L’étude des polysaccharides de Plantago notata Lagasca. (Plantaginaceae) et Urginea noctiflora Batt. et Trab (Liliaceae), deux plantes spontanées à caractère médicinal récoltées au Sahara Septentrional Est Algérien, a permis d’isoler plusieurs fractions polysaccharidiques hydro- et alcali-solubles. Les analyses de la composition globale de ces fractions ont montré que l’extrait des graines de P.notata est la fraction la plus riche en oses totaux (85,55 %). Cette étude a consisté essentiellement en à définir les conditions d’extraction des polysaccharides hydro solubles, à en identifier la structure, à en caractériser les propriétés physico-chimiques et à explorer les activités biologiques. Ce travail a conduit à l’identification d’un hétéroxylane de haute masse molaire (2,3 x 106 g/mol). Ce polysaccharide est constitué d’une chaîne principale de β-(1,3)-d-Xylp et β-(1,4)-d-Xylp substituée en positions O-2 et O-3 de β-(1,4)-d-Xylp par des chaines latérales et des monosaccharides terminales  comme α-l-Araf-(1,3)-β-d-Xylp, β-d-Xylp-(1,2)-β-d-Xylp, T-Xylp ou T-Araf. L’analyse physico-chimique de ce polysaccharide dans des régimes dilués et semi-dilués a montré que l’hétéroxylane présente un comportement rhéofluidifiant, ayant des propriétés de gel faible. La mise en œuvre de la digestibilité de cette hétéroxylane a conduit à l’obtention d’un polymère non digestible avec des propriétés prébiotiques. / The study of polysaccharides of Plantago notata Lagasca (Plantaginaceae) and Urginea noctiflora Batt. and Trab (Liliaceae), two spontaneous medicinal plants harvested from East Septentrional Algerian Sahara, allowed to isolate several hydro-and alkali-soluble polysaccharides fractions. Chemical composition analyses of these fractions showed that P.notata seeds extract was the fraction that have the highest neutral sugars composition (85.55%). In this study we have defined an extraction procedure to collect water-soluble polysaccharides and characterized their structure, prior to investigate their physico-chemical properties and biological activities. Structural analyses have revealed that P.notata polysaccharide is a heteroxylan with a backbone composed of β-(1,3)-d-Xylpand β-(1,4)-d-Xylp. The backbone might be highly branched, through O-2 and O-3 positions of β-(1,4)-d-Xylp by various side chains and terminal monosaccharides such as α-l-Araf-(1,3)-β-d-Xylp, β-d-Xylp-(1,2)-β-d-Xylp, T-Xylp or T-Araf. The physico-chemical analysis of this polysaccharide in dilute and semi- diluted regimes showed that this heteroxylan exhibited a molecular weight of 2.3 x 106 g/mol and a pseudoplastic behavior. The use of the digestibility of this heteroxylan has led to the production of a non-digestible polymer with prebiotic properties.

Les exopolysaccharides (EPS) produits par les bactéries lactiques ont longtemps été considérés comme des composés indésirables dans le vin. En effet, le β-glucane produit par certaines souches bactériennes est responsable d’une altération qui rend le vin impropre à la consommation. Cependant, les polysaccharides produits par Oenococcus oeni, principale espèce de la fermentation malolactique (FML) qui est une étape essentielle participant à la stabilisation et la qualité du vin, n’ont jamais été associés à un quelconque défaut. Notre premier objectif était d'identifier le matériel génétique impliqué dans la production de polysaccharides, en termes d'évolution phylogénétique et de diversité, parmi une collection de 50 souches d’O. oeni. L'analyse bioinformatique des 50 séquences génomiques a révélé la présence de deux loci organisés en opéron et potentiellement impliqués dans la production d'hétéropolysaccharides, mais aussi la présence de gènes isolés de glycosyltransférases et glycosides hydrolases impliqués dans la synthèse d’homopolysaccharides. L’ensemble des souches analysées présentent au moins une des voies de biosynthèse des EPS, suggérant un rôle essentiel chez O. oeni. Par la suite, une approche biochimique des polysaccharides produits a été mise en place et a permis de confirmer les données génomiques. Une glycosyltransférase membranaire, jouant un rôle clé dans la production d'EPS, a été caractérisée afin de mieux comprendre le mécanisme de la synthèse EPS. Par ailleurs, l’étude physiologique des polysaccharides produits a révélé l’existence de deux phénotypes (forme libérée et capsulaire), chacun jouant un rôle dans la survie et l’adaptation de la bactérie au vin et au procédé de lyophilisation industriel, forme sous laquelle les souches commerciales sont proposées pour induire la FML. / Exopolysaccharides (EPS) of lactic acid bacteria have long ago been undesirable in wine. Indeed, β-glucan produced by certain strains of bacteria provokes wine spoilage and makes the wine commercially defective. However, the polysaccharides produced by Oenococcus oeni which is the main species to drive malolactic fermentation (MLF), an essential step for wine stabilization and quality improvement, are not to be blamed for any spoilage effect. Our first aim was to identify the genetic material implicated in polysaccharides production, in terms of phylogenetic evolution and diversity among the strains of our collection. The bioinformatic analysis of 50 O. oeni genomic sequences revealed the presence of two organized loci potentially implicated in the production of heteropolysaccharides and also the presence of isolated genes of glycosyltransferases and glycoside-hydrolases implicated in the production of homopolysaccharides. The presence of at least one biosynthetic pathways in all the strains tested shows the importance of the polysaccharides genes for Oenococcus oeni. Thereafter, we reached-up a biochemical approach of the produced polysaccharides, confirming the results of the bioinformatics research. Initially we characterized a membrane glycosyltranferase, playing a key role in the EPS production. The results allow us to better understand the mechanism of the EPS synthesis. Furthermore the physiology of the produced polysaccharides showed two possible phenotypes (liberated and capsular form) each one playing his role for the bacterial survival at his natural environment (wine) as well as at industrial level (production of malolactic starters).

Ce travail porte sur la préparation, la caractérisation physico-chimique et l'évaluation biopharmaceutique de Microparticules Lipidiques Solides Composites (MLSC) innovantes assurant la gastrorétention et la libération progressive d'un principe actif modèle hydrophobe, l'ibuprofène. Une méthode d'émulsification à chaud est utilisée pour préparer ces MLSC, stabilisées par des nanoparticules de silice Aérosil® d'hydrophobie variée, selon le principe des « émulsions de Pickering », en remplacement de surfactifs organiques. Ces nanoparticules inorganiques se retrouvent en surface et dispersées au coeur des MLSC dans tous les cas. L'utilisation d'Aérosil® hydrophobe permet la formation de MLSC homogènes de plus de 100 µm de diamètre. Il est à noter que la présence de silice, en fonction de la charge en ibuprofène, a une influence certaine sur les cinétiques de libération du principe actif, que ce soit dans le PBS de pH 7.4 ou le milieu gastrique simulé de pH 1.2, principalement en modulant la taille des microparticules. Elle permet aussi de stabiliser sur une période de 6 mois les propriétés physico-chimiques et biopharmaceutiques des MLSC, d'améliorer leurs propriétés d'usage, comme l'écoulement, la résistance à l'écrasement et la flottaison dans un milieu gastrique simulé. Enfin, le recouvrement des MLSC par des polysaccharides assure la bioadhésion sur des membranes biologiques simulées à base de mucine en accélérant le plus souvent la libération de l'ibuprofène. Néanmoins, la stabilisation de MLSC avec des nanoparticules de silice dispersées au sein de matrices d'alginate gélifiées au CaCl2 avant lyophilisation constitue une nouvelle voie prometteuse pour la libération prolongée de principe actif hydrophobe dans l'estomac car ce polymère assure leur bioadhésion sur plus de 4h sans toutefois modifier le profil de libération de l'ibuprofène. / The aim of this work consists in the preparation, physic-chemical characterization and biopharmaceutical evaluation of innovative Composite Solid Lipid Microparticles (CSLM), allowing gastroretention and extended-release of a model hydrophobic drug, ibuprofen. Hot Melt emulsification's method is used to prepare these CSLM, stabilized by Aerosil® nanoparticles of various hydrophobicity as “emulsion of Pickering” instead of using an organic surfactant. Nanoparticles of silica take place on surface and are dispersed into CSLM in all cases. Using hydrophobic Aerosil allow the preparation of homogeneous over 100µm size CSLM. Presence of silica depending on the charge of ibuprofen influences the ibuprofen kinetics of release in both PBS ph 7.4 and simulated gastric fluid pH 1.2 by modulating the size of microparticles. Silica nanoparticles are also able to stabilize on a period of over 6 months the physic-chemical and biopharmaceuticals properties of CSLM, to improve their use properties, as helping free-flowing, enhancing crushing strength, and floating of CSLM in simulated gastric fluid. Finally CSLM coating with polysaccharides allows their bioadhesion on mucine simulated biological membrane, with an increased ibuprofen kinetics of release in most of the cases. Nevertheless, silica nanoparticles stabilized CSLM dispersed in CaCl2 gelified alginate matrices before freeze drying represent a new promising way for the extended release of hydrophobic drugs in stomach because this polymer can promote their bioadhesion for more than 4h without any change in the kinetics of ibuprofen release.

Les polysaccharides sont des composants majeurs des parois cellulaires ayant une structure dynamique et jouant un rôle essentiel dans la croissance des plantes. Les cellules épidermiques du tégument des graines d’Arabidopsis libèrent un halo de mucilage polysaccharidique lors de leur imbibition. Le mucilage séminal s'est avéré être un excellent système modèle pour l’étude de la production, des propriétés des polysaccharides et de leurs interactions. Le premier objectif de ma thèse était de valoriser la variabilité naturelle existant entre accessions d’Arabidopsis pour identifier de nouveaux gènes contrôlant la production de mucilage. Une analyse de génétique d’association a permis l’identification d’une amine oxidase et d’une glycosyltransferase putatives dont j’ai confirmé l’implication dans la biosynthèse des pectines du mucilage.J’ai également associé une famille de protéines aux interactions entre polysaccharides. De part ses propriétés d’hydrogel, le mucilage joue un rôle adaptatif et influence la physiologie de la graine. Il permet la rétention d’eau autour de celle-ci et pourrait ainsi influencer sa longévité. Le deuxième objectif de ma thèse était d’utiliser des mutants impactés dans la production de mucilage pour déterminer si ce dernier influence la longévité des graines après un traitement d’hydratation contrôlée appelé ‘priming’. Les graines ne libérant pas de halo de mucilage à l’imbibition ont une meilleure longévité en lien avec une diminution réduite d’acide salicylique. Mes résultats participent à une compréhension intégrée de la production de mucilage à plusieurs niveaux : écologiques, génétiques et physicochimiques. / Polysaccharides are the major component of cell walls that are dynamic structures playing a fundamental role in plant growth. On imbibition, the epidermal cells of the Arabidopsis seed coat release a mucilage hydrogel formed of polysaccharides. This has proved to be an excellent model system for the study of cell wall polysaccharide production, properties and interactions. The first objective of my thesis was to exploit natural variation between Arabidopsis accessions to identify genes controlling mucilage polysaccharide production. A genome wide association study identified genes encoding proteins with putative functions as either an amine oxidase or glycosyltransferase and these were confirmed to contribute to the synthesis of mucilage pectin. I also found that a family of small proteins, whose function is undetermined, are likely to modulate the interaction of mucilage polymers. Mucilage is also an adaptive trait that may influence various aspects of seed physiology. Recent results indicate that this hydrogel plays a role in the retention of water around the seed and could influence their lifespan. A second objective of my thesis was to use mutants showing altered mucilage production to determine its contribution to seed lifespan after a controlled hydration treatment called ‘priming’. Seeds that do not release mucilage on imbibition retained longevity better after priming. I highlighted that the steady state levels of salicylic acid in primed seeds were influenced by mucilage and correlated negatively with their longevity. My results contribute to our genetic, physicochemical and ecophysiological understanding of mucilage production by seeds.

Dans le domaine des systèmes d’administration de principes actifs, les nanovecteurs formés par auto-association en milieu aqueux de polymères biocompatibles amphiphiles sont apparus comme l’un des systèmes transporteurs de principes actifs (PA) hydrophobes les plus prometteurs. Ces systèmes offrent plusieurs avantages tels qu'une meilleure solubilité du PA hydrophobe dans l'eau, une diminution des effets secondaires et une amélioration de la libération dans les tissus tumoraux grâce à l’effet de perméabilité et de rétention tissulaire (effet EPR). À cet égard, les nanogels sensibles aux stimuli sont des plateformes attrayantes pour l'administration de médicaments en raison de leur capacité à modifier leurs propriétés physiques et/ou chimiques en réponse à un stimulus externe tel que la lumière, l’application d’un champ magnétique, une variation de pH ou de température. Les polymères thermosensibles sont particulièrement intéressants en raison de leur capacité à subir une transition de phase réversible sans avoir besoin de réactifs supplémentaires. Dans ce contexte, nous avons développé et étudié une nouvelle classe de nanogels thermosensibles, biocompatibles et biodégradables à base de glycoaminoglycanes (GAGs) en modifiant le squelette polysaccharidique avec un copolymère thermoresensible de méthacrylate de di(éthylène glycol) et de n-butylméthacrylate. Celui-ci a été conçu pour obtenir des nanogels stables à température ambiante. La voie de synthèse polyvalente a également permis la réticulation de la couronne afin de figer leur structure. Le choix des GAGs, composant la couronne hydrophile peut être exploité pour contrôler leur comportement biologique. Dans l’objectif d’utiliser ces systèmes en tant que plate-forme polyvalente pour la délivrance de principes actifs et d’autres molécules d'intérêt, nous avons étudié la possibilité d’incorporer des nanoparticules d'oxyde de fer pour des applications de guidage magnétique, d’imagerie et de traitement par hyperthermie. Les synthèses du composant magnétique ainsi que la conception du nanovecteur sont des étapes clés pour réaliser un système de délivrance magnétique capable de réaliser un ciblage efficace. / In the field of drug delivery systems, polymeric nanogels obtained by the self-assembly of biocompatible amphiphilic polymers in water have emerged as one of the most promising nanocarriers for various hydrophobic drugs. These systems offer several advantages such as enhanced hydrophobic drug solubility in water, decreased side effects, and improved drug delivery to tumor tissues via the enhanced permeability and retention (EPR) effect. In this regard, stimuli-responsive polymeric nanogels are attractive platforms for drug delivery due to their ability to change their physical and/or chemical properties in response to an external stimulus such as light, magnetic field, pH or temperature. Thermoresponsive polymers are particularly interesting due to their ability to undergo a reversible thermally-induced phase transition without the need of additional reagents. In this context, our aim was to engineer and to study a new class of thermoresponsive, biocompatible and biodegradable nanogels based on glycoaminoglycans (GAGs) through the modification of the polysaccharide backbone with a thermoresponsive copolymer of di(ethylene glycol) methacrylate (DEGMA) and n-butylmethacrylate (BMA)). The latter was properly designed to obtain stable nanogels at room temperature. The versatile synthetic route to nanogels also allowed their further shell-crosslinking to capture the nanogel structure at low temperature. The choice of the GAGs forming the hydrophilic shell can be exploited to control their biological behavior. In order to use these systems as a versatile platform for delivery of active ingredients and other molecules of interest, we investigated the possibility of incorporating iron oxide nanoparticles for magnetic guidance, imaging and hyperthermia treatment. The syntheses of the magnetic component as well as the design of the nanocarrier are key steps to achieve a magnetically-responsive nanodelivery system capable of efficient targeting.

Les travaux décrits dans ce manuscrit concernent l’élaboration de conservateurs naturels et hydrosolubles à base de polysaccharides greffés par des molécules actives d’origine végétale de type phénoliques (peu solubles dans l’eau). L’objectif est de développer de nouveaux systèmes présentant des propriétés antioxydantes et/ou antibactériennes, voire rhéologiques et principalement destinés aux domaines des formulations aqueuses cosmétiques et/ou alimentaires. Pour ce faire, le composé aminogaïacol (dérivé du gaïacol) a été greffé chimiquement sur un polysaccharide (carboxyméthylpullulane) selon des proportions variées (comprises entre 5 et 58 %). Les études physico-chimiques en milieux salins dilué et semi-dilué mettent en avant un caractère associatif (de type polysavon) des dérivés les plus greffés, avec des interactions intramoléculaires hydrophobes prédominantes qui limitent les propriétés rhéologiques. Tous les produits synthétisés ont par contre démontré des propriétés antioxydantes et antibactériennes. Le caractère associatif (i.e. la présence de microdomaines hydrophobes) s’est avéré être favorable à l’activité antioxydante, avec les meilleures activités observées pour le dérivé le plus fortement greffé en aminogaïacol (58%). Au contraire, le comportement associatif a limité l’activité biologique, dans ce cas, c’est le dérivé le moins greffé (5%) qui a démontré la meilleure activité antibactérienne, en raison d’une meilleure disponibilité des greffons. Afin d’améliorer les propriétés biologiques et/ou rhéologiques, cette approche de greffage de l’aminogaïacol a été étendue sur un autre polysaccharide anionique (l’alginate), plus rigide que le carboxyméthylpullulane avec des résultats prometteurs notamment en rhéologie. / The works described in this manuscript concern the development of natural and water soluble preservatives based on polysaccharides grafted with molecules of plant origin (from phenolic structure). The aim consists in developing new systems with antioxidant and/or antibacterial properties together with rheological ones for cosmetic and/or food application fields. For this purpose, aminoguaiacol (derived from guaiacol) was chemically grafted onto a polysaccharide (carboxymethylpullulan) in various proportions (between 5 and 58 %). The physicochemical studies in dilute and semi-dilute saline media put forward an associative character (of polysoap type) of the most grafted derivatives, with predominant hydrophobic intramolecular interactions which are limiting for rheology. All synthesized products have demonstrated antioxidant and antibacterial properties. The associative character (i.e., the presence of hydrophobic microdomains) was found to be favorable to the antioxidant activity, with the best activity for the most grafted aminoguaiacol derivative (58%). On the contrary, the associative behavior limited the antibacterial activity, in this case, the least grafted derivative (5%) demonstrated the best antibacterial activity, due to best availability of the grafted moieties. In order to improve the biological and/or rheological properties, this grafting approach of aminoguaiacol has been extended to another anionic polysaccharide (alginate), more rigid than carboxymethylpullulan with promising results notably as concerns rheology.

Polysaccharides are complex biopolymers that play essential roles in the biological systems including energy storage, structural support, lubrication, and signal transduction. Despite their importance, the synthesis of polysaccharides has proven to be very challenging due to the presence of multiple hydroxyl groups and difficulty in controlling the stereochemical outcome of glycosylation reactions. As a conventional chemical method to synthesize polysaccharides, ring-opening polymerization of anhydrosugars enables the synthesis of stereoregular α-(1→6)-linked polysaccharides, but is less effective in preparing polysaccharides with other linkages. Enzymatic polymerizations have also been explored, however, these methods typically require expensive monomers, and suffer from a narrow scope of enzymes and small scale of reactions. The limited approaches to polysaccharides have inspired chemists to synthesize polysaccharide mimetics with achiral linkages that can be constructed efficiently. Poly-amido-saccharides (PASs) are a new type of saccharide polymers in which the O-glycosidic linkages in natural polysaccharides are replaced with (1→2)-amide linkages. With saccharide moieties inter-connected by amide bonds, PASs exhibit characteristics of both polysaccharides and polypeptides, such as possessing pyranose-backbones and lots of hydroxyl groups, and adopting a left-handed helical conformation. However, due to lack of sufficient terminal saccharide residues, previously synthesized glucose and galactose PASs display weak interactions with carbohydrate binding lectins and receptors, limiting their applications in biomedical and pharmaceutical fields. Herein, the design and synthesis of PASs with novel structures and properties is described. By pre-installing the stereochemistry in the monomer, Altrose PASs (Alt-PASs) with β-(1→2)-amide linkages are prepared via ring-opening polymerization of an altrose-based β-lactam followed by debenzylation. Circular dichroism shows that Alt-PASs adopt a right-handed helical conformation in aqueous solution. Via the polymerization of disaccharide-based β-lactams, two PASs with either 4-O-α-D-glucose branches (Mal-PASs) or 6-O-β-D-glucose branches (Gen-PASs) are obtained. Biological studies reveal that Mal-PASs are multivalent ligands to lectin Concanavalin A, while Gen-PASs activate RAW 264.7 macrophage cells by enhancing the secretion of TNF-α and NO. The anionic ring-opening polymerization of sugar-based β-lactams is a useful method to synthesize well-defined polysaccharide mimetics, and this method expands the current repertory of approaches available to complex saccharide polymers with biological activities. / 2021-02-15T00:00:00Z

Les interactions entre protéines et polysaccharides dépendent des conditions environnementales et de leurs propriétés intrinsèques. La cosolubilité, la complexation et l’incompatibilité en sont le résultat. La complexation et l’incompatibilité ont démontré une amélioration des propriétés fonctionnelles de systèmes mixtes comparativement aux biopolymères pris individuellement. L’incompatibilité étant souvent la règle, cette recherche a pour but d’approfondir les connaissances sur les propriétés fonctionnelles des systèmes mixtes protéines-polysaccharides en conditions de compatibilité ou d’interactions associatives et de caractériser les nouvelles fonctionnalités qui en découlent. Un premier système isolat de protéines de lactosérum-xanthane a été étudié pour ses aptitudes à la gélification en conditions de compatibilité induites suite à une variation de pH et du ratio protéines-polysaccharides. Suivant l’application d’un traitement thermique, la solution est passée de compatible à incompatible. Les gels démontraient une augmentation du module élastique (G’) due à l’incompatibilité telle qu’observée par microscopie confocale à balayage laser. L’ajout de NaCl a augmenté cette incompatibilité et l’a rendue excessive au-delà d’une concentration critique entraînant une chute du G’. La compatibilité a ensuite été étudiée sur un système isolat de protéines de lactosérum-pectine. Suite à une variation de pH, de la concentration en biopolymères et du ratio protéines-polysaccharides, des conditions de compatibilité ont été confirmées par les mesures d’absorbance et du nombre de charges. Cette compatibilité a mené à une diminution de la viscosité en solution diluée due à la formation de complexes solubles alors qu’en solution concentrée, la complexation l’a plutôt augmentée. Un système modèle de yogourt ferme a finalement été étudié suite à l’incorporation de isolat de protéines de lactosérum et de pectine préalablement complexés et stabilisés. Les concentrations en protéines et en solides totaux ont été maintenues constantes. Les mélanges laitiers ont été acidifiés au glucono-delta-lactone. Les résultats démontrent que l’incorporation de complexes à différentes concentrations entrave la formation d’un réseau protéique homogène provoquant une diminution de la fermeté du gel et une augmentation de la synérèse. Les observations microscopiques appuient ces résultats. Les solutions mixtes permettent de développer de nouvelles propriétés fonctionnelles. Cependant, une meilleure connaissance de ces mélanges est nécessaire pour en arriver à des propriétés fonctionnelles variées et précises dans les formulations alimentaires. / Protein polysaccharide interactions depend on both environmental conditions and intrinsic properties. Results are co-solubility, complexation and incompatibility. Complexation and incompatibility have demonstrated improvement of functional properties of mixed systems compared to those of the individual components. Incompatibility being the rule, the aim of this study is to widen knowledge on functional properties of mixed protein-polysaccharide systems in presence of compatibility or associative interactions and to characterise the new emerging functional properties. A first mixed system of whey protein isolate-xanthan has been studied for its gelling abilities following pH and protein-polysaccharide ratio variations. Following application of a thermal treatment, the solution passed from compatible to incompatible. Gelation was demonstrated by an increase in elastic modulus (G’) due to incompatibility as observed by confocal laser scanning microscopy. Addition of NaCl increased this incompatibility and made it excessive at a certain critical concentration leading to loss in G’. Compatibility has then been studied on a whey protein isolate-pectin system. Varying pH, biopolymer total concentration and protein-polysaccharide ratio allowed soluble complex formation which was confirmed with the measurement of absorbance and the number of charge. This compatibility led to a decrease in viscosity in diluted solution due to soluble complex formation while in concentrated solution, complexation rather increased it. A model system of firm yogurt was finally studied following incorporation of whey protein isolate and pectin first complexed and stabilised. Protein and total solid concentrations were kept constant. Milky solutions were acidified with glucono-delta-lactone. Results demonstrate that incorporation of complexes at different concentrations hampers the formation of a homogenous protein network provoking a decrease in gel stiffness and an increase in syneresis. Microscopic observations supported these conclusions. Mixed solutions prepared by carefully condunting complex formation allow the design of new functional properties. However, a better knowledge of these mixes is necessary in order to achieve varied and precise functional properties in food formulation.

by Liu Chi. / "July, 2003." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (p. 270-283). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

Thesis (PhD (Microbiology))--University of Stellenbosch, 2005. / Biomass is the sole foreseeable sustainable source of organic fuels, chemicals and materials. It is a rich and renewable energy source, which is abundant and readily available. Primary factors motivating the use of renewable enrgy sources include the growing concern over global climate change and the drastic depletion of non-renewable resources. Among various forms of biomass, cellulosic feedstocks have the greatest potential for energy production from. The biggest technological obstacle to large-scale utilisation of cellulosic feedstocks for the production of bioethanol as a cost-effective alternative to fossil fuels is the general absence of low-cost technology for overcoming the recalcitrance of cellulosic biomass. A promising strategy to overcome this impediment involves the production of cellulolytic enzymes, hydrolysis of biomass and fermentation of resulting sugars to ethanol in a single process step via a single microorganism or consortium. Such “consolidated bioprocessing” (CBP) offers very large cost reductions if microorganisms, such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, can be developed that possess the required combination of efficient cellulose utilisation and high ethanol yields. Cellulose degradation in nature occurs in concert with a large group of bacteria and fungi. Cellulolytic microorganisms produce a battery of enzyme systems called cellulases. Most cellulases have a conserved tripartite structure with a large catalytic core domain linked by an O-glycosylated peptide to a cellulose-binding domain (CBD) that is required for the interaction with crystalline cellulose. The CBD plays a fundamental role in cellulose hydrolysis by mediating the binding of the cellulases to the substrate. This reduces the dilution effect of the enzyme at the substrate surface, possibly by helping to loosen individual cellulose chains from the cellulose surface prior to hydrolysis. Most information on the role of CBDs has been obtained from their removal, domain exchange, site-directed mutagenesis or the artificial addition of the CBD. It thus seems that the CBDs are interchangeable to a certain degree, but much more data are needed on different catalytic domain-CBD combinations to elucidate the exact functional role of the CBDs. In addition, the shortening, lengthening or deletion of the linker region between the CBD and the catalytic domain also affects the enzymatic activity of different cellulases. Enzymes such as the S. cerevisiae exoglucanases, namely EXG1 and SSG1, and the Saccharomycopsis fibuligera β-glucosidase (BGL1) do not exhibit the same architectural domain organisation as shown by most of the other fungal or bacterial cellulases. EXG1 and SSG1 display β-1,3-exoglucanase activities as their major activity and exhibit a significant β- 1,4-exoglucanase side activity on disaccharide substrates such as cellobiose, releasing a free glucose moiety. The BGL1 enzyme, on the other hand, displays β-1,4-exoglucanase activity on disaccharides. In this study, the domain engineering of EXG1, SSG1 and BGL1 was performed to link these enzymes to the CBD2 domain of the Trichoderma reesei CBHII cellobiohydrolase to investigate whether the CBD would be able to modulate these non-cellulolytic domains to function in cellulose hydrolysis. The engineered enzymes were constructed to display different modular organisations with the CBD, either at the N terminus or the C terminus, in single or double copy, with or without the synthetic linker peptide, to mimic the multi-domain organisation displayed by cellulases from other microorganisms. The organisation of the CBD in these recombinant enzymes resulted in enhanced substrate affinity, molecular flexibility and synergistic activity thereby improving their ability to act and hydrolyse cellulosic substrates, as characterised by adsorption, kinetics, thermostability and scanning electron microscopic (SEM) analysis. The chimeric enzyme of CBD2-BGL1 was also used as a reporter system for the development and efficient screening of mutagenised S. cerevisiae strains that overexpress CBD-associated enzymes such as T. reesei cellobiohydrolase (CBH2). A mutant strain WM91 was isolated showing up to 3-fold more cellobiohydrolase activity than that of the parent strain. The increase in the enzyme activity in the mutant strain was found to be associated with the increase in the mRNA expression levels. The CBH2 enzyme purified from the mutant strain did not show a significant difference in its characteristic properties in comparison to that of the parent strain. In summary, this research has paved the way for the improvement of the efficiency of the endogenous glucanases of S. cerevisiae, and the expression of heterologous cellulases in a hypersecreting mutant of S. cerevisiae. However, this work does not claim to advance the field closer to the goal of one-step cellulose processing in the sense of technological enablement; rather, its significance hinges on the fact that this study has resulted in progress towards laying the foundation for the possible development of efficient cellulolytic S. cerevisiae strains that could eventually be optimised for the one-step bioconversion of cellulosic materials to bioethanol.