Die myeloische Entwicklung wird durch die Familie der Transkriptionsfaktoren CCAAT/Enhancer-Binding-Protein (C/EBP) reguliert. Eine aberrante Expression oder Funktion von C/EBPs stört die normale myeloische Differenzierung und wird bei vielen Arten hämatopoetischer Malignome beobachtet. Mutationen von CEBPA führen zu einem veränderten Expressionsanteil der verkürzten Isoform C/EBPa p30 und werden bei etwa 15% der AML-Patienten (akute myeloische Leukämie) nachgewiesen. Obwohl die verkürzte Isoform C/EBPα p30 als Onkogen identifiziert wurde da sie die Proliferation myeloischer Vorläufer fördert, behält sie dennoch eine Differenzierungsfunktion. Unser Interesse gilt der Frage, wie diese beiden Funktionen von C/EBPα p30 reguliert werden. Die C/EBP-Familie gehört der Gruppe intrinsisch ungeordneter Proteine an, die zudem viele posttranslationale Modifikationen (PTMs) aufweisen. PTMs auf C/EBPα verändern seine biologische Funktionsweise stark. Frühere Forschungsarbeiten haben drei Argininreste am N-Terminus von C/EBPα p30 identifiziert, die aufgrund des Methylierungsstatus differentiell mit anderen Proteinen interagieren. In dieser Arbeit untersuchen wir den Einfluss der C/EBPα p30 Arginin-Methylierung auf seine pro-leukämische Aktivität sowie dessen Fähigkeit zur Neuausrichtung der hämatopoietischen Differenzierungslinie. Mit Hilfe von Aminosäuresubstitutionen fanden wir heraus, dass C/EBPα p30 Mutanten der Methylierungsmimesis oder Ladungsabschaffung die myeloische Differenzierung verstärkt, während Ladungserhalt-Mutanten die Erneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen unterstützt. Transkriptionelles Profiling von Zellen, die mutierte C/EBPα -p30-Varianten exprimieren, deutet auf potenzielle Ziele der methyliertem bzw. unmethyliertem C/EBPα p30 hin. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Arginin-Methylierungsstatus das Leukämie- und Differenzierungs-Potenzial von C/EBPα p30 verändert und somit ein neues Ziel der Leukämietherapie darstellen könnten. / Myeloid development is regulated by the family of transcription factors CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). Aberrant expression or functioning of C/EBPs disturbs normal myeloid differentiation and is found in many types of hematopoietic malignancies. Mutations of CEBPA lead to imbalanced expression of the truncated isoform C/EBPα p30 and are found in approximately 15% of AML (acute myeloid leukemia) patients. Yet, how C/EBPα participates in leukemic progression remains to be discovered. More specifically, the truncated isoform C/EBPα p30, although being identified as an oncogenic isoform that promotes proliferation of myeloid progenitors, still retains differentiation function. The question of how both functions of C/EBPα p30 are regulated, is of our interest. C/EBP family also represents a group of intrinsically disordered proteins, which contain many post-translational modifications (PTMs). PTMs on C/EBPα greatly alter its functioning. Previous works have identified three arginine residues at the N-terminus of C/EBPα p30 that interact differently with others protein dependent on their methylation status. We hypothesize, that methylation of these arginine residues plays important roles in the biology of C/EBPα p30. In this study, we used a lymphoid-to-myeloid transdifferentiation (LMT) system to investigate the influence of arginine-methylation on C/EBPα-induced lineage switch and its pro-leukemic activity. Using amino acid substitution, we found that C/EBPα p30 mutants that resemble arginine-methylated p30 enhanced myeloid differentiation, while the charge-retention mutant, resembling arginine-unmethylated p30, supported renewability and proliferation of hematopoietic progenitors. Transcriptional profiling of cells expressing C/EBPα p30 variants suggested potential targets of either methylated or unmethylated p30. The results implied that arginine methylations alter C/EBPα p30’s leukemic potential and might comprise novel targets of leukemia therapy.

Tyrosinkinasen (TK) sind Schlüsselregulatoren der zellulären Signaltransduktion und beeinflussen Zellzyklus, Zellüberleben, Apoptose, Proliferation und Differenzierung. Die Dysregulation der TK-Aktivität trägt zur Entwicklung von Leukämie und anderen malignen Erkrankungen bei. So sind 25% der akuten lymphatischen Leukämien bei Erwachsenen (ALL) durch die BCR-ABL1-Translokation bedingt. Trotz intensiver Therapie beträgt das 5-Jahres-Überleben von erwachsenen Patienten mit ALL nur etwa 50 %. Als Alternative zu herkömmlichen Chemotherapeutika bietet der Einsatz von spezifisch wirkenden TK-Inhibitoren einen individualisierten Therapieansatz mit idealerweise weniger Nebenwirkungen und einem dadurch verbesserten Outcome. Um mögliche neue therapeutische Ziele zu identifizieren, wurde eine systematische Untersuchung der Expressionsveränderungen des gesamten Tyrosinkinoms durchgeführt. Eine Vielzahl verschiedener Tyrosinkinasen zeigte starke Veränderungen im Expressionsprofil von ALL-Zellen. Ein Teil dieser Expressionsänderungen kam durch das veränderten Methylierungsprofil der ALL-Zellen zustande. EPHA7 und PTK2 sind potentielle Marker für B-Linien ALL und NTRK3, ERBB4 und ZAP70 für T-Linien ALL. Die interindividuell variierende Expression der Tyrosinkinasen EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 und PDGFRB könnte eine genauere Risikoeinstufung ermöglichen. Insbesondere sind die Tyrosinkinasen ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC und TYK2 vielversprechende therapeutische Ziele, die im hämatopoetischen System die Proliferation fördern und / oder die Apoptose hemmen. Eine proliferationsfördernde Wirkung von überexprimiertem FLT4 konnte erstmals gezeigt werden. Die Vielfalt der Veränderungen in der Tyrosinkinase-Expression scheint eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von ALL zu spielen und TK könnte vielversprechende neue therapeutische Ziele sein. / Tyrosine kinases (TK) are key regulators of cellular signal transduction and affect cell cycle, cell survival, apoptosis, proliferation and differentiation. Dysregulation of TK activity contributes to the development of leukemia and other malignancies. So are 25 % of adult acute lymphoblastic leukemias (ALL) driven by the BCR-ABL1 translocation. Despite intensive therapy, the 5-year overall survival of adult patients with ALL is about 50 %. In contrast to conventional chemotherapeutic agents, the use of specific-acting TK-inhibitors offers an individualized therapeutic approach with less side-effects and a better outcome. To identify possible new therapeutic targets, a systematic survey of expression changes of the entire tyrosine kinome was carried out. A variety of different tyrosine kinases showed great changes in the expression profile of ALL-cells. Part of these expression changes can be attributed to a changed methylation profile in adult ALL. EPHA7 and PTK2 are potential markers for B-line ALL and the NTRK3, ERBB4 and ZAP70 for T-lines ALL. The interindividual varying expression of the tyrosine kinases EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 and PDGFRB presumably allows a more precise risk classification. In particular, the tyrosine kinases ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC and TYK2 are promising therapeutic targets, which promotes proliferation and/or inhibits apoptosis in the hematopoietic system. A proliferation promoting effect of overexpressed FLT4 could be shown for the first time. The variety of changes in the tyrosine kinase expression seems to play an important role in the development of ALL and TK could be promising new therapeutic targets.

Die molekulare Charakterisierung von genetischen Veränderungen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) wurde vor allem bei jungen Patienten vorangebracht, hingegen fehlen Analysen für die AML bei älteren Patienten. Entsprechend ergab sich die Rationale, genetische und epigenetische Alterationen bei älteren AML Patienten zu untersuchen, um spezifische Signaturen zu identifizieren. Wir untersuchten ältere 93 AML Patienten aus dem Study Alliance Leukemia (SAL) Register. Es wurden 555 Gene auf der Illumina HiSeq2000 Plattform sequenziert und DNA Methylierungsprofile mittels dem Illumina 450K Array untersucht. Insgesamt wurden 814 molekulare Alterationen in 281 Genen detektiert. Besonders hohe Mutationsfrequenzen wurden in den Genen DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) und ASXL1 (21%) notiert. Alterationen in epigenetischen Regulatoren (85%) und in Genen, die in Splicing involviert sind (38%), wurden gehäuft beobachtet. Ältere AML Patienten mit Mutationen in DNMT3A oder DNA Reparaturgenen wiesen eine geringere Lebenserwartung im Vergleich zu der restlichen Kohorte auf. Wir verglichen die Meythlierungsdaten aus der SAL mit denen der TCGA Kohorte, umso die Methylierungsmuster von älteren mit denen von jüngeren Patienten zu differenzieren. Es konnte ein distinktes Methylierungsprofil in den DNA Proben von älteren AML Patienten nachgewiesen werden. Die im Vergleich zu jüngeren AML Patienten unterschiedlich methylierten Regionen bei älteren AML Patienten überlappten mit Genen verschiedener Signalwege, die Hallmarks von Alterungsprozessen und Krebs entsprechen. Zusammenfassend konnten wir für die Kohorte älterer AML Patienten genetische Alterationen nachweisen und mit spezifischen Profilen von Mutationen in epigenetischen Regulatoren korrelieren. Diese molekulare Kategorisierung unterstreicht distinkte biologische Mechanismen in älteren AML Patienten und die Notwendigkeit von spezifischen Therapieansätzen für diese Kohorte mit ungünstiger Prognose. / Despite advances in the characterization of molecular alterations in younger acute myeloid leukemia (AML) patients, comprehensive studies in elderly AML are lacking. Thus, we investigated genetic and epigenetic alterations and probed for specific signatures to understand the unfavorable outcomes of elderly AML. We studied 93 AML patients (65 to 90 years old), enrolled in the Study Alliance Leukemia registry (SAL). To capture a broad spectrum of alterations, we sequenced 555 genes on an Illumina HiSeq2000 platform and investigated DNA methylation profiles using the Illumina 450K array. Overall, we detected 814 molecular alterations in 281 genes, with a median of 7 genes mutated per patient. Particularly high mutation frequencies were identified for DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) and ASXL1 (21%). We observed frequent alterations in epigenetic regulators (85%) and in splicing factors (38%). Notably, SAL elderly AML patients with mutations in DNMT3A or DNA repair genes (in absence of mutations in NPM1 or splicing factors) had an inferior survival of only 9 months (compared to 17 months for the remaining patients). In addition, for the analysis of elderly AML DNA methylation, we integrated the SAL cohort with TCGA methylation data for comparisons of methylation levels to younger patients. A distinct DNA methylation profile was observed in older AML patients, which correlated with the presence of mutations in IDH1/2, RUNX1 and ASXL1 and epigenetic similarities with TP53/Complex samples. The differential methylated regions of elderly AML (compared to younger AML samples) were shown to overlap genes from several pathways that are hallmarks of both age and cancer. In conclusion, we unraveled distinct patterns of genetic alterations and correlated specific epigenetic profiles of elderly AML to high rate mutated epigenetic regulators. This molecular categorization underscored the distinct biology and the need for specific therapeutic approaches in elderly AML.