HINTERGRUND: Der selektive Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib inhibiert das Wachstum von bcr/abl positiven Zellen und stellt somit eine neue Therapieoption in der Behandlung der CML dar. Mittlerweile sind verschiedene Mutationen innerhalb der abl Sequenz beschrieben worden, die eine adäquate Imatinibbindung verhindern und zu einer zellulären Resistenz der CML Zellen führen. METHODE: Wir untersuchten 69 Patienten unter Behandlung mit Imatinib im Rahmen von laufenden klinischen Studien. Bei Studieneinschluss waren 37 Patienten in chronischer Phase, 21 Patienten in akzelerierter Phase und 11 Patienten in Blastenkrise. Mittels Real-time PCR wurden bcr/abl, WT1, MDR1 und AGP RNA Traskripte aus peripheren Leukozyten quantifiziert. AGP Proteinlevel wurden turbidimetrisch bestimmt. Ausserdem entwickelten wir eine neue, hochsensitive Technik zur Detektion bekannter Mutationen innerhalb der bcr/abl Domäne, indem wir das DNA-Clamping mittels Peptidnukleinsäure (PNA) mit einem Hybridisationssonden-Assay kombinierten. ERGEBNISSE: 1. Unsere Resultate bestätigen die hämatologische Effizienz von Imatinib in Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten. 2. Eine komplette molekulare Remission konnte bei einem Patienten erzielt werden. 3. Wir konnten die bcr/abl Mutationen Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His mit hoher Sensivität nachweisen. In einem Falle konnte die Gly255Lys Mutation vor der Behandlung detektiert werden. SCHLUSSFOLGERUNG: Bcr/abl und WT1 mRNA stellen in der Behandlung der CML Verlaufs- und Prognosemarker dar. Ein Zusammenhang zwischen MDR1 mRNA bzw. AGP mRNA und einer Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib konnte nicht bestätigt werden. Durch den PNA-Clamping Assay konnten präexistente und sich entwickelnde bcr/abl Mutationen mit ungünstiger Prognose sicher und frühzeitig detektiert werden. Diese Tatsache ermöglicht eventuell eine Risikostratifizierung der CML und könnte als Model zum individuellen molekularen Monitoring und zur therapeutischen Strategie in anderen malignen Erkrankungen dienen. / BACKROUND: The selective tyrosine kinase inhibitor imatinib inhibits growth of bcr/abl positive cells and, thus, has become a novel therapeutic option for the treatment of Ph+ leukaemic patients. Various mutations within the abl sequence have been described that prevent adequate imatinib binding to bcr/abl resulting in cellular resistance of CML cells. METHODS: We investigated 69 CML patients under treatment with imatinib as part of an ongoing clinical trial. At recruitment 37 patients were in chronic phase, 21 patients in accelerated phase and 11 patients in blast crisis. Bcr/abl, WT1, MDR1and AGP RNA transcripts were quantified in peripheral leucocytes by real time PCR. AGP protein levels in plasma were measured by turbidimetric analysis. By combining peptide nucleic acid (PNA) based DNA clamping with a fluorescence hybridisation probe assay we developed a new and highly sensitive technique for the detection of known mutations within the bcr/abl kinase domain. RESULTS: 1. Our results demonstrate efficacy of imatinib on the haematological level in accordance with previously published data. 2. Complete molecular remission could be achieved in one patient. 3. We could effectively enhance the detection sensitivity (0,2%) for the BCR/ABL mutations Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His. In one case the Gly255Lys mutation was detectable before treatment. CONCLUSION: Bcr/abl and WT1 mRNA are predictive marker in the treatment of CML. Our investigation could not confirm any relation between MDR1 mRNA nor AGP mRNA and a resistance to imatinib. By the PNA clamping assay pre-existing and evolving bcr/abl mutations associated with an unfavorable prognosis could be safely detected. This may facilitate risk stratification in CML and may serve as a model for individualized molecular monitoring and therapeutic strategies in other malignant diseases.

Das Knochenmarkmikromilieu produziert eine Reihe von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren, die für das maligne Wachstum und die Medikamentenresistenz von Myelomzellen von grosser Bedeutung sind. Einer der wichtigsten Faktoren, der in manchen experimentellen Systemen sogar als essentiell für das Wachstum und Überleben von Myelomzellen beschrieben wurde, ist Interleukin-6. Aus diesem Grund könnte die Entwicklung von Substanzen, die die Wirkung von IL-6 oder dem IL-6 Rezeptor inhibieren von Bedeutung für die Therapie des Myeloms sein. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des IL-6 Rezeptorantagonisten SANT7 auf das Überleben der IL-6 abhängigen Myelomzellinie INA-6 sowie primären Myelomzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von primären humanen Knochenmarkstromazellen (KMSZ) untersucht. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage ob SANT7 die wachstumsinhibitorische Wirkung von Dexamethson (Dex) und All-Trans-Retinolsäure (ATRA) verstärken kann. Keine der drei Substanzen, SANT7 eingeschlossen, konnte bei alleiniger Applikation in Gegenwart von primären humanen KMSZ eine nennenswerte Wachstumsinhibition induzieren. Wenn jedoch Dex und ATRA mit SANT7 kombiniert wurden konnte sowohl in INA-6 als auch primären Myelomzellen eine starke Wachstumsinhibition erzielt werden. Dieser Effekt beruht sowohl auf Apoptose als auch eines Zellzyklusarrests. / The bone marrow microenvironment produces a number of different survival factors that are important for the malignant growth and drug resistance of multiple myeloma (MM) cells. One of the main factors reported to be essential for survival and growth of MM cells in some experimental systems is interleukin-6 (IL-6). Therefore, the development and testing of substances that interfere with IL-6 or IL-6 receptor (IL-6R) function might have a potential therapeutic value for the treatment of multiple myeloma. In this work the effect of the IL-6 receptor antagonist SANT7 on growth and survival of the IL-6 dependent MM cell lines INA-6 as well as primary MM cells in the presence or absence of bone marrow stromal cells (BMSC) was analyzed. Of particular interest was the question whether SANT7 might enhance the growth inhibitory effects of dexamethasone (Dex) and all-trans retinoic acid (ATRA). None of the drugs, when tested as a single substance, including SANT7, induced major growth inhibition if MM cells were co-cultured with primary human BMSCs. However, if Dex and ATRA were given in combination with SANT7 a strong growth inhibition was achieved in INA-6 and primary MM cells. This effect is due to cell cycle arrest and induction of apoptosis.

Unsere Untersuchungen belegen, dass nichtmyeloablative Stammzelltransplantationen (NST) bei Patienten mit Hochrisiko-ALL oder -AML eine neue therapeutische Option darstellen. Die NST ermöglichte eine allogene Stammzelltransplantation bei Transplantationskandidaten mit Kontraindikationen gegen eine hochdosierte Strahlen- und Chemotherapie (Standardtransplantation). Nach NST kam es häufig zur Entwicklung von Infektionen und einer spät auftretenden akuten Transplantat-gegen-Wirt Reaktion (GvHD), diese waren aber mit einer geringeren Mortalität verbunden. Das erkrankungsfreie Überleben und das Gesamt-Überleben nach NST und nach Standardtransplantation waren fast gleich. Der höheren Rezidivrate nach NST stand eine höhere transplantationsassoziierte Mortalität nach Standardtransplantation gegenüber. Das Konditionierungsregime selber war ohne Einfluss auf das Überleben der Patienten. Sequenzielle Chimärismusuntersuchungen von Leukozytensubpopulationen erlaubten eine frühe Diagnose eines gemischten Chimärismus, der einen prädiktiven Wert für das Auftreten eines Rezidivs hatte. Ein stabiler gemischter Chimärismus wurde nicht beobachtet. Durch eine adoptive Immuntherapie mit Spenderlymphozyten (DLI) konnte bei der Mehrzahl der transplantierten Patienten mit gemischtem Chimärismus eine Chimärismuskonversion und eine lang anhaltende komplette Remission induziert werden, ein wichtiger Hinweis auf einen Transplantat-gegen-Leukämie Effekt (GvL) der Spenderzellen. Durch die NST rückt der immunologische Effekt der Transplantation gegenüber der Zytoreduktion bei der Standardtransplantation stärker in den Vordergrund. Unsere Ergebnisse sprechen für die Wirksamkeit eines GvL-Effektes bei akuten Leukämien auch nach NST. Die Erfahrungen mit der NST bei akuten Leukämien haben zu einer Anwendung bei refraktären Nierenzellkarzinomen geführt. Eine Tumorregression wurde erst nach Chimärismuskonversion und/oder Entwicklung einer GvHD beobachtet; diese Befunde sind vereinbar mit einem Transplantat-gegen-Tumor Effekt (GvT). Die transplantationsassoziierte Morbidität war allerdings bei diesen meist älteren Patienten erheblich. Die Therapie sollte ausschließlich im Rahmen klinischer Studien erfolgen, da es sich nach wie vor um ein experimentelles Therapieverfahren handelt. Die Analyse minimal residueller Erkrankung und der Einsatz hochauflösender Chimärismusuntersuchungen von Leukozytensubpopulationen sollte die Bedeutung des gemischten Chimärismus weiter klären und zu einem gezielteren Einsatz von DLI führen. Prospektive vergleichende Studien müssen in naher Zukunft den Stellenwert der NST untersuchen. / Our clinical investigations demonstrate, that nonmyeloablative stem cell transplantation (NST) is a novel therapeutic option in patients with high-risk ALL or AML. NST can be administered to patients eligible for allogeneic stem cell transplantation with contraindications against high-dose radio- and chemotherapy (standard SCT). After NST, infections and late onset acute graft-versus-host disease (GvHD) frequently occurred, but transplant-related mortality was low in contrast to standard SCT. Leukemia-free survival and overall survival were similar after NST and standard SCT. A higher relapse rate after NST was balanced by a higher transplant-related mortality after standard SCT. The conditioning regimen itself had no relevant impact on survival. Sequential chimerism analyses of leukocyte subpopulations resulted in early diagnosis of mixed chimerism, which proved to be predictive for later relapses. Stable mixed chimerism was not established in these patients. Adoptive immunotherapy in patients, who were in hematologic remission but had mixed chimerism after transplantation, induced conversion to complete donor chimerism and long-lasting complete remissions in the majority of patients, a strong hint to a graft-versus-leukemia-effect (GvL) of donor T-lymphocyte infusions. A change in the character of stem cell transplantation was achieved by NST with a shift from the predominantly cytoreductive effect of standard SCT towards an emphasis on the immunologic GvL-effect. Our results demonstrated the efficacy of a GvL-effect in acute leukemias after NST. The experiences with NST in acute leukemias have prompted studies in patients with refractory advanced renal cell cancer. Tumor regressions were observed only after chimerism conversion and / or development of GvHD, these results being compatible with a graft-versus-tumor effect (GvT). However, transplant-related morbidity was substantial in these mostly elderly patients. Therapy within clinical studies is mandatory, because allogeneic stem cell transplantation still has to be regarded an experimental procedure in these patients. The analysis of minimal residual disease and application of high-resolution chimerism analysis of leukocyte subpopulations by microarrays could lead to a more profound understanding of mixed chimerism and to a more rational use of DLI in the near future. Prospective randomized trials should be conducted to evaluate the role of NST.

Auch unter physiologischen Bedingungen finden sich T-Zellen und andere Leukozyten nicht nur in den Sinusoiden, sondern auch im Parenchym der Leber. Da die Leber u. a. verschiedene Aufgaben für das Immunsystem übernimmt (z. B. Deletion aktivierter T Zellen, Induktion peripherer Toleranz), könnte die Akkumulation der T-Zellen in der Leber - neben der immunologischen Überwachung der Leber - Voraussetzung für ihre Modulation sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Leber-sinusoidalen Endothelzellen (LSEC), der Barriere zwischen Blut und Leber-Parenchym, auf CD4+ T-Zellen untersucht. Zum einen zeigte sich, dass die LSEC sowohl die spontane Transmigration der T-Zellen, als auch ihre Chemotaxis zu CXCL9 und CXCL12 effizienter unterstützen als andere Endothelien. Eine endotheliale Aktivierung durch die Chemokine wurde als Mechanismus ausgeschlossen. Dagegen schien eine effiziente Präsentation der Chemokine auf der luminalen LSEC-Oberfläche nach Aufnahme von abluminal für die gesteigerte Transmigration der T Zellen verantwortlich zu sein. Die LSEC könnten somit in vivo an der Rekrutierung von T-Zellen in die Leber beteiligt sein, indem sie eine rasche Wanderung der T-Zellen aus dem Blut ins Parenchym und möglicherweise auch zurück in die Zirkulation zulassen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die LSEC fähig sind, naive CD4+ T-Zellen in vitro Antigen-spezifisch zu aktivieren. Im Vergleich zu professionellen APZ war hierfür eine höhere Antigen-Dosis notwendig, die Expansion schwächer und es waren kaum Effektorzytokin-Produzenten detektierbar. Diese konnten jedoch durch Restimulierung mit professionellen APZ induziert werden (reversibler Phänotyp), was auf einen unreifen Differenzierungsstatus der T-Zellen schließen ließ. Es bleibt zu prüfen, in welchem Maße die Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC in vivo stattfindet und diese durch LSEC aktivierten CD4+ T-Zellen funktionelle Bedeutung, z. B. regulatorische Kapazität, für das Immunsystem besitzen. / The liver plays a major role for the metabolism, but it is also of general importance for the immune system, e.g. for the deletion of activated T cells or the induction of peripheral tolerance. Under physiological conditions T cells and other leukocytes can be found in the liver, in the sinusoids as well as in the parenchyma. This hepatic accumulation of T cells might be due to immunosurveillance, but it would also be a prerequisite for modulation of T cells by hepatic cells. The present study investigated two different aspects of the interaction of liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the barrier between the sinusoidal lumen and the hepatic parenchyma, and CD4+ T cells. In the first part of the study it could be demonstrated that LSEC support the spontaneous transmigration of CD4+ T cells as well as their chemotaxis to CXCL12 and CXCL9 more efficiently than other endothelial cells. Whereas a direct endothelial activation by chemokines could be excluded the efficient chemokine presentation at the luminal LSEC surface (after abluminal uptake) might be responsible for the enhanced T cell transmigration. The findings suggest that LSEC might be involved in the recruitment of T cells by supporting a rapid transendothelial migration. The second part of the study focused on the characteristics of LSEC in the context of antigen presentation. LSEC were able to prime and expand naïve CD4+ T cells in vitro but less effective than professional APC as proven by weaker expansion of cells, a requirement for higher antigen concentration and the lack of cytokine producing T cells. The “immature effector” phenotype of the CD4+ T cells primed on LSEC was reversible since it could be overcome by restimulation on professional APC. In conclusion these data suggest that antigen presentation by LSEC results in activation but incomplete differentiation of CD4+ T cells.

Die molekulare Charakterisierung von genetischen Veränderungen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) wurde vor allem bei jungen Patienten vorangebracht, hingegen fehlen Analysen für die AML bei älteren Patienten. Entsprechend ergab sich die Rationale, genetische und epigenetische Alterationen bei älteren AML Patienten zu untersuchen, um spezifische Signaturen zu identifizieren. Wir untersuchten ältere 93 AML Patienten aus dem Study Alliance Leukemia (SAL) Register. Es wurden 555 Gene auf der Illumina HiSeq2000 Plattform sequenziert und DNA Methylierungsprofile mittels dem Illumina 450K Array untersucht. Insgesamt wurden 814 molekulare Alterationen in 281 Genen detektiert. Besonders hohe Mutationsfrequenzen wurden in den Genen DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) und ASXL1 (21%) notiert. Alterationen in epigenetischen Regulatoren (85%) und in Genen, die in Splicing involviert sind (38%), wurden gehäuft beobachtet. Ältere AML Patienten mit Mutationen in DNMT3A oder DNA Reparaturgenen wiesen eine geringere Lebenserwartung im Vergleich zu der restlichen Kohorte auf. Wir verglichen die Meythlierungsdaten aus der SAL mit denen der TCGA Kohorte, umso die Methylierungsmuster von älteren mit denen von jüngeren Patienten zu differenzieren. Es konnte ein distinktes Methylierungsprofil in den DNA Proben von älteren AML Patienten nachgewiesen werden. Die im Vergleich zu jüngeren AML Patienten unterschiedlich methylierten Regionen bei älteren AML Patienten überlappten mit Genen verschiedener Signalwege, die Hallmarks von Alterungsprozessen und Krebs entsprechen. Zusammenfassend konnten wir für die Kohorte älterer AML Patienten genetische Alterationen nachweisen und mit spezifischen Profilen von Mutationen in epigenetischen Regulatoren korrelieren. Diese molekulare Kategorisierung unterstreicht distinkte biologische Mechanismen in älteren AML Patienten und die Notwendigkeit von spezifischen Therapieansätzen für diese Kohorte mit ungünstiger Prognose. / Despite advances in the characterization of molecular alterations in younger acute myeloid leukemia (AML) patients, comprehensive studies in elderly AML are lacking. Thus, we investigated genetic and epigenetic alterations and probed for specific signatures to understand the unfavorable outcomes of elderly AML. We studied 93 AML patients (65 to 90 years old), enrolled in the Study Alliance Leukemia registry (SAL). To capture a broad spectrum of alterations, we sequenced 555 genes on an Illumina HiSeq2000 platform and investigated DNA methylation profiles using the Illumina 450K array. Overall, we detected 814 molecular alterations in 281 genes, with a median of 7 genes mutated per patient. Particularly high mutation frequencies were identified for DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) and ASXL1 (21%). We observed frequent alterations in epigenetic regulators (85%) and in splicing factors (38%). Notably, SAL elderly AML patients with mutations in DNMT3A or DNA repair genes (in absence of mutations in NPM1 or splicing factors) had an inferior survival of only 9 months (compared to 17 months for the remaining patients). In addition, for the analysis of elderly AML DNA methylation, we integrated the SAL cohort with TCGA methylation data for comparisons of methylation levels to younger patients. A distinct DNA methylation profile was observed in older AML patients, which correlated with the presence of mutations in IDH1/2, RUNX1 and ASXL1 and epigenetic similarities with TP53/Complex samples. The differential methylated regions of elderly AML (compared to younger AML samples) were shown to overlap genes from several pathways that are hallmarks of both age and cancer. In conclusion, we unraveled distinct patterns of genetic alterations and correlated specific epigenetic profiles of elderly AML to high rate mutated epigenetic regulators. This molecular categorization underscored the distinct biology and the need for specific therapeutic approaches in elderly AML.