Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En esta Memoria se desarrolló una metodología por HPLC, para ser empleada en el estudio de estabilidad hidrolítica del fármaco hipocolesterolémico pravastatina. Las condiciones óptimas fueron alcanzadas luego de llevar a cabo el ensayo de aptitud del sistema (system suitability test, USP XXVII), y consistieron en una fase móvil isocrática: acetonitrilo/tampón fosfato 30 mM, pH 2.0 (28/72), flujo 1 mL/min a 40 ºC. Las condiciones óptimas se seleccionaron en base a la combinación adecuada entre los valores de resolución (R), factor de capacidad (k’), selectividad (α),tiempos de retención de cada señal y el tiempo de corrida del cromatograma. En estas condiciones pravastatina exhibió un tiempo de retención (tr) promedio de 8.95 min (n=10), R= 2.1, k’= 5.5 y =1.16. La metodología exhibió características analíticas de repetibilidad (CV=0.11 %) y reproducibilidad (CV=0.49 %) adecuadas para ser empleada en estudios de estabilidad. Para la cuantificación se empleó el método de la curva de calibración, que estuvo descrita por la ecuación: ABC = 2.74×1010 [c] + 72267 (r= 0.99992; n= 7). Los límites de detección y cuantificación calculados fueron 3.4×10-7 M y 3.7×10-6 M, respectivamente. El estudio de estabilidad se realizó a cuatro concentraciones iniciales, tres temperaturas y cinco pH en tampón fosfato 30 mM, con el fin de lograr interpretar la influencia de estas variables sobre la velocidad de degradación de pravastatina. En todas las condiciones de pH y temperatura ensayadas se obtuvo una cinética mixta, en las cuales se ajustó a una cinética de seudo primer orden hasta aproximadamente el 50 % de degradación del fármaco. Para evaluar la influencia del pH en la degradación, se ensayaron los pH 3, 5, 7, 9 y 12. A pH < 7 los cromatogramas presentan cinco nuevas señales correspondientes a los productos de degradación, a tr de 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min y 19.47 min. A pH > 7 sólo se observa la aparición de una nueva señal, a tr de 1.90 min. En todos los casos estudiados, las nuevas señales presentan un espectro UV análogo al de pravastatina, lo cual indica que la hidrólisis no afecta la estructura cromófora del fármaco. Con el objeto de evaluar la influencia de la temperatura sobre la degradación de pravastatina, se llevaron a cabo experimentos a 40, 60 y 80 ºC, obteniéndose que la constante de velocidad de degradación (k) aumenta en forma concomitante con el incremento de la temperatura. Además se reportan los valores de energías de activación, vidas medias y t90 calculadas para la degradación de pravastatina. Adicionalmente se estudió la reactividad de pravastatina frente a radicales libres y peroxinitrito, como modelos predictivos de su estabilidad oxidativa tanto en preformulaciones como in vivo. Se empleó como técnica analítica la espectrofotometría UV-Visible y como generadores de radicales alquilo ABAP+ N2, radicales alquilperoxilo ABAP + O2, y ABTS (radicales ABTS+). Para evaluar la reactividad frente a peroxinitrito se empleó SIN-1. La reactividad frente a ABAP y SIN-1 se llevó a cabo siguiendo la señal del fármaco a 240 nm, empleando el método de la curva de calibración (A = 2.04×10-8 [c] + 4.55×10-9). Para ABTS+ se siguió el decaimiento de su señal a 734 nm. Pravastatina (40 M a 100 M) fue reactiva frente a todos los compuestos ensayados, encontrándose que el orden de reactividad fue: peroxilo (k=1.13×10-2 min-1)  alquilo (k=7.07×10-3 min-1) > peroxinitrito (k=2.68×10-3 min-1)  ABTS.+ (k=1.20×10-3 min-1). Además, se informa la reactividad de estos compuestos frente otros análogos estructurales de la pravastatina: los profármacos lovastatina y simvastatina, y sus análogos de cadena abierta obtenidos experimentalmente por hidrólisis alcalina exhaustiva. / In this Thesis a methodology by high HPLC was developed, with aim to be used in the stability study in front of hydrolysis of the hypocholesterolemic drug pravastatin. The optimal conditions were reached after carried out the system suitability test according to USP XXVII, which consisted of an isocratic mobile phase of 30 mM acetonitrile/phosphate buffer, pH 2.0 (28/72), flow rate of 1 mL/min at 40 ºC. The optimal conditions were selected on the basis of the combination between the values of resolution (R), capacity factor (k'), selectivity (α), the retention times of each signal and the run time of the chromatogram. In these conditions pravastatin exhibited a retention time (Rt) average of 8.955 min (n =10), R = 2.1, k' = 5.5 and α = 1.16. The methodology exhibited analytical characteristics of repeatability (CV=0.11 %) and reproducibility (CV=0.49%) adequate to be used in stability studies. For the quantification the calibration curve method was used, and was described by the equation: ABC=2.74×1010 [c] + 72267 (r =0.99992; n=7). The detection and quantification limits were 3.4×10-7 M and 3.7×10-6 M, respectively. The stability study were carried out at four initial concentrations, three temperatures and five pH in 30 mM phosphate buffer, with the aim of evaluate the influence of these variables on the pravastatin degradation. In all the tested conditions of pH and temperature a mixed kinetic was obtained, in which it adjusted to a pseudo-first order kinetic until approximately 50% of degradation of the drug. In order to evaluate the effect of pH on the degradation, pH 3, 5, 7, 9 and 12 were assayed. At pH<7, five new signals corresponding to degradation products appears in the chromatograms, with Rt of 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min and 19.47 min. At pH>7 only a new signal in the chromatograms was observed, at the same Rt of 1.90 min. In all the studied cases, the new signals display an UV spectrum similar to that of pravastatin, which indicates that the hydrolysis process does not affect the chromophore structure of the drug. With the aim to evaluate the influence of temperature on the hydrolytic degradation; experiments at 40, 60 and 80 ºC were carried out. From these experiments was obtained that the degradation rate constant (k) increases concomitantly as the temperature increase. Also, activation energies values, half lives and t90 values for the degradation of pravastatin are reported. Additionally, the reactivity of pravastatin in front of free radicals and peroxinitrite, as predictive models of its oxidative stability in both preformulations and in vivo, were studied. For this study UV/Vis spectrophotometry was used as analytical technique and ABAP + N2 as alkyl radical’s generator, ABAP + O2 as alkylperoxyl radical’s generator, and ABTS (ABTS+). The reactivity with peroxynitrite was evaluated by using SIN-1. The reactivity of pravastatin in front of ABAP and SIN-1 was assess following the spectrophotometric signal of the drug at 240nm, using the calibration curve method (A = 2.04×10-8[c] + 4.55×10-9). For ABTS+ the decay of its signal at 734 nm was used. Concentrations of pravastatin in the range of 40 μM to 100 μM were studied. The drug was reactive in front to all the compounds assayed, and the reactivity ranking was: ABAP+O2 (k=1.13×10-2 min-1) ≥ ABAP+ N2 (k=7.07×10-3 min-1) > SIN-1 (k=2.68×10-3 min-1) ≥ ABTS (k=1.2×10-3 min-1), that means: alkylperoxyl ≥ alky > peroxynitrite ≥ ABTS•+. In addition, the reactivity of these compounds in front other structural analogous of pravastatin: the prodrugs lovastatin and simvastatin, and their analogous of open chain experimentally obtained by exhaustive alkaline hydrolysis are reported.

Por meio da técnica de microperfusão estacionária in vivo, túbulos proximais (TP) de ratos Wistar foram perfundidos com solução CTRL contendo ou não Sinva 100&#956;M ou Sil 10&#956;M para determinar a reabsorção de bicarbonato (JHCO3-). A perfusão de Sil diminuiu o JHCO3- em 20%, enquanto que Sinva incrementou em 19,31% o JHCO3- comparado com o CTRL. Já a Prav diminuiu em 15% o JHCO3- . Para testar se os efeitos foram dependents de NHE3, PTs foram perfundidos com CTRL, Sil, Sinva ou Prav mais S3226, um inibidor específico de NHE3. O JHCO3- remanescente (insensível à S3226) não foi diferente entre os grupos, mostrando que NHE3 foi modulado por Sil e Sinva. Já o efeito inibitório da Prav ocorre não apenas via NHE3 mas também via H+ ATPase. Para determinar se a via Rho está envolvida nestes efeitos, os PTs foram perfundidos com Y-27632 1&#956;M, inibidor de Rho GTPase. A perfusão com Y-27632 reverteu o efeito inibitório promovido tanto pelo Sil quanto pela Prav, demonstrando que o efeito inibitório destes fármacos sobre a atividade do NHE3 ocorre via Rho. Além disso, o efeito inibitório de Sil foi completamente abolido pelo inibidor de PKG dependente de GMPc KT5823 10-6 M. Para confirmar estes resultados, animais foram mantidos em gaiolas metabólicas por 24 h e tratados via oral com 7mg/Kg/dia de Sinva e 20mg/Kg/dia de Sil. Sil diminuiu a CE Na+, indicando que outros mecanismos de transporte podem estar envolvidos em alterações no manejo de Na+ pelos rins promovidas por Sil. Já a infusão de Prav em ratos Wistar pela jugular durante 30 min promoveu aumento da CE Na+, sugerindo que o fármaco age inibindo NHE3. / By means of stationary microperfusion, PT of Wistar rats were perfused with a CTRL solution with or without 100&#956;M Simva or 10&#956;M Sil to determine bicarbonate reabsorption (JHCO3-). Perfusion of Sil decreased JHCO3- by 20% and perfusion of Simva increased JHCO3- by 19,31% compared to CTRL. Prav decreased JHCO3- by 15%. To test if these effects were NHE3-dependent, PTs were perfused with CTRL, Sil, Simva or Prav plus 2&#956; M S3226, a specific NHE3 inhibitor. The reminiscent S3226-insensitive JHCO3- was not different among groups, showing that NHE3 was modulated by Sil or Simva. To determine if Rho was involved in these effects, the PTs were perfused with the Rho GTPase inhibitor Y-27632 (1&#956;M). Perfusion with Y-27632 reversed the inhibitory effect promoted by both Sil and Prav, demonstrating that the inhibitory effect of these drugs on NHE3 activity occurs via Rho. Furthermore, the inhibitory effect of Sil was completely abolished by either the protein kinase G (PKG) inhibitor dependent of cGPM KT5823 10-6 M. To confirm our results the animals were kept for 24 hours in metabolic cages and treated orally with 7mg/kg Sim or 20mg/kg Sil. The Sil decreased the Na+ excretion load, indicating that other transport mechanisms beyond the proximal tubule involved in the changes of handling of Na+ by the treatment with Sil. On the other hand, the infusion of Prav in Wistar rats by jugular for 30 min promoted an increase in Na+ CE, suggesting that the drug acts by inhibiting NHE3.

Orientador: Carlos Alan Candido Dias Junior / Resumo: Durante a gestação, diversas adaptações fisiológicas ocorrem no organismo materno para atender as necessidades nutricionais do feto em desenvolvimento. Entre essas adaptações, encontramos aumento do débito cardíaco e do volume sanguíneo, os quais são compensados pela drástica redução da resistência vascular sistêmica, promovendo a manutenção da pressão arterial materna nas gestações. O endotélio vascular apresenta um importante papel neste processo fisiológico por secretar fatores vasoativos como o óxido nítrico, um vasodilatador que se encontra aumentado em gestações saudáveis. Em algumas mulheres, falhas nesses mecanismos podem causar desordens hipertensivas gestacionais. A pré-eclâmpsia é uma desordem hipertensiva gestacional caracterizada pela elevação da pressão arterial (≥ 140 x 90 mmHg), após a 20ª semana gestacional. É frequentemente acompanhada de proteinúria e acomete 5-8% das gestantes. Atualmente, embora a fisiopatologia da pré-eclâmpsia seja desconhecida, estudos sugerem que sua ocorrência envolva migração deficiente de citotrofoblastos, culminando em má placentação e consequente isquemia/hipóxia placentária, responsável pela liberação de fatores bioativos promovendo danos às células endoteliais. A disfunção endotelial resulta na redução da biodisponibilidade de óxido nítrico, gerando as principais características da pré-eclâmpsia, como hipertensão materna e restrição de crescimento fetal. Recentes estudos apontam a importância da manutenção dos níveis de óxido n... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During gestation, several physiological adaptations occur in the maternal organism to provide the nutritional demands of the developing fetus. Among these adaptations, we found increase in cardiac output and blood volume, which are compensated by the drastic reduction of systemic vascular resistance, promoting the maintenance of maternal blood pressure in gestations. Vascular endothelium plays an important role in this physiological process by secreting vasoactive factors such as nitric oxide, a vasodilator that is increased in healthy pregnancies. In some women, fails in these mechanisms may cause gestational hypertensive disorders. Preeclampsia is a gestational hypertensive disorder characterized by elevated blood pressure (≥ 140 x 90 mmHg) after the 20th gestational week. It is often accompanied by proteinuria and affects 5-8% of pregnant women. Currently, although the pathophysiology of preeclampsia is unknown, studies suggest that its occurrence involves poor migration of cytotrophoblasts culminating in poor placentation and consequent ischemia/placental hypoxia, responsible for the release of bioactive factors promoting damage to endothelial cells. Endothelial dysfunction results in the reduction of the bioavailability of nitric oxide leading to the occurrence of the main characteristics of preeclampsia, mainly maternal hypertension and fetal growth restriction. Recent studies point to the importance of maintaining levels of nitric oxide, which is associated with health... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by MARIANA MAURO null (mamaurofarm@gmail.com) on 2016-08-19T18:10:28Z No. of bitstreams: 1 MARIANA Dissertação.pdf: 2027586 bytes, checksum: c109c012716ad7eba88d5828ee7295a5 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica e sem a folha de aprovação. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-08-23T18:18:39Z (GMT) / Submitted by MARIANA MAURO null (mamaurofarm@gmail.com) on 2016-08-23T21:13:02Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-24T15:04:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mauro_m_me_arafcf.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T15:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mauro_m_me_arafcf.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) Previous issue date: 2016-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A exposição ocupacional a agentes químicos é potencialmente capaz de modificar a disposição cinética ou o metabolismo de fármacos, principalmente em função da indução ou inibição de enzimas do sistema citocromo P450. Entretanto, estudos que mostram o efeito da exposição ocupacional a agentes químicos na atividade de transportadores de fármacos são escassos. O tolueno está presente no ambiente de trabalho principalmente na forma de vapor. Neste ambiente, o solvente é absorvido principalmente por inalação. O objetivo do estudo é avaliar a influência da exposição inalatória ao tolueno na atividade in vivo do polipeptídeo transportador de ânions orgânicos da família Oatp em ratos, empregando como fármaco marcador a pravastatina. Ratos machos Wistar (n=6 por tempo de coleta, por grupo) foram expostos ao tolueno (85 mg/m3) por inalação ou ao ar em câmara de exposição apenas pelo nariz por 6 horas/dia, 5 dias/semana, 4 semanas. Ao final do período de exposição, os animais receberam dose única de pravastatina (20 mg/kg) por via oral. Amostras seriadas de sangue foram coletadas até 8 horas após a administração de pravastatina. As concentrações plasmáticas do fármaco foram avaliadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massas (LC-MS). O método de análise da pravastatina por LC-MS mostrou detectabilidade, precisão e exatidão compatíveis com a aplicação em estudos de disposição cinética após dose única em ratos. As áreas sob as curvas de concentração plasmática versus tempo (ASC) foram calculadas do tempo zero a infinito com base na Quadratura de Gauss-Laguerre. As concentrações de pravastatina correspondentes aos tempos avaliadas foram estimadas por interpolação polinomial. O clearance total aparente (CL/F) foi calculado a partir da equação: CL/F = dose/ASC0-∞. Na avaliação da disposição cinética da pravastatina, os animais não expostos ao tolueno apresentaram ASC0-∞ de 726 ng h/mL e Cl/F de 49,1 L/h kg. Não houve diferença estatística na ASC0-∞ ao comparar os animais expostos (ASC0-∞: 681,8 ng h/mL) e não expostos ao tolueno. Os resultados do estudo permitem concluir que a atividade de transportadores Oatp, avaliada pelo uso da pravastatina como fármaco marcador, não foi alterada após a exposição ao tolueno por inalação a 85 mg/m3, 6 horas/dia, 5 dias/semana, 4 semanas em ratos. / Occupational exposure to chemical agents is potentially able to modify the kinetic disposition of drug metabolism, mainly due to the induction or inibition of cytochrome P450 enzymes. However, studies investigating the influence of occupational exposure to chemicals on the variability in drug response are rare. Toluene is present in the working environment particularly in vapor form. In this environment, the toluene is mainly absorbed by inhalation. Considering that, the aim of this study was evaluate the influence of inhalation to toluene in the in vivo activity of the polypeptide transporter organic anion (Oatp) family transporters in rats, using pravastatin as a probe drug. Male Wistar rats (n=6, for each sampling time) were exposed to toluene (85 mg / m3) by inhalation or air in a nose only exposure system for 6 hours/day, 5 days/week, during 4 weeks. After 4 weeks of exposure, animals received a single dose of pravastatin (20 mg/kg) orally. Serial blood samples were collected up to 8 hours after administration of pravastatin. Plasma concentrations of pravastatin were measured by high-performance liquid chromatography with detection by mass spectrometry (LC-MS). The analysis method of pravastatin by LC-MS showed detectability, precision and accuracy compatible with the application in kinetic disposition studies after single doses in rats. The areas under the plasma concentration versus time (AUC) were calculated by zero to the infinity by the Gauss-Laguerre Quadrature. The concentrations corresponding to the times were estimated by polynomial interpolation. The total clearance apparent (CL/F) was calculated from the equation: CL/F = dose/AUC0-∞. In assessing the kinetics of pravastatin disposition, animals not exposed to toluene showed AUC0-∞ of 726 ng h/mL and CL/F of 49.1 L/h kg. There was no statistical difference in AUC0-∞ to compare the exposed animals (AUC0-∞: 681.8 ng h/mL) and not exposed to toluene. The results of this study showed that Oatp family transporters activity, assessed by the use of pravastatin as a marker drug, was not altered after exposure to toluene by inhalation at 85 mg/m3 6 hours/day, 5 days/week and for 4 weeks in rats. / CNPq: 448803/2014-3

Orientador: Eros Antonio de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T18:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taraborelli_Simone_M.pdf: 7158008 bytes, checksum: d0f4a8ee6fd688737f4070fd4a3082d6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Objetivo: Este estudo teve por objetivo avaliar a ação da pravastatina em ratos infartados normocolesterolêmicos em relação aos lípides plasmáticos, colesterol e peroxidação lipídica tecidual e função endotelial. Métodos: Foram utilizados cinquenta ratos wistar machos com três meses de idade e pesando entre 300 a 400 gramas, divididos em cinco grupos (N=10) e divididos nos seguintes grupos: grupo ratos controle (G1), grupo ratos sham (G2), grupo ratos com infarto experimental do miocárdio (G3), grupo infarto experimental do miocárdio e pravastatina sete dias após o infarto (G4) e grupo infarto experimental do miocárdio e pravastatina sete dias antes e acrescido de sete dias após infarto experimental do miocárdio (G5). A pravastatina foi administrada na dose de 7,5mg/kg/dia via gavagem. Os grupos G3, G4 e G5 foram submetidos a infarto do miocárdio por meio da ligadura da coronária descendente anterior. No final do experimento de cada grupo ocorreu a canulação da artéria carótida para verificação da pressão arterial. Os animais foram sacrificados mediante anestesia com tiopental sódico 30 mg/kg e, após, foi realizado o estudo da função endotelial, dosagem dos lípides plasmáticos, colesterol e peroxidação lipídica tecidual. Para análise dos resultados utilizou-se o teste de Man Whitney e análise de variância. Resultados: Não houve diferenças significativas entre os grupos quando observado os valores de glicose e triglicérides. O colesterol total no grupo G4 foi significantemente menor quando comparado aos demais grupos (p<0,05). Em relação a HDL - colesterol houve significância quando comparado o grupo G5 aos grupos G3 e G4. A LDL - colesterol apresentou-se significantemente menor quando comparado os grupos G4 e G5 ao grupo G3. O colesterol tecidual nos grupos G4 e G5 foi significantemente menores quando comparado ao grupo G3. A diferença significativa em relação à peroxidação lipídica ocorreu no grupo G4 quando comparado ao grupo G2. O relaxamento dependente do endotélio foi significante maior quando comparado os grupos G4 e G5 aos grupos G1, G2 e G3. Em relação à pressão arterial a significância ocorreu entre os grupos G3 e G4. Conclusão: A pravastatina, quando administrada em ratos normocolesterolêmicos com infarto do miocárdio, diminuiu o colesterol total, LDL - colesterol, colesterol tecidual, peroxidação lipídica e aumentou HDL - colesterol. Quanto à função endotelial, a pravastatina quando administrada antes, durante ou após o infarto resultou em melhora da disfunção endotelial / Abstract: Objective: To evaluate pravastatin action in the experimental myocardial infarct regarding to the endothelial function, plasmatic lipid, tissue lipidic peroxidation and cholesterol in infarcted normocholesterolemic rats. Materials and Methods: Fifty wistar rats were used divided in 5 groups (n=10): control group (G1), sham group (G2), infarct group (G3), infarct group with pravastatin seven day after the infarct (G4) and infarct group with pravastatin 7 day before and 7 day after the infarction (G5). Pravastatin was administrated 7,5mg/Kg/day via gavage. The groups G3, G4 and G5 were infarcted through the anterior descendent coronary tying. The animals were sacrificed by means of anesthesia with sodium thiopental 30mg/Kg and after this the endothelial function (Rmax), total cholesterol dosage (CT), triglycerides (TG), high density lipoprotein (HDL - c), low density lipoprotein (LDL - c), tissue lipidic peroxidation (MDA) and (Cte) cholesterol were performed. In order to do the statistical analysis the Man Whitney Test and variance analysis were used (p? 0,05 significance). Results: There was no significant difference among the groups when compared the glucose values and triglycerides. The total cholesterol G4 groups it was smaller significant when compared to the other groups (p<0, 05). In relation to HDL - c there was significance when compared the G5 group to the G3 and G4 group. LDL - c presented - if smaller significantly when compared the G4 and G5 groups to the G3 groups. The tissue cholesterol in the groups G4 and G5 there was smaller significant when compared to G3 group. The significant difference in relation to lipidic peroxidation it happened in the group G4 when compared to group G2. The dependent relaxation of the endothelium it was significant larger when compared the G4 and G5 groups to the G1, G2 and G3 groups. In relation to blood pressure the significant happened between the G3 and G4 groups. Conclusion: Pravastatin when administered in normocholesterolemic with myocardial infarct, it reduces the total cholesterol, LDL - c, tissue cholesterol, lipidic peroxidation and it increased HDL - c. As the function endothelium, the pravastatin when administered in normocholesterolemic rats with myocardial infarct, before, during or after the infarct of the myocardium it resulted in improvement of the endothelium dysfunction / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:43:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Naime_AnaCarolinaAntunes_M.pdf: 1176730 bytes, checksum: d42b22c3ad536a50c078c7dcc3f57226 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A sepse leva a uma alta taxa de mortalidade em hospitais de todo o mundo e por se tratar de um quadro clínico muito complexo ainda não há tratamento eficaz para o mesmo. Nas últimas décadas tem-se dado destaque para o papel das plaquetas na sepse, já que a gravidade do quadro correlaciona-se com o número de plaquetas circulantes e seu estado de ativação. Uma vez que as estatinas têm sido usadas clinicamente com muito sucesso no tratamento de doenças inflamatórias, decidimos investigar o efeito da pravastatina em plaquetas de ratos sadios e em modelo experimental de sepse induzida por lipopolissacarídeo (LPS). Para tanto, ratos foram tratados com solução salina ou pravastatina 20 mg/kg (gavagem, uma vez ao dia durante 7 dias). No sexto dia, os ratos de ambos os grupos receberam uma única injeção de salina ou de LPS (1 mg/kg, i.p.) e após 48h o sangue arterial foi coletado. A determinação plasmática de TNF-'alfa' e trombopoietina foi feita por ELISA. O número de megariócitos foi determinado pela histologia da medula óssea. A agregação plaquetária foi induzida por ADP (1-10 µM). A formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e GMPc foi analizada em plaquetas por citometria de fluxo utilizando a sonda fluorescente DCFH-DA e por kit comercial, respectvamente. Também foi avaliada a atividade enzimática da SOD e glutationa peroxidase (GPx) em plaquetas através de kits comerciais. Nos ratos injetados com salina, a pravastatina aumentou 3,7 vezes os níveis plasmáticos de TNF-'alfa'. Além disso, a pravastaina reduziu 36% o número de plaquetas circulantes. A agregação plaquetária induzida por ADP foi significativamente reduzida por esta estatina, a qual foi acompanhada de uma redução dos níveis intraplaquetários de GMPc. Apesar do aumento marcante da atividade enzimática da SOD e da GPx, a pravastatina aumentou 2,4 vezes a quantidade de EROs em plaquetas de ratos injetados com salina. A pravastatina reduziu o número aumentado de leucócitos totais observado em ratos injetados com LPS para os mesmos valores encontrados em ratos injetados com salina. A concentração plasmática aumentada de TNF-? também foi reduzida pelo pré-tratamento com pravastatina, mas ainda permaneceu significativamente maior do que a observada em ratos injetados com salina. O LPS reduziu 6.8 vezes o número de plaquetas circulantes, o qual foi acompanhado por aumento do número de megacariócitos e redução de trombopoetina. O pré-tratamento com pravastatina restaurou os valores de trombopoetina e megacariócitos, mas não preveniu a queda do número de plaquetas circulantes. A agregação plaquetária induzida por ADP foi inibida por LPS e restaurada pela pravastatina. A quantidade de EROs em plaquetas de ratos injetados com LPS foi 2,2 vezes maior do que a observada em ratos injetados com salina, o qual foi acompanhado por um aumento significativo da atividade enzimática da SOD e da GPx. O pré-tratamento com pravastatina dos ratos injetados com LPS não modificou da quantidade de EROs intraplaquetária, mas reduziu de forma marcante a atividade enzimática da SOD e da GPx. Portanto, nossos resultados mostram que a administração de pravastatina em animais sadios, além de levar a trombocitopenia e estresse oxidativo plaquetário, promove um aumento dos níveis plasmáticos de TNF-?, o que poderia incorrer em danos teciduais a longo prazo. A pravastatina restaura a agregação plaquetária e melhora o quadro inflamatório dos ratos injetados com LPS. Entretanto, esta estatina não previne a queda acentuada do número de plaquetas circulantes, marcador importante para avaliação da gravidade da sepse, e nem reduz o estresse oxidativo plaquetário, o que poderia contribuir para a disfunção de diferentes tecidos. Sendo assim, a pravastatina não parece ser uma boa opção no tratamento da sepse / Abstract: Sepsis is still a cause of high mortality in hospitals all over the world. It is a very complex clinical condition and up to now there is no effective treatment. In the last decades works have been plublished describing the important role of platelets in sepsis, since the severity of the condition is correlated to the number of circulating platelets and their activation state. Statins, besides their action on lowering the cholesterol levels, have been successfully used in the treatment of inflammatory diseases. Therefore, in the present study we decided to investigate the effect of pravastatin in platelets of healthy rats and in model of experimental sepsis induced by lipopolysaccharide (LPS). Rats were treated with saline or pravastatin (20 mg/kg, gavage once daily for 7 days). On the sixth day, the rats in both groups received a single injection of saline or LPS ( 1 mg / kg, i.p.) and after 48h the arterial blood was collected. Plasmatic TNF-? and thrombopoietin concentrations were measured by ELISA. The number of megakaryocytes was determined by histology of the bone marrow. Platelet aggregation was induced by ADP (1-10 mM ). The formation of reactive oxygen species (ROS) and cGMP in platelets was analyzed by flow cytometry using DCFH-DA and by commercial kits, respectively. We also analyzed the enzymatic activity of SOD and glutathione peroxidase ( GPx ) in platelets using commercial kits. In rats injected with saline, pravastatin increased 3.7 fold the plasma levels of TNF-'alfa'. Furthermore, pravastaina reduced 36% the number of circulating platelets. Platelet aggregation induced by ADP was significantly reduced by this statin, which was accompanied by a reduction in the intraplatelet cGMP levels. Despite the marked increase in enzymatic activity of SOD and GPx, pravastatin increased 2.4 fold the amount of ROS in platelets of saline-injected rats. Pravastatin reduced the increased number of total leukocytes in LPS-injected to the same values found in rats injected with saline. Increased TNF-'alfa' plasma concentration was also reduced by pre-treatment with pravastatin, but it still remained significantly higher than that observed in saline-injected rats. LPS reduced 6.8 fold the number of circulating platelets, which was accompanied by increased numbers of megakaryocytes and reduced thrombopoietin concentration. Pre-treatment with pravastatin restored the values of thrombopoietin and megakaryocytes, but did not prevent the drop in circulating platelets. ADP-induced platelet aggregation was inhibited by LPS and restored by pravastatin. The amount of ROS in platelets of LPS-injected rats was 2.2 fold higher than that observed in rats injected with saline, which was accompanied by significant increase in SOD and GPx activity. The pretreatment with pravastatin of LPS-injected rats did not change the amount of intraplatelet ROS but markedly reduced SOD and GPx activity. Therefore, our results show that administration of pravastatin in healthy animals, in addition to lead thrombocytopenia and platelet oxidative stress, it promotes an increase in TNF-'alfa' levels, which could result in tissue injury in long-term. Pravastatin restores platelet aggregation and improves the inflammatory condition of LPS-injected rats. However, this statin does not prevent sharp drop in the number of circulating platelets, an important marker for evaluating the severity of sepsis, and neither reduces platelet oxidative stress, which could contribute to the dysfunction of different tissues. Thus, pravastatin does not seem to be a good option in the treatment of sepsis / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

A intercalação de espécies com atividade farmacológica em Hidróxidos Duplos Lamelares (HDLs) vem sendo explorada com uma maior freqüência não apenas pelo fato da matriz ser biocompatível, mas também por outros efeitos reportados em estudos recentes como: (i) possível liberação sustentada da droga mediada por alterações no pH, (ii) aumento da solubilidade de substâncias pouco solúveis em água, (iii) aumento da estabilidade química de substâncias frente à luz, ao calor, à umidade, ao oxigênio molecular etc. O principal objetivo deste trabalho é a intercalação de substâncias de interesse medicinal (em suas formas aniônicas) como a pravastatina, Prav (ação anti-hiperlipidêmica) e os antioxidantes ácidos coumárico, Cou, e lipóico, Lip, em HDLs de magnésio-alumínio e zinco-alumínio através da coprecipitação, utilizando diferentes condições experimentais (pH, tratamento pós-síntese e relação molar ânion/Al3+). As amostras sólidas foram caracterizadas por análise elementar (CHN e metais), difratometria de raios X, métodos espectroscópicos (vibracional no infravermelho, Raman e ressonância magnética nuclear de 13C no estado sólido), análise térmica, microscopia eletrônica de varredura, medidas de tamanho de partícula e de potencial Zeta. A ação farmacológica dos HDLs de composição Mg2Al foi investigada através do teste biológico com o corante Sulforodamina B na linhagem celular de melanoma A-375. A utilização de diferentes proporções molares Pravastatina/Al3+ (1, 2 e 3) não alterou significativamente a quantidade de substância orgânica presente no material. O HDL de composição lamelar Zn2+/Al3+ apresentou maior cristalinidade e maior quantidade de orgânico (52 % m/m) que a matriz Mg2+/Al3+ (32 % m/m). A Pravastatina forma uma bicamada na região interlamelar. Os valores de tamanho médio de partícula e do potencial Zeta encontrado para o material Mg2Al1Prav (razão molar Prav/Al3+= 1) são 126 nm e + 22,9 mV, respectivamente. A Pravastatina e o material de Mg2Al1Prav diminuíram o crescimento celular da linhagem A-375 em até 20 % após tratamento. A composição dos HDLs intercalados com íons coumarato é dependente da razão molar Cou/Al3+ empregada na síntese. Observou-se novamente que o emprego da composição lamelar Zn2+/Al3+ contribui para a obtenção de material com maior cristalinidade e quantidade de orgânico intercalado (36 % m/m) comparado ao análogo de Mg2+/Al3+ (32 % m/m). Os ânions orgânicos na forma bivalente, constatados pelos resultados obtidos no espectro Raman, assumem um arranjo de monocamada com inclinação do esqueleto carbônico em relação às lamelas. Dados de análise elementar e análise térmica sugerem que o íon orgânico está enxertado/coordenado às lamelas do HDL. A suspensão aquosa do material Zn2Al3Cou apresenta estabilidade moderada frente à aglomeração (potencial Zeta igual a + 39,6 mV) e tamanho médio de partícula de 226 nm. No caso dos HDLs-Lip, observou-se que o excesso de íons lipoato na síntese, assim como o tempo de agitação pós-síntese , não alterou a cristalinidade e a quantidade de orgânico (39 % m/m) no material. Os ânions orgânicos devem se organizar na forma de uma bicamada interdigitada na região interlamelar. A suspensão aquosa do material Mg2Al1Lip apresenta estabilidade moderada frente à aglomeração (potencial Zeta igual a + 34,3 mV) e tamanho médio de partícula de 110 nm. / The intercalation of species with pharmacological activity in Layered Double Hydroxide (LDHs) has been explored frequently not only because it is biocompatible, but also by others effects as reported in recent studies: (i) sustained release of the drug by changes in pH, (ii) increasing the solubility of poorly water soluble substances, (iii) increase of the chemical stability of substance against light, heat, moisture, molecular oxygen etc. The main goal of this work is the intercalation of substances of therapeutic interest (in their anionic forms) as Pravastatin, Prav (antihyperlipidemic), and the antioxidants coumaric acid, Cou, and lipoic acid, Lip, in LDHs of magnesium-aluminum and zinc-aluminum by coprecipitation using different experimental conditions (pH, post-synthesis treatment and molar ratio anion/Al3+). Solid samples were characterized by elemental analysis (CHN and metals), X-ray diffraction, spectroscopic methods (Vibrational Infrared, Raman and Nuclear Magnetic Resonance of 13C in solid state), thermal analysis, scanning electron microscopy, measurements of particle size and Zeta potential. The pharmacological activity of LDHs of Mg2Al composition was investigated by the biological assay with the dye Sulforhodamine B in the melanoma cell line A-375. The usage of different molar ratio Pravastatin/Al3+ (1, 2 and 3) did not significantly alter the amount of organic substance present in the inorganic carrier. The LDH of composition Zn2+/Al3+ promoted an increase in the crystallinity of the material and in the amount of organic (52 % w/w) compared to the Mg2+/Al3+ material (32 % w/w). Pravastatin forms a bilayer into the interlayer region. The mean particle size and Zeta potential of the Mg2Al1Prav (molar ratio Prav- /Al3+= 1) are 126 nm and + 22.9 mV, respectively. The Pravastatin and the material Mg2Al1Prav decreased cell growth of strain A-375 melanoma by 20 % after treatment. The composition of the LDH intercalated with coumarate ions is dependent of the molar ratio anion/Al3+ used in the synthesis. The composition Zn2+/Al3+ promoted an increase in the crystallinity and amount of the organic (36 % w/w) compared to Mg2+/Al3+ material (32 % w/w). The organic divalent anions, visualized by the Raman spectra results, assume a monolayer arrangement with the inclination of the carboxylate group related to the layer. Elemental and thermal analysis suggest the grafting/coordination of the organic ions into the layers of LDH. The aqueous suspension of the Zn2Al3Cou shows moderate stability against agglomeration (Zeta potential value + 39.6 mV) and particle size of 226 nm. In the case of LDHs-Lip, it was observed that excess of lipoate ions from the synthesis, as well as, the stirring time pos-synthesis did not alter the crystallinity and the organic amount (39 % w/w) material. The organic anions are organized in an interdigitated bilayer into the interlayer region. The aqueous suspension of the Mg2Al1Lip material shows moderate stability against the agglomeration (zeta potential value equal to + 34.3 mV) and a particle size of about 110 nm.

A intercalação de espécies com atividade farmacológica em Hidróxidos Duplos Lamelares (HDLs) vem sendo explorada com uma maior freqüência não apenas pelo fato da matriz ser biocompatível, mas também por outros efeitos reportados em estudos recentes como: (i) possível liberação sustentada da droga mediada por alterações no pH, (ii) aumento da solubilidade de substâncias pouco solúveis em água, (iii) aumento da estabilidade química de substâncias frente à luz, ao calor, à umidade, ao oxigênio molecular etc. O principal objetivo deste trabalho é a intercalação de substâncias de interesse medicinal (em suas formas aniônicas) como a pravastatina, Prav (ação anti-hiperlipidêmica) e os antioxidantes ácidos coumárico, Cou, e lipóico, Lip, em HDLs de magnésio-alumínio e zinco-alumínio através da coprecipitação, utilizando diferentes condições experimentais (pH, tratamento pós-síntese e relação molar ânion/Al3+). As amostras sólidas foram caracterizadas por análise elementar (CHN e metais), difratometria de raios X, métodos espectroscópicos (vibracional no infravermelho, Raman e ressonância magnética nuclear de 13C no estado sólido), análise térmica, microscopia eletrônica de varredura, medidas de tamanho de partícula e de potencial Zeta. A ação farmacológica dos HDLs de composição Mg2Al foi investigada através do teste biológico com o corante Sulforodamina B na linhagem celular de melanoma A-375. A utilização de diferentes proporções molares Pravastatina/Al3+ (1, 2 e 3) não alterou significativamente a quantidade de substância orgânica presente no material. O HDL de composição lamelar Zn2+/Al3+ apresentou maior cristalinidade e maior quantidade de orgânico (52 % m/m) que a matriz Mg2+/Al3+ (32 % m/m). A Pravastatina forma uma bicamada na região interlamelar. Os valores de tamanho médio de partícula e do potencial Zeta encontrado para o material Mg2Al1Prav (razão molar Prav/Al3+= 1) são 126 nm e + 22,9 mV, respectivamente. A Pravastatina e o material de Mg2Al1Prav diminuíram o crescimento celular da linhagem A-375 em até 20 % após tratamento. A composição dos HDLs intercalados com íons coumarato é dependente da razão molar Cou/Al3+ empregada na síntese. Observou-se novamente que o emprego da composição lamelar Zn2+/Al3+ contribui para a obtenção de material com maior cristalinidade e quantidade de orgânico intercalado (36 % m/m) comparado ao análogo de Mg2+/Al3+ (32 % m/m). Os ânions orgânicos na forma bivalente, constatados pelos resultados obtidos no espectro Raman, assumem um arranjo de monocamada com inclinação do esqueleto carbônico em relação às lamelas. Dados de análise elementar e análise térmica sugerem que o íon orgânico está enxertado/coordenado às lamelas do HDL. A suspensão aquosa do material Zn2Al3Cou apresenta estabilidade moderada frente à aglomeração (potencial Zeta igual a + 39,6 mV) e tamanho médio de partícula de 226 nm. No caso dos HDLs-Lip, observou-se que o excesso de íons lipoato na síntese, assim como o tempo de agitação pós-síntese , não alterou a cristalinidade e a quantidade de orgânico (39 % m/m) no material. Os ânions orgânicos devem se organizar na forma de uma bicamada interdigitada na região interlamelar. A suspensão aquosa do material Mg2Al1Lip apresenta estabilidade moderada frente à aglomeração (potencial Zeta igual a + 34,3 mV) e tamanho médio de partícula de 110 nm. / The intercalation of species with pharmacological activity in Layered Double Hydroxide (LDHs) has been explored frequently not only because it is biocompatible, but also by others effects as reported in recent studies: (i) sustained release of the drug by changes in pH, (ii) increasing the solubility of poorly water soluble substances, (iii) increase of the chemical stability of substance against light, heat, moisture, molecular oxygen etc. The main goal of this work is the intercalation of substances of therapeutic interest (in their anionic forms) as Pravastatin, Prav (antihyperlipidemic), and the antioxidants coumaric acid, Cou, and lipoic acid, Lip, in LDHs of magnesium-aluminum and zinc-aluminum by coprecipitation using different experimental conditions (pH, post-synthesis treatment and molar ratio anion/Al3+). Solid samples were characterized by elemental analysis (CHN and metals), X-ray diffraction, spectroscopic methods (Vibrational Infrared, Raman and Nuclear Magnetic Resonance of 13C in solid state), thermal analysis, scanning electron microscopy, measurements of particle size and Zeta potential. The pharmacological activity of LDHs of Mg2Al composition was investigated by the biological assay with the dye Sulforhodamine B in the melanoma cell line A-375. The usage of different molar ratio Pravastatin/Al3+ (1, 2 and 3) did not significantly alter the amount of organic substance present in the inorganic carrier. The LDH of composition Zn2+/Al3+ promoted an increase in the crystallinity of the material and in the amount of organic (52 % w/w) compared to the Mg2+/Al3+ material (32 % w/w). Pravastatin forms a bilayer into the interlayer region. The mean particle size and Zeta potential of the Mg2Al1Prav (molar ratio Prav- /Al3+= 1) are 126 nm and + 22.9 mV, respectively. The Pravastatin and the material Mg2Al1Prav decreased cell growth of strain A-375 melanoma by 20 % after treatment. The composition of the LDH intercalated with coumarate ions is dependent of the molar ratio anion/Al3+ used in the synthesis. The composition Zn2+/Al3+ promoted an increase in the crystallinity and amount of the organic (36 % w/w) compared to Mg2+/Al3+ material (32 % w/w). The organic divalent anions, visualized by the Raman spectra results, assume a monolayer arrangement with the inclination of the carboxylate group related to the layer. Elemental and thermal analysis suggest the grafting/coordination of the organic ions into the layers of LDH. The aqueous suspension of the Zn2Al3Cou shows moderate stability against agglomeration (Zeta potential value + 39.6 mV) and particle size of 226 nm. In the case of LDHs-Lip, it was observed that excess of lipoate ions from the synthesis, as well as, the stirring time pos-synthesis did not alter the crystallinity and the organic amount (39 % w/w) material. The organic anions are organized in an interdigitated bilayer into the interlayer region. The aqueous suspension of the Mg2Al1Lip material shows moderate stability against the agglomeration (zeta potential value equal to + 34.3 mV) and a particle size of about 110 nm.