Des travaux antérieurs de l’équipe ont démontré l’impact majeur de la lymphopénie (<1Giga/L), détectée avant tout traitement, sur la survie globale des patients atteints d’un cancer solide en phase métastatique, soulignant ainsi l’importance du système immunitaire dans le contrôle de la progression tumorale. Au cours de mon projet de thèse, j’ai analysé l’apport de la diversité combinatoire de la chaine β du TCR, autre indicateur de la qualité du système immunitaire, en tant que marqueur pronostique chez des patientes atteintes de cancer du sein en phase métastatique. J’ai pu montrer qu’un score combinant la diversité des TCR et le nombre de lymphocytes (score NDL) est un facteur indépendant de mauvais pronostic en analyse multivariée. Ce score permet l’identification d’une sous population de patientes à risque qui présente à la fois une lymphopénie et une faible diversité (< 33%) combinatoire du TCR et pour laquelle une très forte réduction de la médiane de survie est observée. Nous avons également réalisé une étude plus approfondie de l’impact des sous-populations de lymphocytes et des cytokines plasmatiques produites. En parallèle, j’ai été amené à développer des tests de biologie moléculaire pour améliorer l’étude de la diversité du répertoire des TCR au niveau génomique. Ces travaux nous ouvrent la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques qui intégreraient les perturbations du système immunitaire. En effet, suite à ces résultats, un essai clinique basé sur l’administration d’IL-7, cytokine permettant l’expansion des cellules T avant ou pendant la chimiothérapie vient d’être activé au Centre Léon Bérard / Previous work of the team demonstrated the major impact of lymphopenia (<1Giga/L), detected before treatment, on overall survival of patients with solid metastatic cancer, highlighting the importance of immune system in controlling tumor progression. During my thesis project, I analyzed the contribution of the combinatorial diversity of the TCR β chain, another indicator of the quality of the immune system, as a prognostic marker in patients with metastatic breast cancer. I was able to show that a score combining the diversity of TCR and the number of lymphocytes (score NDL) is an independent factor of poor prognostic in multivariate analysis. This score allows identification of a subpopulation of patients at risk who has both a lymphopenia and a low combinatorial diversity (<33%) of TCR and for which a reduction in the median survival was observed. We also made further study of the impact of subpopulations of lymphocytes and plasma cytokines. In parallel, I developed molecular tests to improve the study of TCR repertoire diversity at the genomic level. This work opens the door to new therapeutic strategies that would consider immune system dysfunctions. Indeed, following these results, a clinical trial based on the administration of IL-7 cytokine for the expansion of T cells before or during chemotherapy has been activated at the Centre Léon Bérard

Schlafen 11 (SLFN11) est une ADN/ARN hélicase décrite pour la première fois pour son rôle dans le développement et la différenciation des thymocytes chez la souris. Elle fait partie d'une famille de protéines présentant divers degrés d'homologie entre les espèces, mais qu’est présente de façon constante chez les mammifères. Le rôle de cette ADN/ARN hélicase, SLFN11, a été associé de façon causale à la sensibilité de réponse aux différents agents alkylants (agents endommageant l'ADN, les inhibiteurs de topo-isomérase I et II) dans le NCI-60. Dans la première étude, nous avons développé un protocole d’immunohistochimie (IHC) sur des biopsies paraffinées de carcinome séreux de l'ovaire de haut grade (HGSOC), afin de valider un anticorps (Ab) anti-SLFN11 et d’en déterminer l'expression. En IHC, nous avons testé et validé un Ab anti-SLFN11, en choisissant entre deux anti-SLFN11 Ab utilisés normalement pour le Western Blot. Premièrement, il a été développé dans une culture cellulaire (CCB) de HGSOC et, successivement, dans une série indépendante de micro-array (TMA) de HGSOC. Pour chaque cas, nous avons évalué soit le score d'intensité (IS) que le score de distribution (DS) en évaluant au moins 300 cellules. Un score histologique (HS) a été obtenu comme suit : HS=IS x DS. Successivement, nous avons appliqué notre protocole à une plus large série d'échantillons de HGSOC pour confirmer nos résultats préliminaires. Nous avons trouvé un anticorps fiable dans les séries CCB et TMA permettant de déterminer l'expression IHC de SLFN11. Ces résultats ont été confirmés dans notre plus large série de HGSOC. Brièvement, comme pour les séries indépendantes de TMA, nous avons constaté que la HS de l'expression de SLFN11 est présente dans environ 60%. En parallèle, le SLFN11 n'a pas été exprimé dans 40 % des cas qui, cliniquement, correspondent, dans environ 60 % de ces cas (16/27), aux patients résistant aux sels de platine. Une faible expression de SLFN11 en IHC pourrait être corrélée à la réponse à la chimiothérapie(CT) à base de platine. Dans la deuxième étude, nous étudions l’état transcriptionnel du SLFN11 dans le cancer du sein en effectuant une méta-analyse de plus de 7000 cas à partir de 35 étudies publiquement disponibles. Par l’analyse de corrélation, nous avons identifié 537 transcrits qui corrèle, au-delà du 95e percentile selon le coefficient de Pearson, avec l’expression de SLFN11. En particulier, voie l’analyse par “Gene Ontology” SLFN11 est lié au transcrits impliqués dans le système immunitaire : "réponse immunitaire", "l’activation lymphocytaire" et "l’activation des lymphocytes T". En outre, voie le “likehood lasso regression ”, nous avons signalé une très forte association entre le SLFN11 et les signatures immunitaires dans le cancer du sein. Enfin, grâce à la “multiple corresponded analysis ”, nous avons découvert un sous-groupe de patients, défini "SLFN11-Hot cluster", caractérisé par une expression élevé de SLFN11, récepteurs d'œstrogènes(ER) négatives, un phénotype basal, un jeune âge, une signature élevée de CD3D et de STAT1. En utilisant la "Cox proportional hazard regression", l’expression élevé de SLFN11, l’indice de prolifération élevé et le ER négative sont des paramètres indépendants lié à la survie sans maladie chez les patients soumises à la CT. Notre deuxième travail decrit un rôle spécifique pour le SLFN11 dans le cancer du sein probablement en relation avec la modulation du système immunitaire et une forte corrélation entre l’expression de SFLN11 et un sous-type moléculaire spécifique de cancer du sein (récepteurs négatifs aux œstrogènes, phénotype de type basal). Autres études devront être réalisées afin de: 1) mieux comprendre la fonction du SLFN11 dans les cellules cancéreuses, 2) valider un protocole IHC fiable et standardisé pour évaluer l’expression de SLFN11, 3) utiliser SFLN11 comme biomarqueur prédictif de réponse aux DDA et PARP inhibiteurs et 4) établir sa relation avec le système immunitaire / Schlafen 11 (SLFN11) is a putative DNA/RNA helicase, first described for its role in thymocyte development and differentiation in mouse models. SLFN11 is part of a family of proteins with various degree of homology across species, but intriguingly being consistently present only in vertebrates and especially in mammals. Recently, the role of this putative DNA/RNA helicase, SLFN11, was causally associated with sensitivity to DNA damaging agents, such as platinum salts, topoisomerase I and II inhibitors, and other alkylators in the NCI-60 panel of cancer cell lines. In the first study, we validate an anti-SLFN11 antibody in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) high-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) samples, developing an immunohistochemistry (IHC) protocol in order to determinate the expression of SLFN11 in our series of HGSOC. Indeed, we tested and validated a reliable SLFN 11 antibody (Ab) in IHC choosing between two anti-SLFN11 Ab used normally for Western Blot (WB) in culture cell block (CCB) of ovarian carcinoma and in an independent series of HGSOCs tissue micro-array (TMA). For each case, we evaluated both the Intensity Score (IS) and the Distribution Score (DS) evaluating at least 300 cells. A Histological Score (HS)was obtained as follow: HS=IS x DS. Successively, we applied our protocol to a large case series of HGSOC samples to confirm our preliminary results. We found one antibody to be reliable in CCB and TMA series allowing to determinate clearly IHC expression of SLFN11. These results were confirmed in our large case series of FFPE HGSOC samples. Briefly, as for TMA independent series, we found that the HS for SLFN11 expression presents a normal distribution with a prevalent (≈ 60%) intermediate expression. Parallel SLFN11 was not expressed in practically 40% of cases that clinically corresponded to the platinum resistant patients in about 60% of cases (16/27). So, we believe that low IHC expression of SLFN 11 should be correlated to response to the platinum-based chemotherapy. In the second study, we investigate the transcriptional landscape of SLFN11 in breast cancer performing a gene expression microarray meta-analysis of more than 7000 cases from 35 publicly available data sets. By correlation analysis, we identified 537 transcripts in the top 95th percentile of Pearson’s coefficients with SLFN11 identifying “immune response”, “lymphocyte activation” and “T cell activation” as top Gene Ontology enriched processes. Furthermore, we reported very strong association of SLFN11 with immune signatures in breast cancer through penalized maximum likelihood lasso regression. Finally, through multiple corresponded analysis we discovered a subgroup of patients, defined “SLF11-hot cluster”, characterized by high SLFN11 levels, estrogen receptor(ER) negativity, basal-like phenotype, elevated CD3D, STAT1 signature, and young age. Using Cox proportional hazard regression, we characterized that SLFN11 high levels, high proliferation index, and ER negativity are independent parameters for longer disease-free interval in patients undergoing chemotherapy. We believe that our second work supports proof of concept that: i) A clear and specific role for SLFN11 in breast cancer, in likely connection with the immune system modulation in such disease entity, ii) a strong correlation between high SFLN 11 and specific molecular subtype of breast cancer (estrogen receptor negativity, basal-like phenotype). Further studies will be performed to confirm our hypothesis in order to: 1) better understand the function of SLFN 11 in cancer cell, 2) validate an easy, reliable and standardized IHC protocol to assessment SLFN11, 3) use SFLN11expression as a predictive biomarker of response to DDA and PARP inhibitors and 4) determinate the relationship with immune system

Introduction<p>Dans le monde, presque 10,6 millions d’enfants meurent chaque année avant d’avoir atteint leur cinquième anniversaire. En dépit de l’existence théorique d’interventions curatives efficaces, on constate que la mortalité intrahospitalière peut demeurer très élevée dans les services de pédiatrie de nombreux pays à faible revenu notamment en Afrique. Pour améliorer la prise en charge des enfants dans ces hôpitaux et par conséquent la survie des enfants, il est nécessaire avant tout de faire le constat de la situation et de la reconnaître, d’en analyser les causes, de s’attaquer aux déterminants vulnérables et de se doter d’outils d’évaluation de la qualité de soins dans les hôpitaux. En tant que pédiatre oeuvrant à l’HPG, j’ai constaté que la mortalité intrahospitalière était élevée. Fruit d’une démarche personnelle, ce travail avait pour objectif global la réduction de cette mortalité.<p>Pour y arriver, les objectifs spécifiques étaient les suivants :<p>1) Décrire et évaluer la qualité des soins intrahospitaliers chez les enfants à l’HPG.<p>2)Préciser la mortalité intrahospitalière globale ainsi que les mortalités spécifiques.<p>3)Etudier l’importance des facteurs associés à la surmortalité des enfants à l’Hôpital Provincial de Goma.<p>4)Construire un modèle de prédiction de la mortalité globale intrahospitalière ainsi qu’un score pronostique adapté au contexte.<p>5)Mettre en place un programme de formation et de supervision du personnel médical et paramédical.<p>6)Etudier l’impact de ce programme sur la mortalité intrahospitalière. <p><p>Méthodologie<p>Les analyses ont porté sur les données des études qui se sont déroulés dans le service de pédiatrie de l’hôpital provincial de Goma (HPG), il s’agit des études suivantes: une étude descriptive d’observation d’évaluation de la qualité des soins intrahospitaliers des enfants en décembre 2004 (étude qualitative utilisant la méthode de Nolan), une étude de cohorte prospective intrahospitalière portant sur les indicateurs prédictifs de la mortalité (du 1er avril 2003 au 31 mars 2004) (« avant ») ,suivi d’une intervention dont l’impact avait été évalué de nouveau par une étude de cohorte prospective intrahospitalière (du 1er janvier 2005 au 31 décembre 2005) (« après ») (étude d’intervention quasi-expérimentale). <p><p>Résultats<p>Les résultats du travail étaient les suivants :<p>A) -Les facteurs qui augmentent le risque de décès étaient la référence tardive et la sévérité de la maladie à l’admission. <p>-Les facteurs limitant la qualité de la prise en charge et qui contribuaient probablement au mauvais pronostic étaient :<p>1)A l’admission, le triage n’était pas toujours correctement fait, les soins d’urgences étaient retardés l’après-midi et la nuit et 12% des admissions étaient différés. Il n’y avait pas de grille d’évaluation initiale, ni des guides pratiques de l’OMS, ni les guides standardisés de prise en charge, ni de kit d’urgence.<p>2)En hospitalisation, il y avait une insuffisance en nombre du staff (surtout l’après-midi et la nuit), le monitoring de base et les soins infirmiers étaient insuffisants surtout la nuit, les cliniciens notaient les signes cliniques, mais ne les documentaient pas toujours, le délai pour avoir le diagnostic était trop long et l’indisponibilité des médicaments prescrits.<p>-Le staff du service avait des connaissances théoriques et pratiques insuffisantes et une motivation insuffisante<p>B)-Durant la première étude de cohorte, une mortalité globale de 15,9% et des mortalités spécifiques anormalement élevées ont été observés. Les enfants les plus à risque de décès avaient, à l’admission, les caractéristiques suivantes :un âge < 1 an, un périmètre brachial < 115 mm ou un retard de croissance pondérale (-3< Z-PPA ≤ -2 et Z-PPA ≤ -3), une altération de la conscience, une raideur de la nuque, un tirage intercostal et une infection.<p>C)-Ces premières données avaient permis de construire le modèle Goma1 basé essentiellement sur les indicateurs suivants :l’âge,le périmètre brachial, l’état de conscience et le type d’infection. Grâce au score pronostique, il était destiné à la sélection à l’admission des enfants à risque élevé de décès pour une admission en soins intensifs et à la standardisation de la mortalité en vue de l’évaluation de la qualité de prise en charge. <p>D)-Une intervention a été menée, en décembre 2004 portant essentiellement sur la formation et la supervision du personnel de santé œuvrant à l’HPG. Grâce à une évaluation avant-après, on a pu déterminer l’impact probable de cette intervention :la mortalité globale a diminué de 15,9% (avant l’intervention) à 4,6% (après l’intervention) et restait toujours plus basse après l’intervention et après ajustement à l’aide du modèle. <p><p>Conclusions<p>La mortalité pédiatrique intrahospitalière est généralement beaucoup trop élevée et c’était le cas à l’HPG.<p>Notre démarche après ce constat et l’évaluation de la qualité des soins donnés aux enfants sur base d’un questionnaire qualitatif a été d’intervenir sur un des points mis en exergue par cette évaluation (formation et supervision du personnel insuffisante) et d’évaluer l’impact de ce programme sur la mortalité globale.<p>Les résultats ont suggéré un impact positif de ce programme (mortalité globale de 15,9% avant l’intervention et de 4,6% après l’intervention).<p>Si de nombreuses critiques liées à la méthodologie (évaluation uniquement qualitative, étude quasi-expérimentale avant-après, intervention limitée, etc) doivent être épinglées et limitent la portée de ce travail, la démarche entreprise a cependant permis de mobiliser le personnel de santé œuvrant dans des conditions difficiles, autour d’un projet commun et améliorer ainsi la prise en charge des enfants hospitalisés à l’HPG. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished