Poly(ADP-ribose) polymerases belong to a family of proteins with 17 members in human beings. PARP1, the founding member of the family is a protein that synthesizes linear or branched polymers of ADP-ribose on itself or on target proteins. Different members of this family, that do not all possess ADP-ribosyl polymerase activity, are involved in the regulation of various cellular mechanisms. Some members of the family are particularly involved in the positive or negative control of the immune response. PARP1 is a key player in the regulation of inflammation, through its positive control of cell death and of proinflammatory cytokine production. On the other hand, the tankyrases (PARP5a and PARP5b) and PARP14 seem to regulate inflammatory responses in a negative fashion. PARP12 is a poorly characterized member of the family, whose expression is greatly increase following stimulation with type-I interferons, cytokines mainly involved in antiviral defences.<p>PARP12 is a protein that possesses three main domains: A putative RNA binding N-terminal domain composed of tandem CCCH zinc-fingers, a central WWE domain and a C-terminal PARP catalytic domain. In this work, we have shown that the expression of PARP12 is strictly-dependent on type-I interferons, that it possesses ADP-ribosyl transferase activity and that in can regulate the translation of messenger RNA into proteins. PARP12 can be found in stress granules, sites of storage of untranslated mRNAs, and is capable of directly inhibiting the translation of a reporter mRNA when tethered to it, in a manner dependent on its catalytic activity. Furthermore overexpression of wild-type PARP12, in contrast to overexpression of a mutant with no detectable catalytic activity (PARP12-G575W), leads to a general arrest of most cellular translation.<p>On the other hand, we have shown that PARP12 can activate the transcription of genes under the control of an NFκB-dependent promoter, especially when its zinc-fingers are deleted or mutated (PARP12ΔZnF). PARP12ΔZnF is located in structures that can enclose TRIF, RIP1, NEMO, p62/SQSTM1 and ubiquitin. These proteins have all possess an important role in the activation of NFκB signalling cascades. Moreover, we have shown that endogenous PARP12 is situated in ALIS (Aggresome-Like Induced Structures) in LPS-stimulated macrophages. These structures have a possible role in the presentation of antigens on class I major histocompatibility complexes, implying that PARP12 may be involved in the regulation of antigen presentation. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’ADN contient l’information génétique essentielle au développement et au bon fonctionnement de tout organisme vivant. Cependant, l’ADN peut être endommagé ou modifié par une exposition régulière à différents facteurs tels que la lumière du soleil, la pollution, la radiation, etc. La cellule a ainsi développé des mécanismes de réparation très efficaces puisqu’un ADN sain est essentiel pour la santé d’un organisme. La protéine humaine PARP1 est une enzyme clé de la réparation de l’ADN. PARP1 détecte rapidement les dommages à l’ADN en s’y liant, ce qui stimule son activité catalytique. PARP1 catalyse la formation de chaînes d’ADP-ribose qui sont ajoutées à PARP1, ainsi que d’autres protéines, en tant que modification post-traductionnelle. Les chaînes d’ADP- ribose permettent la décondensation de la chromatine ainsi que le recrutement de facteurs de réparation à l’ADN endommagé. PARP1 possède plusieurs domaines régulateurs en plus de son domaine catalytique, le domaine catalytique lui-même se divisant en un domaine hélicoïdal (HD) ainsi qu’un domaine ADP- ribosyltransférase. L’augmentation de l’activité catalytique de PARP1, à la suite de sa liaison à l’ADN endommagé, implique qu’un signal allostérique se transmette à travers ses différents domaines. Le HD joue un rôle essentiel dans le relais de cette communication allostérique puisque c’est ultimement un changement de conformation du HD (i.e « ouverture ») qui révèle le site actif et active l’enzyme. De plus, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP1 peuvent moduler l’affinité de l’enzyme pour l’ADN endommagé. Certains inhibiteurs peuvent ainsi provoquer la « capture » de l’ADN par PARP1, un phénomène qui requiert la présence du HD et qui est particulièrement toxique pour les cellules cancéreuses présentant des défauts de réparation de l’ADN. Pour cette raison, la mort cellulaire induite par les inhibiteurs de PARP1 est un traitement prometteur et quatre inhibiteurs sont déjà utilisés pour traiter le cancer des ovaires et du sein. Cependant, le mécanisme précis derrière la capture de l’ADN par PARP1 est encore nébuleux et nécessite de plus amples recherches. Puisque la capture de l’ADN par PARP1 requiert le relais d’un signal allostérique par le HD, et que l’ouverture du HD participe à cette communication, il est donc essentiel de comprendre les changements de conformations effectués par ce domaine. Nous avons ainsi obtenu pour la première fois une structure atomique de PARP1 en conformation active. Celle-ci montre que l’ouverture du HD amène la formation d’une interface additionnelle entre ce domaine et les autres domaines régulateurs de PARP1. Ainsi, entraver la formation de cette nouvelle interaction, par des mutations ponctuelles, diminue grandement l’activité catalytique de PARP1 lié à l’ADN, ce qui suggère que l’interface participe à la communication allostérique de l’enzyme. Tel que mentionné plus haut, les inhibiteurs de PARP1 peuvent moduler de manières différentes l’affinité de PARP1 pour les dommages à l’ADN et ainsi influencer distinctement la communication allostérique de l’enzyme. Nous avons caractérisé une nouvelle série d’inhibiteurs de PARP1 et évalué leur capacité à moduler l’affinité de PARP1 pour l’ADN endommagé. Nos travaux démontrent qu’un inhibiteur volumineux occupant le site actif n’augmentera pas nécessairement l’affinité de PARP1 pour les dommages à l’ADN. Leur capacité à favoriser la capture de l’ADN dépend plutôt de leur interaction avec la région du HD voisine au site actif. En résumé, nos travaux participent à l’amélioration des connaissances concernant l’activation catalytique de PARP1 et la communication allostérique. Une meilleure compréhension de l’allostérie de PARP1 permettra la conception de médicaments ayant la toxicité désirée pour tuer les cellules cancéreuses. / DNA contains the genetic instructions for the development and proper function of all living organisms. However, DNA can be broken and modified in harmful ways through daily exposures to exterior stresses such as sun light, pollution, radiation, etc. Since stable and undamaged DNA is essential for the health of an organism, cells have developed repair mechanisms to ensure that DNA damage is taken care of efficiently. The human protein PARP1 is a key enzyme that contributes to DNA repair. PARP1 rapidly detects DNA lesions which greatly stimulates its catalytic activity. PARP1 catalyzes the formation of chains of ADP-ribose that are attached covalently to PARP1 itself, or other target proteins, as a posttranslational modification. The chains of ADP-ribose allow for the recruitment of chromatin remodelling factors and repair factors to process the DNA lesions. PARP1 carries multiple regulatory domains in addition to its catalytic domain, with the catalytic domain itself composed of the helical domain (HD) and the ADP-ribosyltransferase fold. DNA damage binding greatly stimulates PARP1 catalytic activity, which requires that an allosteric signal is relayed across the enzyme’s domains. Interestingly, the HD has been found to play an essential role in the PARP1 allostery. The HD undergoes a change of conformation (i.e. opening) following PARP1 DNA damage binding which reveals the active site. Additionally, inhibitors binding the active site of the enzyme can modulate PARP1 DNA binding affinity. Some inhibitors can induce PARP1 DNA “trapping”, a phenomenon that requires the HD and appears particularly toxic to cancer cells bearing DNA repair deficiencies. Cell death induced by PARP1 inhibitors is a promising cancer treatment and four inhibitors have approval for clinical use against ovarian and breast cancers. However, the precise mechanism underlying PARP1 trapping on DNA is still unclear and requires further research. Since PARP1 trapping requires the presence of the HD, and that the HD opening is involved in relaying the allosteric signal, it remains essential to characterize its change of conformation. We have obtained for the first time atomic structures of PARP1 in a catalytically active state. Crystal structures show that the HD in open conformation forms an additional interdomain interface. Mutating this interface prevents PARP1 strong catalytic activation following DNA damage binding, suggesting that the allosteric communication is impaired. Additionally, these structures reveal how the HD active conformation leads to the reveal of the active site in the ART domain. As mentioned above, PARP1 inhibitors can modulate the enzyme’s DNA binding affinity and therefore impact its allosteric communication. We have characterized a series of novel inhibitors and tested their propensity to increase PARP1 DNA binding affinity. Our work highlights that bulky inhibitors that fill the active site will not necessarily promote PARP1 affinity for DNA lesions. Rather, it appears that inhibitors may trigger DNA trapping via their interaction with a neighboring region of the HD. Overall, our work deepens our understanding of PARP1 catalytic activation and allosteric communication. Properly understanding how PARP1 trapping occurs will help the design of specific drugs with the desired toxicity to kill cancer cells.

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Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé publique, puisqu’ils représentent la 3ème cause de mortalité dans les pays industrialisés. À l’heure actuelle, l’activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA) est le seul traitement pharmacologique à la phase aiguë des AVC ischémiques. Il s’agit d’un thrombolytique dont l’utilisation reste très limitée (<2% des patients). En effet, quand le rt-PA est administré au-delà de 4h30, aucune récupération fonctionnelle n’est observée chez le patient. De plus, les données cliniques et expérimentales ont montré que l’administration du rt-PA augmente fortement la survenue de transformations hémorragiques. Il apparaît donc indispensable de développer des stratégies permettant, d’une part, de s’opposer à ces transformations hémorragiques, et d’autre part, d’augmenter la fenêtre thérapeutique du rt-PA. Au vu de ces données, mon travail a consisté à préciser l’intérêt thérapeutique d’inhiber une enzyme, la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) pour s’opposer aux effets délétères du rt-PA au niveau vasculaire. Ces études ont été menées sur un modèle d’ischémie cérébrale thromboembolique réalisé chez la souris, consistant en une injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. Dans un 1er temps, nous avons caractérisé ce modèle, récemment décrit dans la littérature (2007) et nouveau dans notre laboratoire. Nos travaux ont montré pour la première fois que, dans ce modèle, le rt-PA à la dose de 0,9 mg/kg (dose utilisée chez l’homme) reproduit fidèlement les « 2 visages » du thrombolytique en clinique : la thrombolyse précoce (30 min après l’ischémie) est associée à des effets bénéfiques, en réduisant le déficit neurologique, le volume de la lésion et l’œdème cérébral, alors que l’administration tardive de rt-PA (4h après l’ischémie) entraîne une aggravation des transformations hémorragiques et une perte de l’amélioration fonctionnelle. Dans un 2ème temps, nous avons étudié l’implication de la PARP dans les transformations hémorragiques induites par l’administration tardive de rt-PA. Le traitement par le PJ34(1 et 3 mg/kg), un puissant inhibiteur de cette enzyme, réduit la dégradation des protéines de jonction de la barrière hémato-encéphalique et les transformations hémorragiques induites par le rt-PA. De plus, le PJ34 s’oppose non seulement à la toxicité vasculaire du rt-PA, mais réduit également le déficit neurologique, le volume de la lésion et l’œdème cérébral. En conclusion, l’ensemble de ce travail montre que l’inhibition de la PARP prolonge la fenêtre thérapeutique du rt-PA et permet une thrombolyse « sécurisée ». Cette stratégie pourrait être mise en place de manière précoce après l’ischémie (avant même l’arrivée du patient à l’hôpital) et augmenter le nombre de patients pouvant bénéficier d’une thrombolyse. / Stroke is the third leading cause of death worldwide and a major cause of disability. Tissue plasminogen activator (rt-PA) is the only approved treatment in the United States and Europe for acute ischemic stroke. Clinical data show that beyond its therapeutic time window (4.5 hours after stroke onset), rt-PA exerts no more neuroprotective effects. Furthermore, clinical data showed that rt-PA increases the hemorrhagic transformations. Therefore, there is a critical need to develop a novel drug that can reduce rt-PA’s deleterious effects and extend its therapeutic window. The aim of the present study was to examine whether Poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) mediates the hemorrhagic transformations induced by rt-PA administration. We used a mouse model of thromboembolic stroke, which consists of a microinjection of thrombin in the middle cerebral artery. First, we showed that in the mouse thrombin stroke model, the "human" dose of rt-PA exhibits effects close to those observed in clinic. Later, we showed PARP is implicated in the vascular toxicity of rt-PA after cerebral ischemia. PJ34, a PARP inhibitor, preserves the blood brain barrier integrity, reduces rt-PA-induced hemorrhagic transformations, improves neurological outcomes and reduces brain infarction and edema. In conclusion, this work showed that PARP inhibitors could be relevant candidates to extend the therapeutic time window of rt-PA after stroke without increasing the risk of hemorrhagic transformations.

Le stress oxydant (SO) est un mécanisme commun à l’ischémie cérébrale et au traumatisme crânien qui entraîne notamment l’hyperactivation délétère de la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP), une enzyme NAD+-dépendante. Cette dernière est impliquée dans le déficit neurologique et la lésion cérébrale consécutifs à ces pathologies. In vitro, l’hyperactivation de la PARP diminue le taux cérébral de NAD+, son substrat, et l’activité de la sirtuin 1 (SIRT1), une enzyme également NAD+-dépendante. L’activation de la SIRT1 est bénéfique au cours d’un SO in vitro. Si les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP ont été démontrés in vivo au cours d’un SO cérébral, l’implication de la SIRT1 ainsi que son rôle dans les effets de l’inhibition de la PARP n’ont pas été explorés. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence qu’un modèle de SO cérébral induit in vivo chez le rat par une injection intrastriatale de malonate entraîne un SO prolongé, un déficit neurologique et une activation de la PARP associée à une diminution du NAD+. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré que le 3-aminobenzamide (3AB), un inhibiteur de la PARP, ne permet pas de s’opposer à la chute du NAD+ dans ce modèle, ce qui suggère que le NAD+ pourrait être consommé par d’autres enzymes NAD+-dépendantes, dont la SIRT1. L’inhibition de la PARP par le 3AB a permis d’augmenter le rapport activité/expression nucléaire de la SIRT1 et a entraîné sa translocation cytoplasmique au cours du SO. Un prétraitement par le SRT1720, un activateur spécifique de la SIRT1, diminue le déficit neurologique et la lésion striatale 6 heures après le SO cérébral, ce qui suggère que l’activation de la SIRT1 est bénéfique dans les conséquences d’un SO cérébral in vivo. L’association de l’inhibiteur de la PARP avec l’activateur de la SIRT1 (3AB+SRT1720) n’a pas potentialisé les effets protecteurs de chaque monothérapie. L’EX527, un inhibiteur de la SIRT1, ne modifie pas le déficit et la lésion. En revanche, l’association de l’inhibiteur de la PARP avec l’inhibiteur de la SIRT1 (3AB+EX527) supprime la récupération neurologique ainsi que la réduction de la lésion, induites par l’inhibition de la PARP seule (3AB). Ces données suggèrent que l’activation de la SIRT1 est impliquée dans les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP in vivo au cours d’un SO cérébral. En conclusion, l’ensemble de ce travail a permis une meilleure caractérisation de la PARP et de la SIRT1 au cours d’un SO cérébral in vivo. La SIRT1 pourrait constituer une cible pharmacologique pour le traitement des pathologies cérébrales au cours desquelles un SO est présent. De plus, nous avons montré que les effets bénéfiques de l’inhibition de la PARP sur les conséquences fonctionnelles et histologiques induites par le SO cérébral sont liés à l’activation de la SIRT1. / Oxidative stress (OS) is involved in cerebral ischemia and traumatic brain injury and results in deleterious activation of poly(ADP-ribose)polymerase (PARP), an NAD+-dependant enzyme. PARP is implicated in neurological deficit and brain injury post-ischemia and post-trauma. In vitro, PARP overactivation reduced both brain NAD+ levels, its substrate, and activity of sirtuin 1 (SIRT1), an other NAD+-dependant enzyme. SIRT1 activation is beneficial during in vitro OS. Even if the beneficial effects of PARP inhibition have been demonstrated, SIRT1 involvement during in vivo cerebral OS and its role in the beneficial effects of PARP inhibition have not been studied.In the first part, we demonstrated that in vivo cerebral OS induced by intrastriatal injection of malonate in rat promoted prolonged OS, neurological deficit, PARP activation and NAD+ decrease. In the second part, we showed that 3-aminobenzamide (3AB), a PARP inhibitor, did not reduce NAD+ loss, suggesting that NAD+ could be consumed by other NAD+-dependant enzymes, including SIRT1. The PARP inhibitor increased the nuclear SIRT1 activity/expression ratio and induced its cytoplasmic translocation during OS. SRT1720, a specific SIRT1 activator, reduced both neurological deficit and striatal lesion 6 hours after cerebral OS, suggesting that SIRT1 activation is beneficial on in vivo OS consequences. The combination of the PARP inhibitor with the SIRT1 activator (3AB + SRT1720) did not potentiate the neuroprotective effects of each strategy. EX527, a SIRT1 inhibitor, did not affect OS-induced deficit and lesion. However, association of the PARP inhibitor with the SIRT1 inhibitor (3AB + EX527) suppressed the neurological recovery and the reduction of lesion induced by 3AB alone. Our data suggested that SIRT1 activation is involved in the neuroprotective effects of PARP inhibition during in vivo cerebral OS. In conclusion, our work led to a better characterization of PARP and SIRT1 during in vivo cerebral OS. SIRT1 is a potential pharmacological target for the treatment of brain pathologies in which OS is present. In addition, SIRT1 activation is involved in the beneficial effects of PARP inhibition on functional and histological cerebral OS consequences

Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl &#946; - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.

Macrófagos infectados com Leishmania são protegidos de apoptose, entretanto não se conhece o mecanismo de transdução de sinal intracelular que interfere neste processo de morte. Neste trabalho, células J 774 em cultura, com privação de nutrientes, sofrem apoptose, a qual aumenta na presença dos indutores camptotecina (CPT) ou fator de necrose tumoral recombinante (rTNF). Estas células quando infectadas com amastigotas ou promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (5 parasitos/uma célula) são protegidas de apoptose. Avaliando as possíveis vias intracelulares envolvidas nesse processo, observamos que a privação de nutrientes altera o potencial de membrana da mitocôndria, havendo reversão com a infecção tanto com promastigotas e amastigotas, entretanto a reversão da alteração do potencial de membrana induzida por rTNF só foi observada com infecção com promastigotas. Tanto a atividade de caspase 3, como a detecção de caspase 3 clivada induzidas por H202 são revertidas com a infecção com promastigotas ou amastigotas. Quando analisamos a expressão de poli (ADP ribose) polimerase (PARP), em relação às células sem indução, a indução por CPT não levou ao aumento da PARP de 116 kDa, mas, aumento da banda de 24 kDA. Por outro lado, a infecção por amastigota de Leishmania (L.) chagasi em células J774 levou à diminuição da expressão de PARP de 116 kDa, mas aumento da de 24 kDa. Nas células infectadas por promastigotas de Leishmania (L.) chagasi, observamos uma diminuição da banda de 116 kDa, aparecimento de uma molécula de 89kDa e diminuição da expressão da de 24 kDa. Nas células sob indução por CPT, a infecção levou a resultados similares, exceto a diminuição da molécula de 24 kDa quando infectado por amastigota. Avaliando-se a influência da proteína do choque térmico de 83 kDa de Leishmania infantum, como possível fator que interferiria no processo de apoptose, observamos que a fagocitose de bactérias Escherichia coli (M15) contendo plasmídio com gene de HSP83 expressando essa proteína, leva a diminuição da apoptose nessas células, mesmo quando induzidas por CPT ou rTNF. Nossos dados mostram que a infecção de macrófagos J774 in vitro por Leishmania (L.) chagasi, interfere no processo de apoptose afetando diversas vias de sinalização intracelular de apoptose, tanto extrínsecas quanto intrínsecas, sendo que promastigota é mais efetiva em inibir apoptose nesta linhagem macrofágica. / Macrophages infected by Leishmania are protected from apoptosis, however the mechanism of intracellular signal transduction that interferes in this death process remains unknown. In this work, J774 cells in culture, under nutrient deprivation undergo apoptosis, which is increased in the presence of inducers: camptothecin (CPT) or recombinant tumoral necrosis factor (rTNF). These cells infected by amastigotes or promastigotes of Leishmania (L.) chagasi (5 parasites per cell) are protected from apoptosis. Evaluating the possible intracellular pathways involved in this process, we observed nutrient deprivation alters the mitochondrial membrane potential, reversed by both amastigote and promastigote infection, in contrast, mitochondrial membrane potential was altered by rTNF and it was reversed only by promastigotes. Both caspase 3 activity and caspase 3 cleavage detection induced by H2O2 are reversed with amastigote or promastigote infection. When we analysed the expression of poly (ADP-ribose) polymerase, related to no induced cells . CPT induction didnLt increase 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Otherwise, Leishmania (L.) chagasi amastigote infection in J774 cells decreased 116 kDa PARP, but increased a 24 kDa fragment. Incells infected by Leishmania (L.) chagasi , we observed a decrease of 116 kDa fragment, appearance of a 89 kDa fragment and a decreasing of a 24 kDa fragment. In the cells under CPT induction similar results were found, except a decreasing of a 24 kDa when infected by amastigote. Evaluating the Leishmania (L.) infantum Heat Shock Protein of 83 kDa, as a possible factor that interferes in the apoptosis process, we observed that a phagocytosis of Escherichia coli (M15) bacteria with a HSP83 gene within a plasmid expressing this protein induced by isopropyl &#946; - D- tiogalactopiranosideo (IPTG), considerably diminished apoptosis in these cells even when induced by CPT or rTNF. Our data show that Leishmania (L.) chagasi infection in J774 macrophages in vitro notoriously interferes in the apoptosis process affecting several intracellular pathways involved in both extrinsic and intrinsic pathways, more prominently with promastigote in this macrophage cell lineage.

L’ostéonécrose (ON) et les fractures (FR) sont des complications qui prennent de plus en plus place dans le traitement pédiatrique de la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL). L’ON peut être causée par différents facteurs, dont principalement l’utilisation de glucocorticoïdes. Les glucocorticoïdes sont administrés lors du traitement de la leucémie dans le but d’initier l’apoptose des cellules malignes tout en ayant un effet anti-inflammatoire. Cependant, l’utilisation de ces corticostéroïdes comprend des effets secondaires sérieux, notamment le développement d’ostéonécrose. Des variantes génétiques peuvent mettre certains patients plus à risque que d’autres. Plusieurs gènes ont déjà été signalés comme régulés par les actions glucocorticoïdes (GC). Les variations génétiques présentes dans les régions régulatrices de ces gènes peuvent affecter leur fonctionnement normal et, en fin de compte, de déterminer un risque accru de développer l’ON associé au traitement contre la leucémie. Pour cette raison, plusieurs polymorphismes ont été identifiés et étudiés dans la cohorte QcALL de Ste-Justine, concernant les gènes suivants : ABCB1, ACP1, BCL2L11, NFKB1, PARP1, et SHMT1. Ces gènes jouent majoritairement un rôle dans les mécanismes d’action des glucocorticoïdes, mais quelques-uns ont plutôt un effet direct sur le développement d’ostéonécrose. Nos recherches ont démontré une corrélation entre ces polymorphismes et l’apparition d’ostéonécrose chez les patients de la cohorte QcALL, traités aux glucocorticoïdes. L'incidence cumulative de l'ostéonécrose a été évaluée rétrospectivement chez 305 enfants atteints de la leucémie qui ont subi un traitement à l’hôpital Ste-Justine selon les protocoles DFCI de Boston (87-01, 91-01, 95-01 et 2000-01). Parmi les huit polymorphismes de BCL2L11 étudiés, les 891T> G (rs2241843) et 29201C> T (rs724710) ont été significativement associés à ON (p = 0.01 et p = 0.03, respectivement). L'association du polymorphisme 891T> G a été modulée par le type de corticostéroïde (CS), l’âge, le sexe et le groupe à risque (p ≤ 0,05). Le polymorphisme 29201C> T était particulièrement apparent chez les patients à haut risque (p = 0,003). La même étude était conduite en parallèle sur des patients de la cohorte DFCI de Boston (N = 192), et montrait des résultats significatifs pour les polymorphismes étudiés. En conclusion, les résultats de cette étude permettront de confirmer l’association de ces polymorphismes au développement d’ON chez les patients de LLA traités aux GC. / Osteonecrosis (ON) and fractures (FR) are complications that take place in the treatment of children acute lymphoblastic leukemia (cALL). They can be caused by various factors, mainly using glucocorticoids. The corticosteroids, dexamethasone (DXM) and prednisone (PDN) are administered during the treatment of leukemia to initiate apoptosis of malignant cells; while having an anti-inflammatory effect. However, the use of these corticosteroids has severe side effects, including the development of osteonecrosis. Moreover, some patients develop resistance to treatment, and are at risk of developing side effects. The genetic variants predispose some patients at higher risk than others. Several genes have been previously reported as up- or down regulated by the GCs actions. The genetic variations present in gene coding or regulatory regions can affect their function and ultimately determine an increased risk of developing ON associated to ALL therapy. Therefore, we investigated the association between several single nucleotide polymorphisms (SNPs) in six candidate genes: BCL2L11, NFKB1, PARP1, ABCB1, ACP1, and SHMT1. These genes play a role in the mechanisms of action of glucocorticoids, but some have more of a direct effect on the development of osteonecrosis. Our research has shown a correlation between these polymorphisms and the occurrence of osteonecrosis in patients in the QCALL cohort, treated with glucocorticoids. Cumulative incidence of osteonecrosis was assessed retrospectively in 305 children with ALL who underwent treatment with DFCI protocols (87-01, 91-01, 95-01 and 2000-01) in childhood ALL cohort from Quebec (QcALL). Among the eight tag BCL2L11 polymorphisms studied the 891T>G (rs2241843) and 29201C>T (rs724710) were significantly associated with ON (p = 0.01 and p = 0.03, respectively). Association of 891T>G polymorphism was modulated by type of corticosteroid (CS), age, sex and risk group (p ≤ 0.05 and that of 29201C>T was particularly apparent among high risk (p = 0.003) patients. These polymorphisms have shown significant ON association in several QcALL risk groups, mainly in corticosteroid groups, age < 10 years, and high risk (HR) group. Furthermore, the same study was conducted in parallel with patients in the replication (DFCI) cohort (N = 192), and we showed significant genetic association results for all studied polymorphisms. In conclusion, this study identifies that some ALL children have a high incidence of ON during the treatment that is highly associated with polymorphisms in different genes regulated by corticosteroids and ALL prognostic factors.