PCR und Fluoreszenz - DNA - Fragment - Analyse zum Nachweis einer monoklonalen B-Zell-Population zur Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome (CBCL) Der Nachweis einer monoklonalen B-Zell Population mittels PCR hat sich seit ca. zehn Jahren ergänzend zu Klinik und Histopathologie in der Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome etabliert. Zu diesem Zweck wurden Primer für die IgH Framework-Regionen (FR1, 2, 3), die Leader-Sequenz und für die JH-Region sequenziert. Alle Primervarianten führen zur Amplifikation der hochvariablen CDR-3 Region, welche für jede B-Zelle spezifisch ist. Die Kapillarelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten an automatischen Sequenziergeräten (z. B. Genescan ABI Prism 310) ermöglicht eine exakte Größenbestimmung des jeweiligen Fragmentes und ist daher in diesem Zusammenhang die geeignetste Methode. Zunächst wurden alle relevanten Primer mit der Simulationssoftware Oligo hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften geprüft. Danach wurden ausgewählte Primer-Sets an 58 in Paraffin eingebetteten und an 5 Kryoproben von sicher diagnostizierten CBCL-Patienten getestet. Die fluoreszenzmarkierten Produkte wurden mit dem Sequenziergerät ABI Prism 310 analysiert. Die ungeschachtelte FR3/JH-PCR konnte nur in 30% und zusammen mit der halbgeschachtelten FR3/JH-PCR nur in 37% der Fälle klonale B-Zellen nachweisen. Die Detektionsrate erhöhte sich auf 54% unter Einbeziehung der geschachtelten FR1/JH-PCR und schließlich auf 60% mit einer zusätzlichen geschachtelten FR2/JH-PCR. Das Auftreten von Pseudoklonen (variierende Größe des klonalen Peaks bei Wiederholung der PCR) bei den geschachtelten PCR machte eine Prüfung auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Die höchste Rate an Pseudoklonen zeigte die FR2/JH-PCR. Aufgrund der schlechten Qualität der IgH Leader-PCR konnten mit in Paraffin-eingebetteten Proben keine Amplifikate erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, daß gemeinsame Verwendung der in dieser Arbeit entwickelten PCR eine Sensitivitätssteigerung von 30% auf 60% ermöglichen. / Clonality detection in cutaneous B-cell lymphomas (CBCL) using immunoglobulin heavy chain gene PCR assays and fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencer Detection of clonally expanded immunoglobulin heavy chain (Igh) gene rearrangements by PCR and subsequent electrophoresis is increasingly used in the diagnosis of cutaneous B-cell lymphomas (CBCL). To this end, primers for the three Igh framework regions (FR1,2, 3), the leader sequence and the Jh region are applied, all amplifying the highly variable IgH third complementary region (CDR3) Recently, fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencers (GeneScan analysis, GSA), providing an exact sizing has been applied as appropriate seperation technique in this context. We have evaluated all Igh primers hitherto known by a PC primer analysis program. Then, fluorescently labeled products generated from DNAs of 58 paraffin embedded and 5 frozen lesional skin biopsies of confirmed CBCL cases using the primer sets selected, were analysed by GSA on the ABI 310 Prism instrument. Single round or seminested FR3/JH-PCR showed clonal B-cells only in 30 or 37% of cases, respectively. This fraction was increased to 54% including a nested FR1/JH-PCR, and, to 60% applying a supplementary nested FR2/JH-PCR. However false clonal results, indicated by peaks of varying sizes from repeated PCR, have been received by nested PCR, mostly by FR2/JH. Obviously due to their poor quality, the IgH leader-PCR has not yielded amplification products from paraffin-derived DNAs. Our data show that the FR3/JH-PCR only is not sufficient for detecting B-cell clonality in CBCL, but following inclusion of additional IgH-PCR, an increase of detection rate up to 60% is possible. A substantial number of cases still fail to show clonality.

Perhaps the most flexible synopsis of a database is a uniform random sample of the data; such samples are widely used to speed up processing of analytic queries and data-mining tasks, enhance query optimization, and facilitate information integration. The ability to bound the maximum size of a sample can be very convenient from a system-design point of view, because the task of memory management is simplified, especially when many samples are maintained simultaneously. In this paper, we study methods for incrementally maintaining a bounded-size uniform random sample of the items in a dataset in the presence of an arbitrary sequence of insertions and deletions. For “stable” datasets whose size remains roughly constant over time, we provide a novel sampling scheme, called “random pairing” (RP), that maintains a bounded-size uniform sample by using newly inserted data items to compensate for previous deletions. The RP algorithm is the first extension of the 45-year-old reservoir sampling algorithm to handle deletions; RP reduces to the “passive” algorithm of Babcock et al. when the insertions and deletions correspond to a moving window over a data stream. Experiments show that, when dataset-size fluctuations over time are not too extreme, RP is the algorithm of choice with respect to speed and sample-size stability. For “growing” datasets, we consider algorithms for periodically resizing a bounded-size random sample upwards. We prove that any such algorithm cannot avoid accessing the base data, and provide a novel resizing algorithm that minimizes the time needed to increase the sample size. We also show how to merge uniform samples from disjoint datasets to obtain a uniform sample of the union of the datasets; the merged sample can be incrementally maintained. Our new RPMerge algorithm extends the HRMerge algorithm of Brown and Haas to effectively deal with deletions, thereby facilitating efficient parallel sampling.

Diese Arbeit leistet einen methodischen Beitrag zur Identifizierung von Umsetzungsprozessen der Stickstoffverbindungen Ammonium und Nitrat in belasteten Grundwasserleitern mittels der Analytik der Isotopenverhältnisse N-15 bzw. O-18. Es existieren bereits verschiedene Präparationsmethoden, jedoch sind diese teilweise arbeits- oder zeitaufwändig und damit mit erheblichen Kosten verbunden. Für eine breitere Anwendbarkeit in den Umweltwissenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei vereinfachte Methoden für die N-15 bzw. O-18 Stabilisotopenanalytik von Ammonium und Nitrat in Wässern erarbeitet. Zum einen wurde eine Fällungsmethode mit Natriumtetraphenylborat für die Probenvorbereitung der N-15 Isotopenanalyse für Ammonium weiterentwickelt, getestet und validiert. Bisher existierten keine Studien zur Anwendbarkeit dieser Methode auf die Analyse ammoniumhaltiger Wasserproben. Daher wurde die Methode in dieser Arbeit für die Anwendbarkeit auf Wasserproben optimiert, insbesondere auf natürliche Grundwasserproben. Zum anderen wurde eine gängige Aufbereitungsmethode für gelöstes Nitrat weiterentwickelt. Dabei wurden die Vorbereitungs- und Arbeitszeit der Denitrifizierermethode verkürzt, ohne die Genauigkeit der Messung negativ zu beeinflussen. Zu diesem Zweck wurden zwei bestehende Varianten der Methode miteinander kombiniert und modifiziert. Als Eignungsprüfung der Methoden zur Prozessidentifikation erfolgte eine exemplarische Feldstudie. Als Modellstandort diente ein Untersuchungsgebiet im Südosten Berlins. Der Grundwasserleiter des Standortes ist u. a. durch eine massive Kontamination von Ammonium gekennzeichnet. Im Untersuchungsgebiet wurde das sogenannte BIOXWAND-Verfahren entwickelt und zur Sanierung auf den Grundwasserleiter angewandt. Dabei handelt es sich um ein in-situ-Verfahren, wobei eine direkte Injektion von Sauerstoff in den Grundwasserleiter erfolgt um Nitrifikation zu begünstigen. Für die isotopengestützte Prozessidentifikation wurden im Rahmen dieser Arbeit von 2016 bis 2019 zweimal jährlich Grundwasserproben aus dem BIOXWAND-Anstrom und dem BIOXWAND-Abstrom entnommen und mit den erarbeiteten Präparationsmethoden aufbereitet und analysiert. Zur Prozessidentifikation wurde ein analytisches Modell erstellt. Bei der vorliegenden kumulativen Dissertation handelt es sich um eine verkürzte Darstellung der Forschungsergebnisse. Die ausführlichen Ergebnisse wurden bereits in der Fachzeitschrift 'Rapid Communications in Mass Spectrometry' veröffentlicht.:VERZEICHNIS DER TABELLEN ................................................................................ 9 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN ....................................................................... 10 VERZEICHNIS DER ANHÄNGE .............................................................................. 11 VERZEICHNIS DER SYMBOLE UND ABKÜRZUNGEN ............................................. 12 1 EINLEITUNG UND MOTIVATION ....................................................................... 14 2 ZIELSETZUNG UND KONZEPT ............................................................................ 16 3 THEORETISCHE EINFÜHRUNG .......................................................................... 18 3.1 Stickstoff in der Umwelt ........................................................................................ 18 3.2 Ammonium und Nitrat im Stickstoffkreislauf ........................................................... 18 3.3 Einflussfaktoren auf die Prozesse des Stickstoffkreislaufs ....................................... 21 3.4 Isotopenanalytik in den Umweltwissenschaften ...................................................... 22 3.4.1 Definition stabiler Isotope ................................................................................................... 22 3.4.2 Isotopieeffekte und Fraktionierung .................................................................................... 24 3.4.3 Delta-Notation ....................................................................................................................... 25 3.4.4 Fraktionierungs- und Anreicherungsfaktor ....................................................................... 28 3.5 Analyse stabiler Isotope mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie ................. 29 3.5.1 Allgemeine Informationen ................................................................................................... 29 3.5.2 Massenspektrometer ............................................................................................................ 29 3.5.3 Analyse stabiler Isotope mittels Elementaranalysator-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie-Kopplung (EA-IRMS) ...................................................................... 31 3.5.4 Analyse stabiler Isotope mittels GasBench II – IRMS ..................................................... 33 3.6 Ammonium und Nitrat im Kontext stabiler Isotope .................................................. 34 4 PROBENAUFBEREITUNGSMETHODEN ............................................................... 37 4.1 Bedeutung der Probenaufbereitung ....................................................................... 37 4.2 Probenaufbereitung für die δ15N-Isotopenanalyse von gelöstem NH4+ ....................... 37 4.2.1 Destillationsmethode ............................................................................................................ 37 4.2.2 Quecksilberfällung ................................................................................................................ 37 4.2.3 Diffusionsmethode ................................................................................................................ 38 4.2.4 Kationenaustausch................................................................................................................ 39 4.2.5 Fällung von Ammonium mittels Tetraphenylborat ........................................................... 39 4.2.6 Weitere Methoden ................................................................................................................ 40 4.3 Zusammenfassung der Probenaufbereitungsmethoden für die δ15N-Isotopenanalyse von gelöstem NH4+ ............................................................................................... 40 4.4 Probenaufbereitung für die δ15N- und δ18O-Isotopenanalyse von gelöstem NO3− ........ 41 4.4.1 Reduktionsmethoden ........................................................................................................... 41 4.4.2 Denitrifizierermethode ......................................................................................................... 41 4.4.3 Silbernitratfällung.................................................................................................................. 42 4.4.4 Bariumnitratfällung ............................................................................................................... 43 4.5 Zusammenfassung der Probenaufbereitungsmethoden für die δ15N- und δ18O-Isotopenanalyse von gelöstem NO3- ....................................................................... 43 5 ÜBERBLICK DER DURCHGEFÜHRTEN STUDIEN ................................................ 44 5.1 δ15N-Analyse von Ammonium in gefriergetrockneten, natürlichen Grundwasserproben durch Fällung mit Natriumtetraphenylborat ............................................................ 44 5.2 Weiterführende Optimierung der Denitrifizierermethode für die schnelle 15N und 18O-Analyse von Nitrat in natürlichen Wasserproben ..................................................... 44 5.3 Beispielhafte Identifizierung von Nitrifikation und Sorptionsprozessen von Ammonium als Feldstudie ...................................................................................................... 45 6 DISKUSSION UND AUSBLICK ............................................................................ 47 7 DANKSAGUNG ................................................................................................... 50 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................. 51 ANHANG ............................................................................................................... 61 / This thesis provides a method to identify the transformation of the nitrogen species ammonium and nitrate in polluted aquifers by analyzing the isotope ratios N-15 and O-18. Various preparation methods already exist, but are either labor intensive or time consuming and are therefore related with considerable costs. To achieve a broader applicability in environmental sciences, two simplified methods for the N-15 and O-18 stable isotope analysis of ammonium and nitrate in water were developed in this thesis. On the one hand, a precipitation method using sodium tetraphenylborate for the sample preparation of the N-15 isotope analysis for ammonium was modified, tested and validated. So far no studies could verify the applicability of this method for analysis of water samples containing ammonium. Therefore, the method was optimized for applicability to water samples, especially natural groundwater samples within this thesis. On the other hand, a common processing method for dissolved nitrate was optimized. The preparation and working time of the denitrification method was shortened without negatively affecting the accuracy of the measurement. For this purpose, two existing variants of the method were combined and modified. Furthermore, an exemplary field study was carried out to test the suitability of the preparation methods for process identification. A study area southeast of Berlin (Germany) containing an aquifer massively contaminated with ammonium served as a model location. Inside the area, the so-called BIOXWAND process, an in-situ process whereby oxygen is injected directly into the aquifer to promote nitrification, was developed and applied to the aquifer in terms of remediation. For isotope-based process identification, groundwater samples were taken twice a year from 2016 to 2019 from the BIOXWAND inflow and outflow and analyzed using the preparation methods developed. An analytical model was created for process identification.:VERZEICHNIS DER TABELLEN ................................................................................ 9 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN ....................................................................... 10 VERZEICHNIS DER ANHÄNGE .............................................................................. 11 VERZEICHNIS DER SYMBOLE UND ABKÜRZUNGEN ............................................. 12 1 EINLEITUNG UND MOTIVATION ....................................................................... 14 2 ZIELSETZUNG UND KONZEPT ............................................................................ 16 3 THEORETISCHE EINFÜHRUNG .......................................................................... 18 3.1 Stickstoff in der Umwelt ........................................................................................ 18 3.2 Ammonium und Nitrat im Stickstoffkreislauf ........................................................... 18 3.3 Einflussfaktoren auf die Prozesse des Stickstoffkreislaufs ....................................... 21 3.4 Isotopenanalytik in den Umweltwissenschaften ...................................................... 22 3.4.1 Definition stabiler Isotope ................................................................................................... 22 3.4.2 Isotopieeffekte und Fraktionierung .................................................................................... 24 3.4.3 Delta-Notation ....................................................................................................................... 25 3.4.4 Fraktionierungs- und Anreicherungsfaktor ....................................................................... 28 3.5 Analyse stabiler Isotope mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie ................. 29 3.5.1 Allgemeine Informationen ................................................................................................... 29 3.5.2 Massenspektrometer ............................................................................................................ 29 3.5.3 Analyse stabiler Isotope mittels Elementaranalysator-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie-Kopplung (EA-IRMS) ...................................................................... 31 3.5.4 Analyse stabiler Isotope mittels GasBench II – IRMS ..................................................... 33 3.6 Ammonium und Nitrat im Kontext stabiler Isotope .................................................. 34 4 PROBENAUFBEREITUNGSMETHODEN ............................................................... 37 4.1 Bedeutung der Probenaufbereitung ....................................................................... 37 4.2 Probenaufbereitung für die δ15N-Isotopenanalyse von gelöstem NH4+ ....................... 37 4.2.1 Destillationsmethode ............................................................................................................ 37 4.2.2 Quecksilberfällung ................................................................................................................ 37 4.2.3 Diffusionsmethode ................................................................................................................ 38 4.2.4 Kationenaustausch................................................................................................................ 39 4.2.5 Fällung von Ammonium mittels Tetraphenylborat ........................................................... 39 4.2.6 Weitere Methoden ................................................................................................................ 40 4.3 Zusammenfassung der Probenaufbereitungsmethoden für die δ15N-Isotopenanalyse von gelöstem NH4+ ............................................................................................... 40 4.4 Probenaufbereitung für die δ15N- und δ18O-Isotopenanalyse von gelöstem NO3− ........ 41 4.4.1 Reduktionsmethoden ........................................................................................................... 41 4.4.2 Denitrifizierermethode ......................................................................................................... 41 4.4.3 Silbernitratfällung.................................................................................................................. 42 4.4.4 Bariumnitratfällung ............................................................................................................... 43 4.5 Zusammenfassung der Probenaufbereitungsmethoden für die δ15N- und δ18O-Isotopenanalyse von gelöstem NO3- ....................................................................... 43 5 ÜBERBLICK DER DURCHGEFÜHRTEN STUDIEN ................................................ 44 5.1 δ15N-Analyse von Ammonium in gefriergetrockneten, natürlichen Grundwasserproben durch Fällung mit Natriumtetraphenylborat ............................................................ 44 5.2 Weiterführende Optimierung der Denitrifizierermethode für die schnelle 15N und 18O-Analyse von Nitrat in natürlichen Wasserproben ..................................................... 44 5.3 Beispielhafte Identifizierung von Nitrifikation und Sorptionsprozessen von Ammonium als Feldstudie ...................................................................................................... 45 6 DISKUSSION UND AUSBLICK ............................................................................ 47 7 DANKSAGUNG ................................................................................................... 50 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................. 51 ANHANG ............................................................................................................... 61

Zugl.: Diss.

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