to the food texture, changes in its polysaccharide structure and composition were investigated during the development of HTC. With this aim, Carioca-Pérola beans were stored for 8 months at 30°C / 75% RH and raw and cooked samples have had the cell wall extracted by enzymatic-chemical treatment, producing a water soluble fraction (FSA) and a water insoluble fraction, named water insoluble fraction (FIA). The FIA was fractionated, producing CDTA soluble polymers, weak base soluble polymers (FBF) and 4M alkali-soluble fraction (H4) The FSA was separated using anion exchange chromatography. All fractions obtained were treated withcelulase and endopoligalacturonase and analyzed for sugar content, molecular weight and sugar linkage using gas and liquid chromatography and mass spectrometry. The results revealed that FSA; H4 and CDTA fractions composed 75% of the cell wall material. This fractions were rich in high molecular weight branched arabinans, and also contained small amounts of xyloglucans (XG), arabinogalactans type II (AGII), galactans, rhamnogalacturonans (RG) and xylogalacturonans (XGA). Xylans, cellulose, XG, arabinans and small amounts of RG composed beans hulls cell wall. The HTC seeds have less amounts of CDTA and water-soluble polysaccharides (FCDTA and FSA) and higher amounts of water insoluble material (FIA), especially polysaccharides of H4 fraction. Normal beans loss high amounts of pectic material during cooking by water soluble pectin depolymerization and solubilization, and mainly by H4 fraction polysaccharide solubilization. However, the loss of pectic material in HTC beans is minimal. Aged beans pectins could have less methylesterification degree and, therefore, less depolymerization. The loss in H4 fractions polymers solubility could be related with the loss of arabinans and XG branches, resulting in a straight polysaccharide backbone, that cause chains alignment and H bonds formation, produce less soluble structures. The increase in the amounts of XGA and UA in FSA and also in the FCDTA and FBF fractions corroborates the supposition.