Purinerge P2X3-Rezeptoren spielen eine bedeutende Rolle in der Vermittlung chronischer Schmerzen, welche ein führendes Problem des Gesundheitswesens mit vielen sozioökonomischen Konsequenzen darstellen. Die Tatsache, dass P2X3-Rezeptoren fast ausschließlich von nozizeptiven Neuronen exprimiert werden, macht sie trotz ihres besonderen Desensitisierungsverhaltens zu vielversprechenden Angriffspunkten zukünftiger Schmerztherapien, beispielsweise mithilfe kompetitiver Antagonisten an diesen Rezeptoren. Zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Agonist und kompetitivem Antagonist wird meist der Schild-Plot benutzt. Jedoch ist dieser im Falle der sehr schnell desensitisierenden P2X3-Rezeptoren ungeeignet, da die Vorbedingung eines stabilen Gleichgewichts zwischen Agonist und Antagonist aufgrund der Desensitisierung nicht erfüllt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Methode zur Analyse der Interaktion kompetitiver Antagonisten mit ihrer Bindungsstelle am Beispiel des P2X3-Rezeptors zu entwickeln und so für die Antagonistenbindung bedeutende Aminosäuren der Bindungsstelle zu identifizieren. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden die Effekte der Antagonisten A-317491, TNP-ATP und PPADS auf die vom P2X1,3-Rezeptor-selektiven Agonisten α,β-MeATP induzierten Ströme am P2X3-Wildtyp-Rezeptor und an fünf Rezeptormutanten mit veränderter Ligandenbindungsstelle untersucht. Alle Rezeptoren wurden in HEK293-Zellen exprimiert. Anhand der gemessenen Daten wurde ein Hidden Markov Model (HMM) erstellt, welches die sequentiellen Übergänge des Rezeptors von geschlossen zu offen und desensitisiert in An- und Abwesenheit des Antagonisten miteinander kombiniert. Die am P2X3-Rezeptor induzierten Ströme konnten mithilfe dieses Modells korrekt gefittet und die für die Antagonistenbindung wichtigen Aminosäuren innerhalb der Bindungsstelle bestimmt werden. Als Resultat dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das HMM eine geeignete Methode zur Analyse der Wirkung kompetitiver Antagonisten an schnell desensitisierenden Rezeptoren darstellt. Die untersuchten Antagonisten A-317491 und TNP-ATP haben einen kompetitiven Wirkmechanismus, während PPADS eine pseudoirreversible Blockade verursacht.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / ApÃs isquemia cerebral, o Trifosfato de Adenosina (ATP) atinge altas concentraÃÃes no espaÃo extracelular e pode atuar como agente tÃxico, que causa degeneraÃÃo celular e morte, mediada atravÃs de receptores P2X e P2Y. No presente estudo, foram investigados os efeitos do PPADS, um antagonista nÃo-seletivo dos receptores P2, sobre o comportamento e dano neuronal apÃs isquemia induzida por oclusÃo permanente da artÃria cerebral mÃdia por eletrocoagulaÃÃo. Os animais receberam PPADS (0,1, 0,5 e 1,0 nmols/1&#956;L) ou fluÃdo cerebroespinhal artificial (FCE) por injeÃÃo intracerebroventricular 10 min antes da isquemia. Os parÃmetros estudados foram funÃÃo sensÃrio-motora, aquisiÃÃo e retenÃÃo de memÃria, Ãrea de infarto cerebral e atividade da MPO, como marcador para infiltraÃÃo granulocÃtica. ApÃs isquemia, verificou-se atravÃs de avaliaÃÃo neurolÃgica, uma diminuiÃÃo significante do desempenho motor e funÃÃo sensorial dos animais. A percentagem da Ãrea de infarto nos animais falso-operados foi significantemente menor que naqueles submetidos à isquemia (FO: 0,89  0,18%; FO + PPADS 1,0: 1,18  0,1%; ISQ: 9,06  1,2%; ISQ + PPADS 0,5: 2,2  0,32%; ISQ + PPADS 1,0: 1,86  0, 18%). Foi observado ainda um aumento da atividade exploratÃria vertical (n de Rearings) nos animais tratados com PPADS quando comparados aos animais do grupo isquemiado (ISQ: 9,5  1,8; ISQ + PPADS 0,5: 26,9  2,9; ISQ + PPADS 1,0: 20,6  3,7; Kruskall-Wallis, p<0.05). O tratamento com PPADS melhorou de forma significante os dÃficits na memÃria operacional induzidos pela isquemia, avaliado no teste do Labirinto em Y (FO: 73,8  1,9%; ISQ: 56,7  2,9%; ISQ + PPADS 0,5: 76,7  3,2%; ISQ + PPADS 1,0: 72,6  4,0%). Um resultado semelhante foi observado na memÃria aversiva (teste da esquiva passiva) no qual o PPADS melhorou a aquisiÃÃo de memÃria de curta duraÃÃo. Os animais isquemiados demonstraram um aumento nos nÃveis de MPO no estriado (FO: 3,6  0,63; ISQ: 16,24  4,86) e cÃrtex temporal (FO: 6,16  1,23; ISQ: 22,33  4,98), e o tratamento com PPADS (1,0 nmols/1&#956;L) reverteu significantemente esse efeito (ISQ + PPADS â estriado: 6,13  0,65; cÃrtex: 6,28  0,38). Os resultados demonstram o envolvimento dos receptores P2 na fisiopatologia da isquemia cerebral. A inibiÃÃo dos receptores P2 pelo PPADS mostrou um significante efeito neuroprotetor sobre o dano neuronal, comportamento motor e memÃria apÃs isquemia e indicam que este efeito pode estar relacionado pelo menos em parte a uma atividade antiinflamatÃria deste composto.

Purinerge P2X3-Rezeptoren spielen eine bedeutende Rolle in der Vermittlung chronischer Schmerzen, welche ein führendes Problem des Gesundheitswesens mit vielen sozioökonomischen Konsequenzen darstellen. Die Tatsache, dass P2X3-Rezeptoren fast ausschließlich von nozizeptiven Neuronen exprimiert werden, macht sie trotz ihres besonderen Desensitisierungsverhaltens zu vielversprechenden Angriffspunkten zukünftiger Schmerztherapien, beispielsweise mithilfe kompetitiver Antagonisten an diesen Rezeptoren. Zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Agonist und kompetitivem Antagonist wird meist der Schild-Plot benutzt. Jedoch ist dieser im Falle der sehr schnell desensitisierenden P2X3-Rezeptoren ungeeignet, da die Vorbedingung eines stabilen Gleichgewichts zwischen Agonist und Antagonist aufgrund der Desensitisierung nicht erfüllt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Methode zur Analyse der Interaktion kompetitiver Antagonisten mit ihrer Bindungsstelle am Beispiel des P2X3-Rezeptors zu entwickeln und so für die Antagonistenbindung bedeutende Aminosäuren der Bindungsstelle zu identifizieren. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden die Effekte der Antagonisten A-317491, TNP-ATP und PPADS auf die vom P2X1,3-Rezeptor-selektiven Agonisten α,β-MeATP induzierten Ströme am P2X3-Wildtyp-Rezeptor und an fünf Rezeptormutanten mit veränderter Ligandenbindungsstelle untersucht. Alle Rezeptoren wurden in HEK293-Zellen exprimiert. Anhand der gemessenen Daten wurde ein Hidden Markov Model (HMM) erstellt, welches die sequentiellen Übergänge des Rezeptors von geschlossen zu offen und desensitisiert in An- und Abwesenheit des Antagonisten miteinander kombiniert. Die am P2X3-Rezeptor induzierten Ströme konnten mithilfe dieses Modells korrekt gefittet und die für die Antagonistenbindung wichtigen Aminosäuren innerhalb der Bindungsstelle bestimmt werden. Als Resultat dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das HMM eine geeignete Methode zur Analyse der Wirkung kompetitiver Antagonisten an schnell desensitisierenden Rezeptoren darstellt. Die untersuchten Antagonisten A-317491 und TNP-ATP haben einen kompetitiven Wirkmechanismus, während PPADS eine pseudoirreversible Blockade verursacht.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4102.pdf: 1499777 bytes, checksum: 83d49633865ad84ab741b0091f168280 (MD5) Previous issue date: 2011-12-14 / Universidade Federal de Minas Gerais / Locus coeruleus (LC) is considered as a chemosensitive region to CO2/pH in mammals and amphibians, mainly its noradrenergic neurons. The LC purinergic neuromodulation is of particular interest since adenosine 5′-triphosphate (ATP) acts as a neuromodulator in many brainstem areas involved in cardiovascular and respiratory regulation, which includes Locus coeruleus (LC). ATP acting on LC P2 receptors influences the release of noradrenaline (NE) and the LC noradrenergic neurons are involved in the CO2-drive to breathing. Thus, the goal of the present study was to investigate the role of purinergic neuromodulation in the LC in the ventilatory, thermal and cardiovascular responses during normocapnia and hypercapnia in Wistar male unanesthetized rats. We assessed the purinergic modulation of cardiorespiratory and thermal responses by microinjecting ATP P2X receptor agonist (α,β-MeATP, 0.5 nmoL/40 nL and 1 nmoL/40 nL) and P2 receptor non selective antagonists (PPADS 0.5 nmoL/40 nL and 1 nmoL/40 nL; suramin, 1 nmoL/40 nL) into the LC. Pulmonary ventilation (VE, plethysmography), mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and body core temperature (Tb, dataloggers) were measured before and after unilateral microinjection (40 nL) of α,β-MeATP, PPADS, suramin or 0.9% saline (vehicle) into the LC during 60 min normocapnia or 30 min period of 7% CO2 exposure followed by 30 min of normocapnia. Under normocapnic conditions, α,β-MeATP did not affect any parameter, whereas PPADS decreased respiratory frequency (f), increased MAP and HR and suramin increased Tb, MAP and HR and did not change ventilation. Hypercapnia induced an increase in ventilation, a fall in HR and did not change Tb in all groups. During hypercapnia, α,β-MeATP produced a further increase in ventilation and did not cause changes in cardiovascular and thermal parameters, PPADS caused an increase in MAP, did not alter ventilation and Tb and suramin elicited increases in ventilation, MAP and bradycardia and did not change Tb. Thus, our data suggest that purinergic neuromodulation in the LC plays an important role in the cardiorespiratory control during hypercapnia and modulates cardiorrespiratory and thermal control during normocapnic conditions in unanesthetized animals. / O LC é considerado uma região quimiossensível a CO2/pH em mamíferos e anfíbios, especificamente os neurônios noradrenérgicos. A neuromodulação purinérgica no LC desperta um interesse particular uma vez que a adenosina 5 -trifosfato (ATP) atua como neuromodulador em várias áreas do tronco encefálico envolvidas na regulação cardiorrespiratória, incluindo o LC e sua atuação em receptores P2 influencia a liberação de noradrenalina (NE) dos neurônios do LC. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar a participação da neuromodulação purinérgica no LC nas respostas ventilatória, térmica e cardiovascular durante normocapnia e hipercapnia em ratos Wistar não anestesiados. A possível modulação do ATP nessas respostas foi realizada por meio da microinjeção do agonista de receptor P2X (α,β-MeATP, 0.5 nmol/40 nL e 1 nmol/40 nL) e dos antagonistas não seletivos de receptor P2 (PPADS 0.5 nmol/40 nL e 1 nmol/40 nL; suramin, 1nmol/40nL) no LC. Foram feitas medidas de ventilação pulmonar ( VE, pletismografia), temperatura corporal (TC) pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) antes da microinjeção unilateral de α,β--MeATP, PPADS, suramin ou salina (veículo, 40nL) no LC em condições basais, e após microinjeção durante 60 min de normocapnia ou 30 min de exposição a 7% CO2, seguido de 30 min de normocapnia. Em condições normocápnicas, a microinjeção de α,β-MeATP não afetou nenhuma das variáveis analisadas, enquanto que o PPADS promoveu uma redução da freqüência respiratória (fR), aumento da PAM e FC, e o suramin aumentou a TC, PAM e FC sem causar alterações na ventilação. A hipercapnia promoveu aumento da ventilação, uma redução na FC e não alterou a TC em todos os grupos. Durante hipercapnia, α,β-MeATP promoveu aumento da hiperpnéia sem causar alterações nas variáveis cardiovasculares e na temperatura, PPADS promoveu aumento da PAM sem alterar as variáveis respiratórias e a temperatura corporal e o suramin promoveu aumento da hiperventilação, aumento na PAM e bradicardia sem alterar a temperatura corporal. Portanto, nossos dados sugerem que a neuromodulação purinérgica no LC participa do controle cardiorrespiratório durante normocapnia e hipercapnia e modula a termorregulação em condições normocápnicas em animais não anestesiados.