This work examines the synthesis of poly(ADP-ribose) in normal and SV40-transformed monolayer cultures of 3T3 cells as a function of growth and DNA fragmentation. A review of the relevant literature is given in the introduction of this work. Poly(ADP-ribose) synthesis has been implicated in transcription, replication, repair, differentiation and regulation of cell growth. The results of this study suggest that poly(ADP-ribose) synthesis is involved in some aspect of cell-growth control and DNA repair.

Les dommages à l'ADN induits par les rayons ultraviolets B (UV) solaires jouent un rôle important dans les cancers de la peau induits par les rayons solaires. Le travail présenté dans cette thèse examine le rôle de l'enzyme nucléaire poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) dans les réponses cellulaires suite aux dommages à l'ADN induits par les UV. Premièrement, nous avons examiné le mécanisme précis d'activation de la PARP-1 en réponse aux UV. En utilisant des techniques d'irradiation locale d'UV, d'immunocytochimie et d'immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré que PARP-1 est activée de deux façons distinctes en réponse à deux types de dommages à l'ADN causés par les UV, i.e., les photo-lésions directes et les dommages oxydatifs. Ces deux types de dommages à l'ADN sont réparés par les voies de réparation par excision de nucléotides (NER) et par excision de bases (BER), respectivement. Depuis que le rôle de PARP-1 est bien connu dans le BER, nous nous sommes concentrés à examiner si la PARP pouvait jouer un rôle dans NER en faisant une déplétion stable de la PARP à l'aide de l'ARN interférence (ARNi) dans des fibroblastes de peau humaine qui étaient compétents dans NER ou déficients dans l'étape de reconnaissance des lésions du NER. En utilisant la technique de «host cell réactivation» (HCR), nous avons observé que les cellules déficientes en PARP-1 étaient inefficaces dans l'étape de la reconnaissance des lésions du NER. Durant l'exploration du rôle de PARP-1 dans l'apoptose induite par les UV, nous avons découvert que l'ARNi arrêtait durant l'apoptose. Nous avons trouvé que Dicer, un endonucléase de la famille RNaselII et un élément critique dans la régulation de l'ARNi, était clivé par la caspase-3 durant l'apoptose, ce qui amenait l'inactivation de ses fonctions catalytiques et l'abrogation de l'ARNi. En résumé, cette thèse élucide un important rôle de PARP-1 dans les réponses cellulaires aux UV. De plus, la découverte imprévue de 1' abrogation de l'ARNi durant l'apoptose présente de nouveaux défis dans les domaines relatifs à l'ARNi. / The DNA damages induced by solar ultraviolet B radiation (UV) play an important role in sunlight-induced skin cancers. The work presented in this thesis examines role of a nuclear enzyme, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in cellular responses to UVinduced DNA damage. PARP-1 is known to be activated in response to different types of DNA damages, and its activation is known to participate in different cellular responses ranging from DNA repair to cell death. To understand the mechanism of activation of PARP-1 in UV-irradiated cells, we used elegant techniques of local UV irradiation, immunocytochemistry and chromatin immunoprecipitation to demonstrate that PARP-1 is activated in two distinct phases in response to two different types of DNA damage caused by UV, i.e., direct photolesions and oxidative DNA damage. These two types of UVinduced DNA lesions are repaired by nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) pathways, respectively. Since PARP-1's role in BER is well-known, we focused on examining whether PARP could play a role in NER by stably depleting PARP-1 using DNA vector-based RNAi in human skin fibroblasts which are either proficient in NER or deficient in lesion-recognition steps of NER. Upon analyses of the NER-capacity of these cells by host cell reactivation (HCR) assay using a recombinant adenovirus-based reporter gene, we observed that PARP-1-depleted cells were inefficient in the lesion recognition step of NER. While exploring the role of PARP-1 in UV-induced apoptosis using the above models, we serendipitously discovered that RNAi fails during apoptosis. We find that endonuclease Dicer-1, critical in the regulation of RNAi gets cleaved by caspase-3 during apoptosis, which leads to its catalytic inactivation and failure of RNAi. In summary, this thesis elucidates an important role for PARP-1 in cellular responses to UV. In addition, the RNAi-abrogation during apoptosis is an exciting discovery that presents new challenges in the relatively new field of RNAi.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Le dommage à l'ADN provoqué par le rayonnement ultraviolet est réparé par excision de nucleotides (NER). La vitesse de ce mécanisme est réduite lorsque la PARP-1, une enzyme impliquée dans plusieurs autres voies de réparation de l'ADN, est inhibée ou réduite par interférence stable à l'ARN. Ce travail vise à déterminer si cette implication de la PARP-1 transite par la première protéine de reconnaissance du NER : DDB2. Nous avons démontré une augmentation de l'interaction entre la PARP-1, son produit le poly(ADP-ribose) et DDB2 suite à l'irradiation aux UVC, et une quasi abolition de l'interaction entre DDB2 et la PARP-1 suite à l'inhibition catalytique de celle-ci. Cette inhibition, sans affecter le recrutement aux lésions de DDB2, affecte plutôt celui de XPC, la seconde protéine de reconnaissance du NER. Ces résultats suggèrent une coopération entre la PARP-1 et DDB2 dans le NER possiblement impliquée dans le recrutement de XPC aux dommages.

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle effectuée par les poly(ADP-ribose) polymerases (PARP), des enzymes à prédominance nucléaire qui catalysent la formation de polymères d'ADP-ribose sur des protéines acceptrices en utilisant le NAD+ comme substrat. Cette modification est impliquée dans plusieurs processus cellulaires dont la replication, la transcription, la réparation de l'ADN et la mort cellulaire. La poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG) est l'enzyme qui hydrolyse le polymère d'ADP-ribose, permettant aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Le projet de recherche ici présent décrit les méthodes et caractéristiques optimales de l'inhibition de l'expression du gène PARG dans le but de moduler la réponse aux dommages à l'ADN des cellules humaines cancéreuses. La première étape a été de développer des anticorps monoclonaux spécifiques envers l'enzyme PARG humaine (B8G4 et D8B10). Ces anticorps, d'un isotype IgGl et IgG2a respectivement, sont capables de détecter spécifiquement trois isoformes de l'enzyme PARG. Les résultats d'immunobuvardages ont montré que B8G4 et D8B10 détectent PARG dans des types cellulaires différents. La deuxième étape consistait au développement de petits ARN en épingle à cheveux (shARN) spécifiques au gène PARG humain et leur insertion dans un système d'expression viral (lentivirus). Les quatre shARN-huPARG produits et caractérisés ont tous démontré une capacité variable de l'inhibition de l'expression du gène PARG chez les cellules humaines. L'inhibition a permis de diminuer significativement la présence cellulaire de la protéine PARG ainsi que son activité enzymatique. Des cellules de gliomes humains SKI-1 dont le contenu en PARG a été constitutivement diminué à l'aide du système de shARN semblent montrer une sensibilité accrue aux rayons ionisants. Les anticorps anti-PARG B8G4 et D8B10 ainsi que les ARN en épingle à cheveux shRNA-PARG sont des outils moléculaires fonctionnels permettant de diminuer significativement l'expression du gène PARG et de déterminer l'ampleur de l'inhibition. Ces outils ont été ainsi utilisés dans une étude fonctionnelle de sensibilisation des cellules cancéreuses envers des rayons ionisants.

No / TCDD-inducible poly-ADP-ribose polymerase (TIPARP; also known as PARP7 and ARTD14) is a mono-ADP- ribosyltransferase that has emerged as an important regulator of innate immunity, stem cell pluripotency, and transcription factor regulation. Characterizing TIPARP’s catalytic activity and identifying its target proteins are critical to understanding its cellular function. Here we describe methods that we use to characterize TIPARP catalytic activity and its mono-ADP-ribosylation of its target proteins.

Yes / The aryl hydrocarbon receptor (AHR) is a ligand-activated transcription factor and member of the basic helix-loop-helix-PAS family. AHR is activated by numerous dietary and endogenous compounds that contribute to its regulation of genes in diverse signaling pathways including xenobiotic metabolism, vascular development, immune responses and cell cycle control. However, it is most widely studied for its role in mediating 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) toxicity. The AHR target gene and mono-ADP-ribosyltransferase, TCDD-inducible poly-ADP-ribose polymerase (TIPARP), was recently shown to be part of a novel negative feedback loop regulating AHR activity through mono-ADP-ribosylation. However, the molecular characterization of how AHR regulates TIPARP remains elusive. Here we show that activated AHR is recruited to the TIPARP promoter, through its binding to two genomic regions that each contain multiple AHR response elements (AHREs), AHR regulates the expression of both TIPARP but also TIPARP-AS1, a long non-coding RNA (lncRNA) which lies upstream of TIPARP exon 1 and is expressed in the opposite orientation. Reporter gene and deletion studies showed that the distal AHRE cluster predominantly regulated TIPARP expression while the proximal cluster regulated TIPARP-AS1. Moreover, time course and promoter activity assays suggest that TIPARP and TIPARP-AS1 work in concert to regulate AHR signaling. Collectively, these data show an added level of complexity in the AHR signaling cascade which involves lncRNAs, whose functions remain poorly understood. / This work was supported by Canadian Institutes of Health Research (CIHR) operating grants (MOP-494265 and MOP-125919), an unrestricted research grant from the Dow Chemical Company, and the Johan Throne Holst Foundation to J.M. G.G. was supported by European Union Seventh Framework Program (FP7-PEOPLE2013-COFUND) under the Grant Agreement n609020 - Scientia Fellows

La PARP-1 est une enzyme nucléaire qui modifie de façon post-traductionnelle plusieurs protéines nucléaires via son activité de poly(ADP-ribosyl)ation, souvent en réponse aux bris de l'ADN. Elle est ainsi impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires vitales, incluant la réparation de l'ADN, la prolifération, la différenciation ainsi que la transcription de l'ADN pour n'en nommer que quelques- unes. Les promoteurs humains, de rat, de souris et de Drosophile du gène de la PARP-1 ont été clones et démontrent une structure commune aux gènes constitutifs (housekeeping). La transcription du gène de la PARP-1 est en partie régulée positivement par les facteurs de transcription Sp1 et Sp3 et négativement par le facteur de transcription NFI. Nous avons récemment démontré que les niveaux d'expression de la PARP-1, Sp1 et Sp3 sont fortement modulés par l'état de la densité et de la différenciation cellulaire chez des cultures primaires de cellules épithéliales de cornée de lapin (CECL). Par conséquent, la PARP-1 pourrait jouer un rôle durant la cicatrisation cornéenne puisqu'elle est fortement influencée durant les événements de migration, prolifération et différenciation qui caractérisent ce phénomène. La PARP-1 joue un rôle d'autant plus spécifique durant la cicatrisation cornéenne. En plus d'être influencée par la densité et la différenciation cellulaire, son expression est également fortement influencée par la présence de la fibronectine (FN). La FN, une protéine de la matrice extracellulaire, est sécrétée de façon massive durant la cicatrisation de l'épithélium cornéen. Considérant la relation étroite qui existe entre l'expression de la PARP-1 et de Sp1, nous avons également envisagé la possibilité que Sp1 soit une cible potentielle de la poly(ADP-ribosyl)ation par la PARP-1. PARP-1 pourrait ainsi réguler la transcription de son propre gène. En conclusion, notre étude a démontrée par quels mécanismes moléculaires la PARP joue son rôle durant la cicatrisation de l'épithélium cornéen. La PARP-1 pourrait ainsi constituer un modérateur de l'expression génique durant la phase hautement prolifique qui caractérise la cicatrisation cornéenne. / Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is a nuclear enzyme that post-translationally modifies a variety of proteins through its poly(ADP-ribosyl)ation activity in response to DNA strand break. PARP-1 is thus involved in several vital cellular functions such as DNA repair, cell proliferation and differentiation as well as DNA transcription. The promoter from the human, rat, mouse and Drosophila PARP-1 genes have been identified and cloned. Each of them has a structure common to housekeeping genes. PARP-1 gene transcription is positively regulated by the positive transcription factors Sp1 and Sp3 whereas it is repressed by members of the nuclear factor-l (NFI) family of transcription factors. We recently demonstrated that PARP-1, Sp1 and Sp3 expression was similarly influenced by both cell density and cell differentiation in primary cultures of rabbit corneal epithelial cells (RCECs). Because it may influence the migration, proliferation and differentiation properties of the epithelial cells from the cornea, PARP-1 may therefore play a significant function during corneal wound healing as well. We recently demonstrated that fibronectin, a major component from the extracellular matrix that is transitorily expressed during corneal wound healing, positively influenced the expression and DNA binding of Sp1 in RCECs. Similarly, PARP-1 gene expression strongly responded (positively) to the presence of FN in tissue culture plates, a further evidence that link PARP-1 expression to corneal wound healing as FN is massively secreted during that process. Moreover, and considering the close relationship between PARP-1 and Sp1 expression, we hypothesized that Sp1 could represent a potential targetfor poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 and thereby alter its overall regulatory influence. We indeed demonstrated that Sp1 could be added polymers of ADPribose by PARP-1, a post-translational modification that also resulted in restricting the positive regulatory influence Sp1 might exert on its downstream target genes. In conclusion, PARP-1 indeed seems to be a potent regulator of gene expression during the highly proliferative phase that characterizes corneal wound healing.

Background: Lung dysfunction constitutes a severe complication after major cardiac surgery with cardiopulmonary bypass (CPB), substantially contributing to postoperative morbidity and mortality. The current possibilities of preventive and therapeutic interventions, however, remain insufficient. We, therefore, investigated the effects of intraoperative application of the antioxidant and anti-inflammatory green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on CPB-associated lung injury. Materials and methods: Thirty piglets (8 - 15 kg) were divided into four groups: sham-operated and saline-treated control group (n = 7); sham-operated and EGCG-treated control group (EGCG-control group; n = 7); CPB group (n = 10); and CPB + EGCG group (n = 6). The CPB groups underwent 120 min of CPB followed by 90 min of recovery time. In the CPB + EGCG group, EGCG (10 mg/kg body weight) was administered intravenously before and after CPB. Hemodynamic monitoring, blood gas analysis, hematoxylin-eosin staining, and immunohistochemistry of lung tissue were performed. Results: Histologic examination revealed thickening of the alveolar wall and enhanced alveolar neutrophil infiltration in the CPB group (P < 0.05) compared with those in the control group, which was prevented by EGCG (P < 0.05). In the CPB group, higher formation of poly(ADP-ribose) and nuclear translocation of apoptosis-inducing factor were detected in comparison with those in the control group (P < 0.001), which were both reduced in the CPB + EGCG group (P < 0.001). Compared with the control group, the EGCG-control group showed thickening of the alveolar wall and increased neutrophil infiltration (P < 0.05). Conclusions: CPB leads to lung edema, pulmonary neutrophil infiltration, and presumably initiation of poly(ADP-ribose) polymerase-dependent cell death signaling in the lung. EGCG appears to attenuate CPB-associated lung injury, suggesting that this may provide a novel pharmacologic approach.

La Poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines, impliquée dans un grand nombre de processus biologiques, dont la réparation de l’ADN. Alors que la fonction et le mode d’action de la Poly(ADP-ribose) (PAR) Polymérase 1 (PARP1), activée en réponse aux dommages de l’ADN sont bien compris, on en sait beaucoup moins sur la fonction et la régulation de l’enzyme de dégradation du PAR, la Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Dans le contexte de ce projet de thèse, nous décrivons de nouvelles lignées U2OS stables, déficientes pour toutes les isoformes de PARG, permettant la complémentation inductible avec chacun des isoformes de PARG. Ces modèles nous ont permis d’évaluer les contributions relatives des isoformes à la réparation de dommages à l’ADN. Nous avons identifié un nouveau partenaire cellulaire de PARG : la protéine-kinase dépendante des dommages à l’ADN (DNA-PK). Nous explorons l’interaction fonctionnelle de ces deux protéines dans le contexte de la réponse cellulaire à la camptothécine (CPT), un agent anticancéreux inhibant la topoisomérase I et provoquant l’activation simultanée de PARP1 et DNA-PK. / Poly (ADP-ribosyl) ation is a post-translational modification of proteins involved in a large number of biological processes, including DNA repair. While the function and mode of action of Poly (ADP-ribose) (PAR) Polymerase 1 (PARP1), activated in response to DNA damage, is well understood, much less is known about the function and regulation the PAR degrading enzyme, Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). In the context of this thesis project, we describe new stable U2OS lines, deficient for all PARG isoforms, allowing the inducible complementation with each of the PARG isoforms. These models allowed us to evaluate the relative contributions of the isoforms to DNA damage repair. We have identified a new cellular partner of PARG: the DNA-dependent protein kinase-dependent kinase (DNA-PK). We explore the functional interaction between these two proteins in the context of the cellular response to camptothecin (CPT), an anticancer drug that inhibits topoisomerase I and induces the simultaneous activation of PARP1 and DNA-PK.