Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-23Bitstream added on 2014-06-13T20:55:08Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_ls_me_arafcf.pdf: 537259 bytes, checksum: 4756eac4f37ae0739a8b59e969ac32a1 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A esporotricose é uma micose de distribuição universal cujo agente é o fungo termodimórfico Sporothrix schenckii. A forma mais comum da doença é a linfocutânea, que compromete pele, tecido subcutâneo e gânglios linfáticos regionais. Os principais constituintes da parede celular de S. schenckii são compostos peptídeo-polissacarídicos contendo ramnose, manose e galactose. Estes compostos se arranjam na parede celular de modo a formar duas subcamadas distintas na forma leveduriforme do fungo, uma das quais, a mais interna e fixa delas, é denominada como peptídeo-polissacarídeo da parede celular (PPC) e foi utilizada como antígeno neste estudo, juntamente com a levedura termo-inativada (SSTI). Os antígenos liberados pelo fungo participam diretamente do processo de escape do sistema imune e também servem como alvos para a eliminação do mesmo por anticorpos ou ligação a receptores presentes em células da imunidade inata, como os macrófagos. Nossos resultados mostraram que o PPC induz citocinas de padrão inflamatório de forma mais pronunciada que o SSTI, que por sua vez induziu maior liberação de IL-10. Sugerimos também que no modelo experimental utilizado a IL-10 não atua provocando supressão da resposta proliferativa dos esplenócitos, e que a IL-4 atua apenas na fase de resolução da infecção, não sendo induzida como forma de escape imunológico pelo fungo. Também mostramos que os antígenos testados são capazes de induzir a liberação de IL-17 em culturas de esplenócitos, num perfil semelhante àquela das citocinas Th1 / Sporotrichosis is a micotic infection of universal distribution, which is caused by dimorphic fungus Sporothrix schenckii. It usually happens as a lymphocutaneous disease, compromising skin, subcutaneous tissues and regional lymphatic nodules. Major constituents of S. schenckii cell wall are peptido-polysaccharide complexes containing rhamnose, mannose and galactose. These complexes are organized in two distinct layers in the fungus yeast cell wall, of which the inner one is called cell wall peptido-polysaccharide (PPC), being used as antigen in this study, along with the heat-killed yeast (SSTI). Antigens released by the fungus directly participate in evasion of the immune system, also serving as targets for fungus elimination by binding of antibodies or innate immune cells like macrophages. Our results showed that PPC induces inflammatory cytokines in a more pronounced way when compared to SSTI, which induced higher levels of IL-10. We also suggest that, in the animal model used, IL-10 doesn’t act as a suppressor of splenocyte proliferative response, and that IL-4 play a role at the resolution phase of the infection, being not induced as a means of immunologic escape by the fungus. Also, we showed that the assayed antigens are capable of inducing IL-17 secretion in splenocyte cultures, in a fashion close to that of Th1 cytokines

Esta dissertação teve como objetivo, a preparação de hidrogéis à base de alginato contendo argila e material magnético em sua estrutura. Foram analisadas as modificações nas características físico-químicas dos hidrogéis preparados com diferentes reticulantes (CaCl2 e FeCl3) e diferentes concentrações de material magnético (1 e 3 % m/m) e argila (1, 5 e 10 %). Após isso, os hidrogéis foram avaliados quanto à capacidade de remoção de íons Cu2+ e Zn2+ de soluções aquosas. As amostras foram caracterizadas quanto à composição química por espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), quanto à morfologia por microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (SEM) e quanto às propriedades magnéticas por magnetometria de amostra vibrante (VSM). Através da técnica de difratometria de raios-X (XRD), foi possível verificar a natureza do material magnético e a dispersão da argila nos hidrogéis. A estabilidade térmica das amostras foi analisada por análise termogravimétrica (TGA). Os resultados mostraram que tanto a argila como o material magnético ficaram bem dispersos nas amostras. De forma geral, foram preparados hidrogéis com morfologia esférica, sendo que os hidrogéis de alginato de cálcio tenderam a apresentar maior resistência térmica do que os hidrogéis de alginato de ferro. Todas as amostras magnéticas apresentaram comportamento superparamagnético, porém as amostras de alginato de ferro mostraram-se quebradiças após o intumescimento em água. O tempo médio de equilíbrio de intumescimento foi de 240 minutos. Os resultados de cinética de adsorção mostraram que os hidrogéis de alginato de cálcio preparados nas condições avaliadas nesta Dissertação foram eficientes na remoção dos íons Cu2+ e Zn2+, sendo que o cobre apresentou maior afinidade pelo hidrogel do que o zinco / The aim of this Dissertation was study the preparation of hydrogels based on alginate containing clay and magnetic material in its structure. The modifications on the physicochemical characteristics of hydrogels prepared with different crosslinking (CaCl2 and FeCl3), different concentrations of magnetic material (1 and 3 % w/w), and clay (1, 5 and 10 % w/w) were analyzed. After that, the removal capacity of Cu2+ and Zn2+ from aqueous solutions was evaluated. The samples were characterized according their chemical composition by infrared spectroscopy (FTIR), morphology by scanning electron microscopy (SEM) and optical microscopy, magnetic properties by vibrating sample magnetization (VSM). Through the X-rays diffraction (XRD) it was possible to ascertain the nature of the magnetic material and the clays dispersion into hydrogels. The thermal stability of the samples was analyzed by thermogravimetry analysis (TGA). The results showed that both clay and magnetic material were well dispersed in the samples. Spherical hydrogels were prepared and the calcium alginate hydrogels had tended to present higher thermal resistance than the iron alginate hydrogels. All the magnetic samples showed superparamagnetic behavior; however iron alginate samples had proved be brittle after swelling in water. The equilibrium time of swelling was 240 minutes. The adsorption kinetics results showed that calcium alginate hydrogels prepared under the conditions evaluated in this work were efficient in the removal of Cu2+ and Zn2+, and copper showed higher affinity than zinc for the hydrogel

A utilização descontrolada de pesticidas tem provocado no decorrer dos anos a intoxicação de milhares de pessoas no mundo, uma vez que, seus resíduos têm sido depositados em alimentos, em solos e em ambientes aquáticos. Assim, a construção de duas novas plataformas sensoras para a detecção de pesticidas é o objetivo desse trabalho. Na primeira plataforma foi utilizado o polieletrólito catiônico polietilenoimina (PEI) em conjunto com o polissacarídeo extracelular algal (PSE) produzido pela microalga criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa preparados através da técnica de deposição \"spin-coating\". E a segunda plataforma foi produzida por eletrodeposição pulsada, entre um potencial de redução e um de oxidação, utilizando nanoestruturas de óxido de zinco (ZnO). Para caracterizar as plataformas, foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FEG-SEM), difração de raios X (XRD), espectroscopia de absorção ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de reflexão-absorção no Infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Através da imobilização da enzima polifenol oxidase na forma de extrato bruto em sua fonte natural (fruto abacate), as plataformas de PEI/PSE e ZnO, foram avaliadas como biossensores de catecol e do inseticida carbaril. De modo comparativo, as plataformas de PEI/PSE sem a presença imobilizada da enzima também foram estudadas para a detecção do catecol e do carbaril. A simplicidade na formação e na construção dessas plataformas vem qualificá-las como viáveis a serem produzidas em escala industrial e com baixo custo de processamento. E diante dos resultados obtidos no desenvolvimento desses biossensores destaca-se a eficiência e a rapidez de detecção, o que os tornam economicamente promissores e competitivos em termos de aplicações ambientais. / The uncontrolled use of pesticides has resulted over the years the intoxication of thousands of people in the world, since their waste has been deposited in food, in soil and aquatic environments. Thus, the construction of two new sensors platforms for pesticide detection is the objective of this work. At first platform was used cationic polyelectrolyte polyethyleneimine (PEI) along with the extracellular algal polysaccharide (EPS) produced by microalgae criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa prepared by deposition technique \"spin-coating\". The second platform was produced by pulsed electrodeposition between a reduction and an oxidation potential using nanostructures zinc oxide (ZnO). To characterize the platforms, we used the techniques of field emission gun scanning electron microscopy (FEG-SEM), X-ray diffraction (XRD), ultraviolet visible absorption spectroscopy (UV-Vis), atomic force microscopy (AFM), and polarization modulation infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS). By immobilization of the polyphenol oxidase enzyme as a crude extract in their natural source (avocado fruit), platforms PEI/PSE and ZnO, they were evaluated as catechol and carbaryl insecticide biosensors. In a comparative way, the platforms PEI/PSE without the presence of immobilized enzyme were also studied for detection of catechol and carbaryl. The simplicity in the formation and construction of these platforms comes qualify them as viable to be produced on an industrial scale and low cost processing. And on the results obtained in the development of such biosensors stand out the efficiency and speed of detection, which make them economically promising and competitive in terms of environmental applications.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-03-31T17:23:22Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-03T12:02:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T12:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-08-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The healing is a complex and dynamic event aimed at the restoration of tissue integrity. However, some factors, such as diabetes, can harm this physiological event. Chitosan, a derivative of chitin, has been considered as a versatile and effective option for the treatment of wounds. This study aimed to evaluate and compare the effect of chitosan 2% gel and chitosan spray based on secondary intention healing of skin wounds in diabetic rats. 54 rats were used, divided randomly into three groups: control group (CG), chitosan 2% gel group (GG), and Chitosan spray group (GS) with 18 animals each. The rats in GC, GG, and GS had their wounds treated daily with saline solution 0.9%, chitosan 2% gel, and chitosan spray, respectively. The groups were divided into three subgroups (n = 6) according to the times of histological analysis of wound (third, seventh, and 14th day). The induction of diabetes in the rats took place by intraperitoneal application of alloxan (120 mg/kg). After confirming the state of diabetes, the animals were anesthetized and the wounds made with the aid of a punch 9.0mm in the dorsal region. Macroscopic and microscopic analyzes were performed. Macroscopic analysis showed that after 14 days, the chitosan 2% gel and chitosan spray gave a contraction rate of 100% and 99%, respectively. At the histological level, there was the anticipated recruitment of mononuclear cells, fibroblasia, and deposition of dense fibrovascular tissue and marked fibrosis in the wounds of GG and GS, emphasizing the ability of this biopolymer to optimize the healing of diabetics. It can therefore be a therapeutic option for the development of other formulations that provide wound repair in diabetic patients. / A cicatrização é um evento complexo e dinâmico que visa a restauração da integridade tecidual. No entanto, alguns fatores, como o diabetes, podem prejudicar este evento fisiológico. A quitosana, um derivado da quitina, tem sido cogitada como uma opção versátil e eficaz para o tratamento de feridas. O presente estudo teve como objetivo avaliar e comparar o efeito do gel de quitosana a 2% e spray à base de quitosana na cicatrização por segunda intenção de feridas cutâneas em ratas diabéticas. Foram utilizadas 54 ratas, divididas, aleatoriamente, em três grupos: grupo controle (GC) grupo gel de quitosana a 2% (GG) e grupo spray de quitosan (GS) com 18 animais, cada. As ratas dos grupos GC, GG e GS tiveram suas feridas tratadas diariamente com solução fisiológica 0,9%, gel de quitosana a 2% e spray à base de quitosana, respectivamente. Os grupos foram subdivididos em três subgrupos (n=6) conforme os tempos de análise histológica da ferida (terceiro, sétimo e 14º dia). A indução do diabetes mellitus, nas ratas, ocorreu por meio da aplicação intraperitoneal da aloxana (120mg/kg). Após a confirmação do estado de diabetes, os animais foram anestesiados e as feridas confeccionadas com auxílio de um punch de 9,0mm na região dorsal. Foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas. As análises macroscópicas mostraram que ao 14º dia, o gel de quitosana 2% e o spray de quitosana proporcionaram uma taxa de contração de 100% e 99%, respectivamente. A nível histológico, observou-se o recrutamento antecipado de células mononucleares, fibroblasia e deposição de tecido fibrovascular denso acentuados e fibrose nas feridas dos GG e GS, enfatizando a capacidade deste biopolímero em otimizar a cicatrização de diabéticos. Podendo, portanto, ser uma opção terapêutica como também a base para o desenvolvimento de outras formulações que proporcionem a reparação de feridas em pacientes diabéticos.

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um importante patógeno humano, responsável por graves infecções das vias respiratórias. O principal fator de virulência desse microrganismo é a cápsula polissacarídica (PS), antígeno das vacinas atuais, que são elaboradas com os PS purificados de cepas de pneumococo prevalentes na população. O objetivo desse trabalho foi desenvolver um processo de purificação do PS do sorotipo 14, responsável por 39% das doenças em crianças de 0-6 anos no Brasil. A metodologia de purificação envolveu separação celular por microfiltração tangencial e concentração do microfiltrado com membrana de ultrafiltração tangencial de 50 kDa. O produto dessa etapa foi diafiltrado com dodecil sulfato de sódio em membrana de ultrafiltração tangencial de 30 kDa, seguido de precipitação com ácido tricloroacético a 5%, precipitação por etanol (20% e 60%) e cromatografia de troca aniônica. A pureza do PS foi avaliada pelo conteúdo de proteínas e ácidos nucleicos remanescentes e o tamanho por cromatografia de exclusão molecular. O PS foi obtido com pureza e tamanho requeridos pelos órgãos regulatórios e o rendimento final do processo foi de 65%. / Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an important human pathogen responsible for severe respiratory tract infections. The main virulence factor of this microorganism is the capsular polysaccharide (PS), which is the antigen of all current vaccines, which are prepared with purified PS of pneumococcal strains prevalent in the population. The objective of this work was to develop a new purification process for PS of serotype 14, responsible for 39% of diseases in children of 0-6 years old in Brazil. The purification method involved cell separation by tangential microfiltration and concentration of cell-free culture broth containing PS by tangential ultrafiltration (50 kDa). The product of this step was diafiltrated with sodium dodecyl sulfate by tangential ultrafiltration (30 kDa), following by 5% trichloroacetic acid precipitation, 20% and 60% ethanol precipitation and anion exchange chromatography. The PS purity was evaluated by the content of residual proteins and nucleic acids, and the molecular mass by size exclusion chromatography. The purity and molecular mass requirements were achieved and the process global yield was 65%.

Streptococcus pneumoniae é a maior causa de doenças infecciosas invasivas. As vacinas conjugadas, ao contrário das vacinas polissacarídicas, se mostram eficazes na indução de uma resposta protetora em crianças menores de 2 anos de idade. Entretanto, apesar do sucesso na redução dos casos de doenças pneumocócicas, publicações recentes têm mostrado um aumento nos casos de doença por sorotipos de S. pneumoniae não inclusos nas vacinas conjugadas atualmente licenciadas. Com o objetivo de evitar a substituição dos sorotipos prevalentes e aumentar a cobertura vacinal, nosso projeto prevê a introdução de uma proteína de superfície do pneumococo como carreador em uma vacina conjugada. A Proteína de Superfície Pneumocócica A (PspA), por ser conservada entre diversos sorotipos e por sua alta imunogenicidade, foi escolhida para constituir o conjugado, juntamente com o Polissacarídeo Capsular de S. pneumoniae sorotipo 6B (PS6B), um sorotipo de elevada prevalência no Brasil. Também foi avaliada a influência de diferentes espaçadores entre a proteína carreadora e o PS sobre a resposta imune induzida. Estudos envolvendo diferentes condições reacionais tiveram como objetivo o estabelecimento de um protocolo de conjugação com elevado rendimento. A substituição do ativador EDAC (hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), comumente empregado na ativação do grupo carboxila da proteína, pelo DMT-MM (cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino) foi capaz de aumentar significativamente o rendimento reacional, o qual passou de menos de 10% para aproximadamente 50%. A proteção com formaldeído dos grupos lisinas da PspA aumentou a especificidade da reação de conjugação, com consequente aumento no rendimento reacional. A PspA modificada manteve a mesma estrutura secundária apresentada pela PspA nativa (análise por dicroísmo circular - CD) bem como sua imunogenicidade (título de anticorpos, capacidade de deposição de complemento e atividade opsonofagocítica). Apesar das análises por CD mostrarem que a conjugação alterou a estrutura secundária da PspA, ensaios imunológicos mostraram que essa desestruturação não afetou a sua capacidade de induzir uma resposta imune protetora. A resposta anti-PspA e anti-PS6B induzida pelo conjugado mostrou-se dose dependente, muito embora o PS6B tenha se comportado como um antígeno pouco imunogênico. / Streptococcus pneumoniae is the main cause of invasive infectious diseases. Unlike polysaccharide (PS) based vaccines, conjugate vaccines have shown to protect children less than 2 years old. However, regardless of the success in reducing pneumococcal disease, recent reports have shown an increase in the rate of disease caused by serotypes not included in licensed conjugate vaccines. In order to avoid serotype replacement, our project proposes to test a surface exposed pneumococcal protein as carrier. Pneumococcal Surface Protein A (PspA), a conserved protein among various serotypes, and highly immunogenic was chosen to take part in the conjugate together with the Polysaccharide Serotype B of Streptococcus pneumoniae (PS6B), a serotype of high incidence in Brazil. In this sense, studies involving different reactional conditions were aimed at stablishing a high yield conjugation protocol. Also, the influence of different spacer between carrier protein and polysaccharide were evaluated on immune response. The replacement of EDAC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), usually used in the activation of protein carboxyl groups, to DMT-MM (4-[4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl]-4-methylmorpholinium chloride), was able to significantly increase the reactional yield from less than 10% to approximately 50%. The protection of lysines groups of PspA with formaldehyde increased conjugation specificity, with subsequent increase in reactional yield. Modified PspA maintained the same secondary structure of native PspA (circular dichroism analyses - CD) as well as its immunogenicity (antibody titers, deposition of complement and opsonophaghocytic activity). Despite circular dichroism analyses have shown changes in PspA secondary structure, immunological tests proved that this alteration did not affect its ability in inducing a protective immune response. Anti-PspA and anti-PS6B responses proved to be dose dependent, although PS6B acted as a poor immunogenic antigen in mice.

Haemophilus influenzae type b (Hib) é uma importante bactéria Gram-negativa causadora de pneumonia, meningite e septicemia em crianças abaixo dos 5 anos de idade. A prevenção contra a doença pode ser alcançada pela imunização da população com vacina conjugada polissacarídeo-proteína, uma vez que a vacina de polissacarídeo não é eficiente. As vacinas conjugadas disponíveis comercialmente custam para o governo brasileiro cerca de US2,7 a dose, sendo necessárias no mínimo 3 doses para imunização completa. O presente estudo desenvolveu um novo método de conjugação de polissacarídeo capsular de Hib (PRP) com toxóide tetânico (TT). O método hidrazona baseia-se em 3 etapas simples: oxidação e derivatização de PRP com espaçador molecular e conjugação com TT na presença de uma carbodiimida e de um éster amino reativo. Após um estudo detalhado de cada etapa do método hidrazona, o novo processo mostrou excelentes resultados de rendimento mesmo após escalonamento. A imunogenicidade e o índice de avidez do conjugado hidrazona foram avaliados e os resultados encontrados foram comparáveis a vacina comercial Hiberix®. A técnica de HPSEC mostrou-se eficaz e o perfil cromatográfico do conjugado hidrazona foi muito similar ao da vacina Hiberix. Finalmente, o novo processo de conjugação de vacina permitiu o desenvolvimento de uma poderosa tecnologia constituindo uma excelente opção para o governo brasileiro. / Haemophilus influenzae type b (Hib) is an important encapsulated bacteria, which causes pneumonia, meningitis and septicaemia in infants. Prevention against infection is achieved by the currently available polysaccharide protein conjugate vaccine. However, due to its high production costs (around U$ 2,7 per dose) this formulation cannot be used in mass immunization programs in Brazil. In the present study, we developed a new method for the conjugation of Hib polysaccharide (PRP) and tetanus toxoid (TT). The hydrazone method is based on 3 singles steps: PRP oxidation, PRP derivatization with linker spacer and conjugation with TT in the presence of carbodiimide and an amino reactive ester. After detailed study of each step of method, the new process showed very good yield of conjugation even when it was scaled-up. The immunogenicity and the avidity index of hydrazone conjugate were evaluated and the results were comparable with those obtained with the commercial vaccine Hiberix®. The HPLC hydrazone profile was very similar to HPLC Hiberix profile. Finally, the new conjugation process allows the development of a powerful vaccine technology, constituting an excellent choice for the brazilian government.

Orientador: Fauze Ahmad Aouada / Resumo: Com o objetivo de aplicar agroquímicos de uma forma controlada, e reduzir os danos à saúde e ao meio ambiente causados por estes, foram desenvolvidos neste trabalho, dois novos hidrogéis a partir de dois polissacarídeos diferentes carboximetilcelulose (CMC) e quitosana (Qs), suportados em redes de poli (ácido metacrílico)-co-poliacrilamida (PMAA-co-PAAm). Também foi investigada a influência da zeólita nas principais propriedades agroquímicas desses materiais como sorção e dessorção de herbicidas. A estabilidade da zeólita na solução polimérica foi estudada por meio de medidas de viscosidade. Estes comprovaram que a adição de polissacarídeo na solução formadora dos hidrogéis possibilita a obtenção de um hidrogel nanocompósito homogêneo. A incorporação da zeólita nos hidrogéis foi confirmada pela presença das bandas características da zeólita em 798 cm-1 e 600 cm-1 nos espectros de FTIR dos hidrogéis nanoestruturados. Outros indícios de incorporação foram a redução no volume dos poros e a presença de microporos nas paredes dos poros dos hidrogéis, aumento na massa residual dos hidrogéis nanoestruturados a 800ºC, observados nos resultados obtidos por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise termogravimétrica (TG), respectivamente. Constatou-se também que a presença da zeólita reduziu o grau de intumescimento desses materiais, devido ao decréscimo na elasticidade das cadeias poliméricas. Entretanto, nos resultados de dessorção observou-se que a presença da zeólita pode... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In order to apply agrochemicals in a controlled manner, and to reduce the damages to the health and environmental caused by these, two new hydrogels based on carboxymethylcellulose (CMC) and chitosan (Qs) polysaccharides supported on poly(methacrylic acid)-co-polyacrylamide (PMAA-co-PAAm) networks were synthesized. The influence of zeolite on the main properties of these materials such as sorption and desorption was also investigated. The stability of zeolite in the polymeric solution was studied by viscosimetry. These results showed that the addition of polysaccharide in the hydrogel-forming solution enables the obtaining of homogeneous nanocomposite hydrogels. The incorporation of zeolite into hydrogels was confirmed by the presence of spectroscopic bands at 798 cm-1 and 600 cm-1 in the FTIR nanocomposite spectra. Other indicatives were the reduction in pore volume and the presence of micropores in the pore walls of zeolite hydrogels, and increase in the residual mass of nanostructured hydrogels at 800ºC, observed by scanning electron microscopy (SEM) and thermogravimetric analysis (TG), respectively. It was also observed that the presence of zeolite reduced the degree of swelling of these materials, due to the decrease in the elasticity of the polymeric chains. The results of desorption in saline medium show that the hydrogels studied in this work can reduce the presence of Al+3 ions, which in acidic soils are harmful to some crops. These results indicate that the hydrogel... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3277.pdf: 7015864 bytes, checksum: 9834075e819d2bb62213cf25d21ce5e5 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram negative bacterium responsible for causing meningitis worldwide. The capsular polysaccharide b, a polymer composed by repeating units of ribosyl-ribitol phosphate (PRP), is the major virulence factor and it is used in the formulation of the vaccine against this microorganism. Despite their high efficiency, the conjugated vaccine against Hib is a product of high production cost, which involves fermentation, purification and conjugation processes to obtain a final product within the specifications of the World Health Organization (WHO). The improvement of the culture medium and cultivation conditions can contribute to reduce the cost of this vaccine in order to facilitate its dissemination in developing countries. The main objective of this work was to identify culture conditions that result in higher production of capsular polysaccharide, helping to reduce costs in the steps of purification and conjugation. The experiments were carried out in shake flasks or in bioreactors with 7-13 liters of capacity. The temperature was maintained at 37 °C, pH controlled at 7.5 by adding NaOH 5M and the concentration of dissolved oxygen (CDO) maintained at 30% of air saturation. The specific flow rate of air ranged between 0.2 and 1 VVM. Samples were collected at regular time intervals to measure optical density (DO540nm), biomass concentration, capsular polysaccharide (PRP) production and concentrations of glucose and metabolites. Two possibilities for increasing polysaccharide production were studied: 1) different strategies of fed-batch cultivation consisting of: a) intermittent addition of glucose (FBIG), b) constant feeding (FBCF), c) exponential feeding (FBEF), e d) exponential feeding with cell recycle and perfusion (FBER + P); 2) improvement of culture media composition regarding the carbon/nitrogen ratio through the use of central composite rotational design (CCRD) methodology, having as independent variables: Soy Peptone (S), Yeast Extract (YE) and Glucose (G). Quality parameters were also evaluated to assess the molecular weight profile of the product (PRP) as well as morphological aspects of the microorganism. Economic analysis of different cultivation strategies was used to identify the more economically viable process. The results of the different cultivation strategies together with the outputs of the studied processes cost analysis showed that FBCF, with a cost of U.S.$ 425.50/g PRP and productivity of 88 mg/L.h, showed to be the best alternative among PRP production processes due to its lower cost with a good productivity. In the study of the culture media composition through the statistical analysis of the CCRD results showed that the best culture media composition (BCM) consisted of S 5 g/L; YE 5.5g /L and G of 15.25 g/L. DO540nm and PRP volumetric production values of 8.4 and 410 mg/L, respectively, were attained in validation experiments carried out in shake flasks at the BCM condition. For the bioreactor BCM validation experiment, biomass concentration of 3 g DW/L and polysaccharide production of 600 mg PRP/L were observed. Similar values were reached at validation runs performed in shake flasks and bioreactor for the central point CP condition, showing that both BCM and CP conditions belong to the optimum region. The analysis of quality parameters showed that the cultivation time influences strongly the size of the polysaccharide molecule. The longer the cultivation time, the lower molecular weight was found. The analysis by transmission electron microscopy (TEM) of H. influenzae cells revealed a predominance of round cells in the sixth hour of cultivation, whereas in the twelfth hour of cultivation the cells exhibited a more elongated morphology with the presence of cytoplasmic inclusions in the shape of granules, possibly due to the accumulation of some reserve material. Based on these results, the new composition of the culture medium resulted in an increased of cell growth and capsular polysaccharide production with half of the sources nitrogen (soybean peptone and yeast extract) concentrations, which reduces the production cost. The cultivations that resulted in higher production and productivity of polysaccharide were FBCF (1600 mg PRP/L and 88 mg PRP/(L.h)) and FBER+ P (1800 mg PRP/L and 129 mg PRP/(L.h)). The FBER+P reached 30% higher productivity of polysaccharide than the best result described in the literature (90 mg PRP/(L.h)). However, the FBCF cultivation was economically more viable. / Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram negativa responsável por causar meningite em todo o mundo. O polissacarídeo capsular b, um polímero composto por unidades repetidas de ribosil-ribitol-fosfato (PRP) e o principal fator de virulência, sendo utilizado na formulação da vacina contra este microrganismo. Apesar de sua elevada eficiência, a vacina conjugada contra Hib é um produto de alto custo de produção por envolver processos de fermentação, purificação e conjugação para obtenção de um produto final dentro das especificações da Organização Mundial da Saúde (OMS). O melhoramento do meio de cultura e das condições de cultivo pode contribuir para redução do custo desta vacina de forma a facilitar sua difusão nos países subdesenvolvidos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi identificar condições de cultivo que resultem em maior produção de polissacarídeo capsular, contribuindo para reduzir os custos nas etapas de purificação e conjugação. Os ensaios foram conduzidos em frascos agitados ou em biorreatores com 7 a 13 litros de capacidade nominal. A temperatura foi mantida em 37oC, o pH controlado em 7,5 através da adição de NaOH 5M e a concentração de oxigênio dissolvido (COD) mantida em 30 % da saturação do ar. A vazão especifica de ar variou entre 0,2 e 1 VVM. Amostras foram coletadas em intervalos regulares de tempo para mensurar densidade óptica (DO540nm), concentração celular, produção de polissacarídeo capsular (PRP) e concentrações de glicose e metabolitos. Duas possibilidades para aumentar a produção de polissacarídeo foram estudadas: 1) diferentes estratégias de cultivo descontinuo alimentado consistindo por: a) adição intermitente de glicose (CDAIG), b) vazão constante (CDAVC), c) vazão exponencial (CDAVE), e d) reciclo de células seguido de perfusão (CDAVE+P)); e 2) o melhoramento da composição do meio de cultura quanto à relação carbono/nitrogênio através do uso da metodologia de delineamento composto central rotacional (DCCR), tendo como variáveis independentes: Peptona de Soja (S), Extrato de Levedura (EL) e Glicose (G). Parâmetros de qualidade também foram avaliados para verificar o perfil da massa molecular do produto (PRP) e os aspectos morfológicos do microrganismo. Os resultados das diferentes estratégias de cultivo juntamente com os resultados da analise econômica do custo dos processos estudados mostraram que o CDAVC, com custo de US$ 425.50/g PRP por ano e produtividade de 88 mg/(L.h), demonstrou ser a melhor alternativa para o processo de produção de PRP por apresentar menor custo com boa produtividade. Já o estudo da composição do meio de cultura através da analise estatística dos resultados do DCCR mostraram que a melhor composição do meio de cultivo (MMC) consistia em S de 5 g/L, EL de 5,5 g/L e G de 15,25 g/L. Valores de DO540nm de 8,4 e de produção volumétrica de polissacarídeo de 410 mg PRP/L foram alcançados em experimentos de validação na condição MMC realizados em shaker. Para o ensaio de validação da condição MMC em reator, a concentração de biomassa de 3,0 g MS/L e a produção de polissacarídeo capsular de 600 mg PRP/L foram observadas. Valores semelhantes foram obtidos em experimentos de validação realizados em shaker e biorreator na condição CPC, mostrando que tanto a condição CPC como a MMC pertencem a região de ótimo. A analise dos parâmetros de qualidade mostrou que o tempo de cultivo influencia fortemente no tamanho da molécula do polissacarídeo, sendo que quanto maior o tempo de cultivo, menor a sua massa molecular. A analise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das células de H. influenzae mostrou a predominância de células com morfologia arredondada na sexta hora de cultivo, enquanto que, na décima segunda hora de cultivo, as células apresentaram morfologia mais alongada e exibiram a presença de inclusões citoplasmáticas na forma de grânulos, possivelmente devido ao acumulo de algum material de reserva. Diante dos resultados obtidos, a nova composição de meio resultou em maior crescimento celular e produção de polissacarídeo capsular, com metade das concentrações das fontes de nitrogênio (peptona de soja e extrato de levedura), o que reduz o custo de produção. Os cultivos que resultaram em maior produção e produtividade foram o CDAVC (1600 mg PRP/L e 88 mg PRP/L.h) e o CDAVE+P (1800 mg PRP/L e 129 mg PRP/L.h), sendo que este ultimo (CDAVE+P) atingiu produtividade 30 % maior que o melhor resultado ate então descrito na literatura (90 mg PRP/L.h). No entanto, o cultivo CDAVC apresentou maior viabilidade do ponto de vista econômico e de execução e passível de escalonamento.