Circadiane Uhren sind endogene Oszillatoren, die tägliche Rhythmen in Physiologie, Metabolismus und Verhalten steuern. Auf molekularem Level wird die Dynamik der circadianen Oszillation über ein genregulatorisches Netzwerk aus transkriptionellen-translationalen Rückkopplungsschleifen gesteuert. Posttranslationale Modifikationen von Uhrproteinen sind für eine präzise Justierung der circadianen Periode essentiell. Dabei spielt die Phosphorylierung von Uhrproteinen für die Regulation von Aktivität, Stabilität und intrazellulärer Lokalisation eine wichtige Rolle. Bisher sind verschiedene Kinasen als Modulatoren der circadianen Uhr charakterisiert worden, jedoch ist eine funktionale Rolle von Protein Phosphatasen bisher nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wurde mittels eines RNAi-basierten Screenings in oszillierenden humanen Zellen untersucht, ob sich die gezielte Depletion katalytischer Untereinheiten der Serin/Threonin-Phosphatasen auf die normale Oszillationsdynamik auswirkt und welche Rolle ausgewählte Phosphatase-Kandidaten für die posttranslationale Kontrolle des molekularen Oszillators spielen. Die RNAi vermittelte Depletion von Protein Phosphatase 4 führte gewebe- und speziesübergreifend zu einer signifikant kurzen circadianen Periode, während die Überexpression von wildtypischer Pp4c in einer stark reprimierten Amplitude resultierte. Mechanistische Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von PP4c für die Regulation der circadianen Uhr zeigten, dass PP4c womöglich eine duale Rolle spielt: Einerseits ist PP4c in die direkte Aktivierung des Bmal1-Promotors über RRE-Elemente involviert. Anderseits wirkt PP4c inhibierend auf die CLOCK/BMAL1-vermittelte, E-Box getriebene Genexpression. Ein favorisiertes Modell fundiert auf der Vermutung, dass eine durch PP4c induzierte Modulation des Phosphorylierungsstatus von BMAL1 zu einem stabilen, aber transktiptionsinaktiven BMAL1 und damit zu einer verstärkten Repression der Uhrgentranskription führt. / Circadian clocks are endogenous oscillators that drive daily rhythms in physiology, metabolism and behavior. On the molecular level the dynamics of circadian oscillations are regulated by a transcriptional-translational gene-regulatory network. Posttranslational modifications of clock proteins are essential for the precise timing of an about 24 hour-period. Among these modifications, protein phosphorylation plays an important role in regulating activity, stability and intracellular localization of clock proteins. Several kinases were characterized as regulators of the circadian clock. However, the function of protein phosphatases, which balance phosphorylation events, in the mammalian clock mechanism is less well understood. By using a systematic RNAi-based approach in oscillating human cells, this work aimed to study the impact of catalytic subunits of Serine/Threonin-phosphatases on normal circadian dynamics and the functional role of potential candidates in the posttranslational control of the mammalian molecular oscillator. This study demonstrates, that genetic depletion of the catalytic subunit of protein phosphatase 4 results independently from tissue and species in a significant shorter period, whereas overexpression of wildtype PP4c results in a severely reduced amplitude rhythm. Mechanistic experiments to uncover the functional relevance of PP4c in the regulation of the circadian clock showed, that PP4c plays a dual role: Firstly, PP4 is involved in the direct activation of the Bmal1-promotor via RRE elements. Secondly, PP4c is inhibiting the CLOCK/BMAL1-mediated gene expression. A favored model is based on the assumption, that PP4c-induced modulation of the phosphorylation status of BMAL1 leads to a more stable and transcriptional inactive protein and thereby to a repression of the transcription of clock genes.

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Bei der Herstellung und Lagerung von Milch und Milchprodukten kommt es in unterschiedlichem Ausmaß zur Bildung von reversiblen und irreversiblen Proteinquervernetzungen. Dabei verändern sich neben technologischen auch ernährungsphysiologische Eigenschaften des Produktes. Die für die Oligomerisation verantwortlichen Strukturen sind bisher nur zum Teil bekannt. Daher soll in dieser Arbeit zunächst das Ausmaß der Quervernetzung in einer größeren Anzahl an handelsüblichen Milchprodukten ermittelt und mit den für diese Proben gemessenen Gehalten der für irreversible Quervernetzungsreaktionen in Lebensmitteln wichtigen Aminosäurederivate Lysinoalanin (LAL) und Histidinoalanin (HAL) verglichen werden. Der Beitrag dieser beiden Dehydroalanin-Derivate für Oligomerisationen ist jedoch stark von der Art ihres Bildungsweges abhängig. Da es in der Literatur keine abschließenden Untersuchungen über eine intra- oder intermolekularen Bildung von LAL und HAL gibt, ist dies eine grundlegende Aufgabe, um in der Folge den Anteil von unbekannten Crosslinks für die analysierten Lebensmittel bestimmen zu können. Die Identifizierung dieser vorhandenen, jedoch strukturell unbekannten Crosslinks ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Untersuchungen. Hierbei richtet sich das Interesse vor allem auf Quervernetzungsprodukte, die im Zusammenhang mit der nicht-enzymatischen Bräunung oder Maillard-Reaktion gebildet werden. Aus der Literatur ist eine Vielzahl von Verbindungen, die an der Oligomerisation und den damit verbundenen Eigenschaftsänderungen von Proteinen beteiligt sind, aus Modellansätzen oder in vivo-Studien bekannt. Untersuchungen zum Vorkommen dieser Strukturen in handelsüblichen Lebensmitteln fehlen jedoch in den überwiegenden Fällen. Dazu ist neben der Synthese einzelner Verbindungen als Standardmaterial die Entwicklung bzw. Optimierung der Analytik für Lebensmittelmatrices durchzuführen. Einige der bekannten, aber noch nicht in Lebensmitteln nachgewiesenen Crosslinkaminosäuren zeichnen sich durch eine charakteristische Fluoreszenz aus. Die Zunahme der Fluoreszenz in technologisch hergestellten Milchprodukten ist aus der Literatur bekannt, eine Identifizierung der dafür verantwortlichen Verbindungen fehlt hingegen. Daher ist ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle, fluoreszierende Crosslinks in Milchprodukten zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Bei der Herstellung und Lagerung von Milch und Milchprodukten kommt es in unterschiedlichem Ausmaß zur Bildung von reversiblen und irreversiblen Proteinquervernetzungen. Dabei verändern sich neben technologischen auch ernährungsphysiologische Eigenschaften des Produktes. Die für die Oligomerisation verantwortlichen Strukturen sind bisher nur zum Teil bekannt. Daher soll in dieser Arbeit zunächst das Ausmaß der Quervernetzung in einer größeren Anzahl an handelsüblichen Milchprodukten ermittelt und mit den für diese Proben gemessenen Gehalten der für irreversible Quervernetzungsreaktionen in Lebensmitteln wichtigen Aminosäurederivate Lysinoalanin (LAL) und Histidinoalanin (HAL) verglichen werden. Der Beitrag dieser beiden Dehydroalanin-Derivate für Oligomerisationen ist jedoch stark von der Art ihres Bildungsweges abhängig. Da es in der Literatur keine abschließenden Untersuchungen über eine intra- oder intermolekularen Bildung von LAL und HAL gibt, ist dies eine grundlegende Aufgabe, um in der Folge den Anteil von unbekannten Crosslinks für die analysierten Lebensmittel bestimmen zu können. Die Identifizierung dieser vorhandenen, jedoch strukturell unbekannten Crosslinks ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Untersuchungen. Hierbei richtet sich das Interesse vor allem auf Quervernetzungsprodukte, die im Zusammenhang mit der nicht-enzymatischen Bräunung oder Maillard-Reaktion gebildet werden. Aus der Literatur ist eine Vielzahl von Verbindungen, die an der Oligomerisation und den damit verbundenen Eigenschaftsänderungen von Proteinen beteiligt sind, aus Modellansätzen oder in vivo-Studien bekannt. Untersuchungen zum Vorkommen dieser Strukturen in handelsüblichen Lebensmitteln fehlen jedoch in den überwiegenden Fällen. Dazu ist neben der Synthese einzelner Verbindungen als Standardmaterial die Entwicklung bzw. Optimierung der Analytik für Lebensmittelmatrices durchzuführen. Einige der bekannten, aber noch nicht in Lebensmitteln nachgewiesenen Crosslinkaminosäuren zeichnen sich durch eine charakteristische Fluoreszenz aus. Die Zunahme der Fluoreszenz in technologisch hergestellten Milchprodukten ist aus der Literatur bekannt, eine Identifizierung der dafür verantwortlichen Verbindungen fehlt hingegen. Daher ist ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle, fluoreszierende Crosslinks in Milchprodukten zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Die myeloische Entwicklung wird durch die Familie der Transkriptionsfaktoren CCAAT/Enhancer-Binding-Protein (C/EBP) reguliert. Eine aberrante Expression oder Funktion von C/EBPs stört die normale myeloische Differenzierung und wird bei vielen Arten hämatopoetischer Malignome beobachtet. Mutationen von CEBPA führen zu einem veränderten Expressionsanteil der verkürzten Isoform C/EBPa p30 und werden bei etwa 15% der AML-Patienten (akute myeloische Leukämie) nachgewiesen. Obwohl die verkürzte Isoform C/EBPα p30 als Onkogen identifiziert wurde da sie die Proliferation myeloischer Vorläufer fördert, behält sie dennoch eine Differenzierungsfunktion. Unser Interesse gilt der Frage, wie diese beiden Funktionen von C/EBPα p30 reguliert werden. Die C/EBP-Familie gehört der Gruppe intrinsisch ungeordneter Proteine an, die zudem viele posttranslationale Modifikationen (PTMs) aufweisen. PTMs auf C/EBPα verändern seine biologische Funktionsweise stark. Frühere Forschungsarbeiten haben drei Argininreste am N-Terminus von C/EBPα p30 identifiziert, die aufgrund des Methylierungsstatus differentiell mit anderen Proteinen interagieren. In dieser Arbeit untersuchen wir den Einfluss der C/EBPα p30 Arginin-Methylierung auf seine pro-leukämische Aktivität sowie dessen Fähigkeit zur Neuausrichtung der hämatopoietischen Differenzierungslinie. Mit Hilfe von Aminosäuresubstitutionen fanden wir heraus, dass C/EBPα p30 Mutanten der Methylierungsmimesis oder Ladungsabschaffung die myeloische Differenzierung verstärkt, während Ladungserhalt-Mutanten die Erneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen unterstützt. Transkriptionelles Profiling von Zellen, die mutierte C/EBPα -p30-Varianten exprimieren, deutet auf potenzielle Ziele der methyliertem bzw. unmethyliertem C/EBPα p30 hin. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Arginin-Methylierungsstatus das Leukämie- und Differenzierungs-Potenzial von C/EBPα p30 verändert und somit ein neues Ziel der Leukämietherapie darstellen könnten. / Myeloid development is regulated by the family of transcription factors CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). Aberrant expression or functioning of C/EBPs disturbs normal myeloid differentiation and is found in many types of hematopoietic malignancies. Mutations of CEBPA lead to imbalanced expression of the truncated isoform C/EBPα p30 and are found in approximately 15% of AML (acute myeloid leukemia) patients. Yet, how C/EBPα participates in leukemic progression remains to be discovered. More specifically, the truncated isoform C/EBPα p30, although being identified as an oncogenic isoform that promotes proliferation of myeloid progenitors, still retains differentiation function. The question of how both functions of C/EBPα p30 are regulated, is of our interest. C/EBP family also represents a group of intrinsically disordered proteins, which contain many post-translational modifications (PTMs). PTMs on C/EBPα greatly alter its functioning. Previous works have identified three arginine residues at the N-terminus of C/EBPα p30 that interact differently with others protein dependent on their methylation status. We hypothesize, that methylation of these arginine residues plays important roles in the biology of C/EBPα p30. In this study, we used a lymphoid-to-myeloid transdifferentiation (LMT) system to investigate the influence of arginine-methylation on C/EBPα-induced lineage switch and its pro-leukemic activity. Using amino acid substitution, we found that C/EBPα p30 mutants that resemble arginine-methylated p30 enhanced myeloid differentiation, while the charge-retention mutant, resembling arginine-unmethylated p30, supported renewability and proliferation of hematopoietic progenitors. Transcriptional profiling of cells expressing C/EBPα p30 variants suggested potential targets of either methylated or unmethylated p30. The results implied that arginine methylations alter C/EBPα p30’s leukemic potential and might comprise novel targets of leukemia therapy.