Plusieurs réponses cellulaires aux stimuli extracellulaires sont transmises par des voies de signalisation qui agissent en aval de récepteurs membranaires tels les récepteurs tyrosine kinase (RTK). Les signaux provenant des RTK sont souvent relayés via des protéines adaptatrices comme NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) et NCK2 dont les fonctions sont considérées redondantes et indissociables. Toutefois, certaines études suggèrent que chacune de ces deux protéines pourraient avoir des cibles cellulaires spécifiques et des fonctions uniques. L’objectif de mon projet de doctorat était d’analyser la spécificité des protéines NCK1/2, c’est-à-dire d’identifier pour chacune des cibles uniques, pour ensuite caractériser ce qui génère cette spécificité tout en définissant la fonction de ces interactions. En premier lieu, j’ai utilisé deux techniques complémentaires de protéomique, soit (i) des purifications d’affinité (AP) et (ii) du marquage de proximité in vivo (BioID) suivies d’analyses en spectrométrie de masse (MS) afin de caractériser les interactomes respectifs de NCK1/2. La combinaison de ces deux approches m’a permis d’identifier plus d’une centaine d’interactions spécifiques pour chaque NCK. Des analyses bio-informatiques basées sur ces résultats m’ont permises de mettre en évidence que NCK2 semble plus spécifiquement impliquée que NCK1 dans la régulation de l’organisation du cytosquelette d’actine, structure essentielle lors de la division et de la cytokinèse. En comparant simultanément des cellules fibroblastiques murines (MEF) déplétées soit pour NCK1, soit pour NCK2, j’ai remarqué que les cellules Nck2-/-, à l’inverse des cellules Nck1-/- étaient plus multinucléées et présentent un midbody altéré en longueur. Également, j’ai remarqué une altération dans la composition du midbody des cellules Nck2-/- tel que suggéré par l’absence dans cette structure des protéines Polo-like kinase1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) ou encore Aurora B (AURKB), régulateurs clefs de la cytokinèse. Finalement, j’ai montré que la fonction de NCK2 durant la cytokinèse repose principalement sur son domaine SH2. Dans un deuxième temps, j’ai sélectionné 27 partenaires identifiés en MS et confirmé par une méthode orthogonale leurs interactions respectives avec NCK1 et/ou NCK2. Grâce à des tests de liaison in vitro, j’ai déterminé que plusieurs protéines dont la Plakophiline 4 (PKP4), un régulateur de la cytokinèse, lient directement et spécifiquement NCK2. Par différentes expériences in vitro, j’ai pu déterminer que NCK2 lie les portions N-terminale et centrale de PKP4 grâce à son domaine Src Homology (SH) 2 et que la spécificité de NCK2 envers PKP4 ne semble pas dépendre seulement des propriétés intrinsèques du SH2. L’association résulte plutôt de la combinaison d’une partie ou de l’ensemble des propriétés des domaines et régions interdomaines constituant les protéines NCK1/2. En conclusion, bien que les fonctions de NCK1/2 soient généralement considérées comme redondantes, mes résultats démontrent que ces protéines sont capables de lier des partenaires différentspour réguler des fonctions biologiques distinctes. Ainsi, mes travaux suggèrent que NCK2 semble spécifiquement requise lors du processus de cytokinèse. De plus, l’ensemble de mes expériences in vitro apporte une première idée du mécanisme de spécificité des protéines NCK1/2 en suggérant que leur spécificité ne semble pas entièrement provenir des propriétés intrinsèques de leurs domaines individuels, mais plutôt d’une combinaison des propriétés de leurs domaines et/ou régions interdomaines respectives. / Signals from cell surface receptors are often relayed via adaptor proteins that can serve as hubs to recruit appropriate target signaling molecules and guide signals along specific pathways. Among these, adaptor proteins NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) and NCK2 have functions that are often considered redundant and/or indistinguishable. The main goal of my work was to demonstrate that NCK1 and NCK2 are not fully redundant and may each display functional specificity. To achieve this, I delineated NCK1-and NCK2-specific signalling networks, identified for each unique target, then characterized what generates this specificity and obtained the function of these interactions. First, to identify the complement of interaction partners for NCK1 and NCK2, I used two unbiased mass spectrometry (MS)-based approaches: (i) epitope-tagged protein affinity purification (AP) followed by MS analysis and (ii) in vivo proximity labelling (BioID). The combination of these two approaches allowed me to identify more than one hundred specific interactions for each NCK. Bioinformatics analyzes based on the specific partners identified in MS enabled me to highlight that NCK2 was more specifically involved in the regulation of the actin cytoskeleton organization, structure essential for cell division and cytokinesis. By simultaneously comparing mouse embryo fibroblasts (MEF) depleted either for NCK1 or NCK2, I noticed that Nck2-/-, but not Nck1-/-cells are multi-nucleated and display extended protrusions reminiscent of intercellular bridges, which correlate with an extended time spent in cytokinesis as well as a failure of a significant proportion of cells to complete abscission. Further analysis of this phenotype revealed that the midbody of NCK2-deficient cells is not only increased in length, but also altered in composition, as judged by the mislocalization of the Polo-like kinase 1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) and Aurora B (AURKB) proteins. Moreover, I showed that NCK2 function during cytokinesis requires its SH2 domain. Second, to underline the molecular mechanism of specific protein complex formation, I selected based on my MS results 27 partners to confirm by an orthogonal method their respective interactions with NCK1 and/or NCK2. By using in vitro binding assays, I was able to determine that several proteins including Plakophilin 4(PKP4), a key regulator of the cytokinesis process, were able to bind directly and specifically to NCK2. Through various in vitro experiments, I was able to determine that NCK2 binds the N-terminal and central portions of PKP4 through its SH2 domain and that the specificity of PKP4 toward NCK2 does not appear to result from the intrinsic properties of its SH2 alone. This association seems to result from the combination of some or all of the properties of the individual domains and inter-regions constituting the NCK1/2 proteins. In conclusion, despite what is generally accepted, I showed that both NCK1 and NCK2 may form specific protein complexes, thus reflecting the functional specificity of these two adaptor proteins. I further demonstrated that NCK1 and NCK2 are not completely redundant. I also shed light on a previously uncharacterized function for the NCK2 adaptor protein in cell division. Finally, my in vitro experiments provide an explanation for the specificity mechanism of NCK1/2 adaptor proteins by suggesting that their specificity come from the combination of the properties of their respective domains and/or interdomain regions.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / L’obésité et ses complications telles le diabète et la stéatose hépatique non alcoolique sont des enjeux de santé qui prennent de plus en plus d’ampleur partout sur la planète et la compréhension approfondie des mécanismes physiopathologiques impliqués est essentielle pour mieux contrer ces maladies. La protéine peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) est reconnue pour ses propriétés antiinflammatoires, insulino-sensibilisantes et pro-adipogéniques. Des résultats antérieurs ont démontré qu’en l’absence de la protéine tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase- 1 (Shp1), l’activité de PPARγ est augmentée. L’activation de PPARγ par ses agonistes, les thiazolidinediones (TZD), est favorable au contrôle du diabète, mais entraîne certains effets indésirables. Nos recherches ont porté sur l’investigation d’une nouvelle voie de régulation de PPARγ. Nous avons montré que Shp1 et PPARγ interagissent et que PPARγ est phosphorylé sur ses résidus tyrosine. Les résultats suggèrent que la déphosphorylation de PPARγ par Shp1 diminue son activité. Des analyses de modélisation moléculaire suggèrent que cette interaction entre Shp1 et PPARγ dépend de la présence de phosphorylation sur un acide aminé particulier, la tyrosine 355. Ce même résidu est aussi important dans la liaison avec la rosiglitazone, médicament de la classe des TZD. Des expériences de mutagénèse ont montré que l’absence de phosphorylation sur la tyrosine 355 diminue grandement l’activité de la protéine et, qu’à l’inverse, la présence de phosphorylation tend à augmenter son activité. Bien que plusieurs modifications post-traductionnelles aient été décrites dans la littérature, la phosphorylation sur tyrosine de PPARγ demeure très peu étudiée. Nos résultats suggèrent une nouvelle voie de régulation de PPARγ qui pourrait mener à l’élaboration de nouveaux ligands qui exploitent ce mécanisme afin de favoriser les propriétés bénéfiques de ce facteur transcriptionnel pour mieux traiter le diabète de type 2 et diminuer les risques d’effets secondaires. / Obesity and its complications such as type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease are becoming worldwide health concerns and more insights into the underlying physiopathological mechanisms are necessary to improve the treatment of these conditions. Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) protein is well known for its anti-inflammatory, insulin sensitizing and pro-adipogenic roles. Previous results showed that in absence of the protein tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1), PPARγ activity is increased. PPARγ activation by thiazolidinediones (TZD) is used in the control of diabetes but is also linked to unwanted side effects. We investigated a new mechanism of regulation of PPARγ activity. We show that Shp1 and PPARγ interact and that PPARγ is tyrosine phosphorylated. Our results suggest that Shp1-mediated dephosphorylation of PPARγ reduces its activity. Molecular modeling analyses further suggest that the interaction between Shp1 and PPARγ depends upon the phosphorylation of one specific residue, tyrosine 355. This residue is also important for the binding with rosiglitazone, a member of the TZD drug class. Mutagenesis experiments showed that the absence of phosphorylation on tyrosine residue 355 decreases PPARγ activity, while its phosphorylation tends to increase it. Despite the fact that many post-translational modifications have been reported in the literature, tyrosine phosphorylation of PPARγ remains mostly unexplored. These results suggest a new PPARγ regulating mechanism that could be exploited to elaborate new PPARγ ligands to improve the treatment of type 2 diabetes and to limit side effects.

Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de recherche développés dans cette thèse.Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-protéine,suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stoechiométrie des enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerolkinase permettant le recyclage des phospholipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkAet inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locusplsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides / Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the intermembrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organizationand the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the two main axes developed in this thesis.Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting tosystematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,under physiological expression. This allowed me to study the localization and stoechiometry of phospholipid synthesis enzymes in the membrane. Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the firstenzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two componentsystem BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA andinhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficaces. / Arf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors.

Le développement des anticorps thérapeutiques s'est rapidement accéléré dans les 10 dernières années et concerne un nombre croissant de pathologies. La connaissance de l'épitope, à savoir la région de la cible à laquelle l'anticorps se fixe, est essentielle pour la compréhension des effets fonctionnels de ce dernier. Nous avons développé une méthode in silico, MAbTope, qui permet une prédiction précise de cet épitope, quand bien même aucune structure 3D de l'anticorps d’intérêt n'est résolue. Cette méthode se base sur une méthode d'amarrage protéine-protéine développée auparavant dans l’équipe BIOS. Le jeu d'apprentissage a été fortement enrichi en complexes anticorps-cibles, de nouvelles fonctions de score spécifiques ont été mises au point, et le plus important, l'objectif de l'apprentissage-machine a été modifié pour optimiser non plus la conformation de !'assemblage, mais la prédiction de l'épitope. Nous montrons que la méthode qui en résulte permet une prédiction précise et robuste de l'épitope, que la structure 3D de l'anticorps soit connue ou non. Nous montrons également comment les prédictions peuvent être facilement exploitées pour la validation expérimentale. Enfin, nous montrons comment la méthode peut être utilisée pour étudier à haut-débit le recouvrement d'épitopes par des anticorps ayant la même cible. / The development of therapeutic antibodies has been rapidly increasing in the last 10 years, with application to an increasing number of pathologies. The knowledge of the epitope, the region of the antigen to which the antibody binds, is crucial for understanding its functional effects. We have developed an in silico method, MAbTope, which allows the accurate prediction of the epitope, regardless of the availability of the 3D structure of the antibody of interest. This method is based on a protein-protein docking method previously developed in the BIOS group. The learning dataset was enlarged in antibody-antigen complexes, new specific scoring functions have been designed, and very importantly, the objective of machine-learning was switched from the conformational perspective towards the epitope determination perspective. We show that the resulting method allows robust and accurate prediction, whether or not the 3D structure of the antibody is available. We also show how the predictions can be easily exploited for experimental validation. Finally, we show how this method can be used for high-throughput epitope binning.

Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs. / Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.