La mechanistic target of rapamycin (mTOR) est une kinase qui s’associe à différentes protéines pour former deux complexes distincts (mTORC1 et mTORC2). Ces complexes jouent un rôle fondamental dans la régulation centrale du bilan d’énergie en assurant à la fois l’intégration hormonale et nutritionnelle, de même que le contrôle des déterminants énergétiques. Dans un contexte d’obésité, l’activation constitutive de mTORC1 engendrée par le surplus de nutriments conduit à la mise en place de boucles de rétroaction négative envers la voie de l’insuline. Cet évènement est en partie responsable de l’initiation de la résistance périphérique et hypothalamique à l’insuline. Des études récentes ont identifié Deptor comme un régulateur négatif de la voie de signalisation mTOR. Les connaissances actuelles démontrent que Deptor perturbe l’activité kinase de mTORC1 envers ses substrats en amont. Conséquemment, Deptor représente une cible de choix afin d’améliorer la sensibilité à l’insuline, particulièrement dans un contexte de balance énergétique positive qui exacerbe l’activité de mTORC1. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont révélé la présence de Deptor dans différentes régions cérébrales impliquées dans la régulation du bilan d’énergie. De fait, nos travaux dévoilent la première caractérisation de la présence et de la modulation de Deptor dans le cerveau du rat et de la souris. L’expression de Deptor s’avère affectée par la restriction alimentaire dans un contexte d’obésité. Afin d’identifier le rôle de Deptor dans la régulation du métabolisme énergétique, nous avons développé des modèles murins permettant la surexpression systémique et hypothalamique de Deptor. Les résultats obtenus à partir de ces modèles démontrent que Deptor joue un rôle majeur dans la régulation centrale du bilan d’énergie en prévenant l’obésité et les complications métaboliques induites par une diète riche en gras. Nous avons observé que la surexpression hypothalamique de Deptor affecte la dépense énergétique et améliore le métabolisme du glucose. Au plan mécanistique, Deptor améliore la sensibilité neuronale à l’insuline en favorisant l’activation de la protéine kinase B (Akt) et en réprimant l’expression du peptide orexigène agouti-related (AgRP). / The mechanistic target of rapamycin (mTOR) is a kinase that nucleates two large protein complexes (mTORC1 and mTORC2). These complexes play fundamental roles in the central regulation of energy balance by ensuring the integration of nutrient and hormonal cues, and modulating the energy determinants. In a context of obesity, the constitutive activation of mTORC1 generated by nutrient overload leads to the generation of several negative feedback loops toward the insulin signaling pathway. This event is, at least in part, responsible for the initiation of hypothalamic and peripheral insulin resistance. Recent studies have identified Deptor as a negative regulator of the mTOR signaling pathway. Current knowledge demonstrates that Deptor affects the kinase activity of mTORC1 toward its upstream substrates. Consequently, Deptor represents a prime target to improve insulin sensitivity, particularly in a context of positive energy balance that exacerbates the activity of mTORC1. This thesis revealed the presence of Deptor in different brain regions involved in the regulation of energy balance. Our work reports the first characterization of the presence and modulation of Deptor in the mouse and rat brain. We revealed that expression of Deptor is affected by dietary restriction in a context of obesity. In order to identify the role of Deptor in regulating energy homeostasis, we have developed mouse models allowing the systemic and hypothalamic overexpression of Deptor. The results obtained from these models indicate that Deptor prevents obesity and metabolic complications induced by a high-fat diet. Therefore, hypothalamic Deptor overexpression affects energy expenditure and improves glucose metabolism. Mechanistically, our work reveals that Deptor improves neuronal insulin sensitivity by promoting the activation of protein kinase B (Akt/PKB) and by suppressing the expression of the orexigenic agouti-related peptide (AgRP).

Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) est une protéine spermatique possédant une activité hyaluronidase dans son domaine N-terminal, contribuant à la dispersion des cellules du cumulus entourant l’ovocyte. Elle possède aussi une capacité de liaison à la zone pellucide (ZP) dans son domaine C-terminal. Nos études précédentes chez le taureau ont démontré la présence de deux isoformes potentielles de SPAM1 de ~70 et 80 kDa. Ces mêmes études ont permis d’émettre l’hypothèse que ces deux isoformes de SPAM1 ont des domaines C-terminaux différents, des origines différentes (testicule ou épididyme) et sont localisées dans la région acrosomale ou post-acrosomale du spermatozoïde. Puisque le domaine C-terminal est impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, nous voulions caractériser les deux domaines C-terminaux afin de mieux connaître le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. Deux transcrits de Spam1 ont été trouvés dans les tissus testiculaires et épididymaires. Ces transcrits possèdent une identité dans leur séquence nucléotidique en 3’ de la région codante, mais diffèrent par la présence ou l’absence de 90 nucléotides (exon 3 du gène Spam1). Nous avons identifié PH-20, une homologue potentielle de SPAM1 chez l’espèce bovine. Puisque SPAM1 et PH-20 sont similaires en N-terminal, notre anticorps dirigé contre la portion N-terminale de SPAM1 pourrait, théoriquement, reconnaître PH-20. Pour confirmer ceci, nous avons tenté de produire une protéine recombinante PH-20, mais sans succès. Nous voulions déterminer si SPAM1 fait partie d’un complexe multiprotéique impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, tel que rapporté chez l’humain. Nos résultats suggèrent que SPAM1 est associée aux protéines d’ancrage AKAPs, retrouvées majoritairement au niveau de la gaine fibreuse du flagelle des spermatozoïdes. La caractérisation des isoformes de SPAM1, de son homologue PH-20, ainsi que des complexes multiprotéiques dont fait partie SPAM1 sont importantes afin d’approfondir nos connaissances sur le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. / Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) is a sperm protein that has a hyaluronidase activity in its N-terminus, aiding in the dispersal of the cumulus cells surrounding the egg. It also has a zona pellucida (ZP) binding activity in its C-terminus. Our previous studies showed that there are two potential SPAM1 isoforms that have a molecular weight of ~70 and 80 kDa in the bovine species. From these studies, we hypothesized that these two SPAM1 isoforms had different C-terminal domains, different origins (testis or epididymis) and were localised in the acrosomal or post-acrosomal regions of spermatozoa. Seeing as it is the C-terminal domain that is involved in ZP binding, we aimed to characterize the two C-terminal domains in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions. Although the 3’ nucleotide sequences were identical, two Spam1 transcripts varying by the presence or absence of 90 nucleotides (exon 3 of the Spam1 gene) were found in both testicular and epididymal tissues. During our studies, we also identified PH-20, a potential SPAM1 homolog. In order to determine if PH-20 is one of the two potential SPAM1 isoforms that is recognized by our antibody directed against the N-terminal domain, we attempted the production of a PH-20 recombinant protein, without success. We also sought to determine if SPAM1 is part of a multimeric protein complex involved in spermatozoa-ZP interactions, as reported in humans. Our results suggest that SPAM1 is associated with AKAPs, which are anchoring proteins abundantly found in the fibrous sheath of sperm flagella. Characterizing the SPAM1 isoforms, its homolog PH-20, as well as the multimeric protein complexes SPAM1 is part of, are important in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions.

Les protéines des FI de classe VI sont surtout caractérisées par une longue queue c-terminale. Parmi cette classe, la transitine, protéine aviaire, et la nestine, protéine des mammifères, sont deux orthologues démontrant des schémas d'expression très semblables. Elles sont abondantes dans les muscles et le système nerveux embryonnaires. Elles possèdent de plus chacune un domaine en c-terminal composé de motifs répétés, quoique aucune homologie ne soit possible entre les deux régions : il s'agit d'un motif de 7 acides aminés de type LQEEHGD pour la transitine et de 11 acides aminés de type SLEKENQEXLR pour la nestine. Il s'agit de deux domaines uniques dans les protéomes connus. Lors d'une précédente étude, une activité ATPase ainsi qu'une affinité pour les protéines des filaments intermédiaires de classe III avaient été trouvées pour le domaine HR de la transitine. Cette étude se divise en deux objectifs spécifiques : 1) Analyser la conformation du domaine répété de la transitine dans le but de comparer des éléments de structure avec des notions déjà connues et 2) Documenter la relation structurale et fonctionnelle entre la nestine et la transitine. Pour répondre au premier objectif, une approche analysant la conformation par dichroïsme circulaire a été retenue. Pour ce faire, un peptide de 7 répétitions consécutives du motif répété LQEEHGD, a été synthétisé chimiquement et des spectres comparatifs ont été obtenus en variant différents paramètres du milieu. Les spectres obtenus nous permettent de suggérer que le peptide et, par extension, le domaine HR, adopte une structure de type polyproline II. Une analyse de réactivité croisée en immunobuvardage a ensuite été réalisée sur la nestine avec un anticorps spécifique au domaine HR de la transitine, montrant une reconnaissance. Des essais de surexpression ont ensuite été fait avec le domaine répété en c-terminal de la nestine. La microscopie à fluorescence n'a pas montré la même localisation, en surexpression, pour le domaine répété de la nestine que pour celui de la transitine. De plus, aucune affinité pour d'autres protéines de filaments intermédiaires n'a pu être observée. Ces deux résultats nous font suggérer que les fonctions des domaines répétés de la nestine et de la transitine diffèrent. Nous avons finalement caractérisé plus a fond l'activité ATPase du domaine HR de la transitine, notamment en tentant de la recréer par un peptide synthétique. Les résultats obtenus semblent indiquer que cette activité n'est pas seulement dépendante d'une séquence primaire.

Les tumeurs papillaires superficielles représentent plus de 75% de tous les cancers primaires de la vessie et on observe une récidive chez une majorité de patients dans les 12 mois suivant la résection de la tumeur, ce qui en fait un cancer provoquant une grande morbidité. L'objectif général des travaux présentés dans cette thèse est de confirmer la possible implication du gène PTC dans le processus de cancérogénèse vésicale. Dans un premier temps, une carcinogénèse chimique chez des souris Pte⁺/⁻ a montré une accélération de l'apparition des évènements prénéoplasiques et des carcinomes chez les souris mutantes comparativement à leurs congénères de type sauvage. De plus, l'apparition de foyers de prolifération stromale a été observée uniquement chez les souris mutantes, et ce avant même l'apparition de carcinomes. Dans un deuxième temps, la caractérisation de ce phénomène stromal a démontré qu'il s'agissait d'une prolifération de myofibroblastes activés et que cela était indépendant de l'altération de la voie Ptc/Shh canonique qui, elle, était observable dans toutes les tumeurs induites chez les souris, peu importe leur génotype. Cette prolifération stromale restreinte aux souris Ptc⁺/⁻ suggère que l'inactivation d'une copie du gène Ptc modifie les interactions épithélium/stroma, menant à une carcinogénèse accélérée. Dans un troisième temps, l'analyse de l'expression des membres de la voie PTC/SHH dans les tumeurs humaines a démontré une altération de la voie PTC/SHH indépendante du statut du locus de Ptc, donnée en parfait accord avec ce qui a été démontré chez la souris. Une baisse de PTC et une perte de GLI-l étaient observables dans la majorité des tumeurs, ce qui ne correspond pas à la logique de la voie, démontrant que le cancer de la vessie est une maladie multigénique impliquant des membres de la voie PTC/SHH, sans qu'il y ait activation de la voie canonique. Et finalement, une analyse d'e?, pression des membres de la voie PTC/SHH dans des lignées vésicales humaines a permis de démontrer une expression aléatoire des ces gènes, suggérant qu'ils ne sont pas essentiels au maintien des cellules in vitro. Des travaux préliminaires pour la mise au point d'un modèle cellulaire du cancer de la vessie ont démontré qu'il était impossible d'obtenir une expression stable des protéines GLI-l et GLI-2 dans des cellules de lignées vésicales par transfection, amenant l'hypothèse que ces protéines soient essentielles au bon maintien de l' intégrité de l'urothélium et que leur perte favorise la cancérogénèse.

La filière des insectes comestibles, particulièrement du ver de farine Tenebrio molitor, est en croissance au Québec en lien avec leurs avantages environnementaux et nutritionnels. Bien que la faible acceptabilité de l'entomophagie représente la problématique majeure de ce secteur, un des leviers pour inverser cette tendance serait la production de concentrés protéiques d'insecte (à la suite d'une délipidation et extraction des protéines) afin de les intégrer à des matrices alimentaires. Actuellement, aucune étude n'est disponible sur l'impact environnemental lié à la génération de concentrés protéiques de ver de farine. Ainsi, dans ce projet, une délipidation par solvants suivie d'une extraction des protéines ont été réalisées afin de produire un concentré protéique de ver de farine et d'en évaluer l'impact environnemental. Un taux d'extraction lipidique de 86,9 % a été obtenu et quatre méthodes d'extraction des protéines (une solubilisation au NaOH avec et sans précipitation au HCl et deux solubilisations au NaOH avec et sans précipitation au HCl) ont ensuite été réalisées en parallèle sur le résidu délipidé permettant d'obtenir quatre concentrés protéiques dont les teneurs protéiques varient de 54,7 à 80,0 %. Le potentiel de réchauffement climatique des quatre concentrés a été calculé selon deux méthodes d'allocation différentes : l'une considérant tous les co-produits valorisables et l'autre considérant uniquement la matière grasse et l'extrait protéique valorisable. Selon la méthode d'extraction des protéines choisie et la méthode d'allocation utilisée, le potentiel de réchauffement climatique d'un concentré protéique d'insecte variait entre 3 050 et 10 871 kg de CO₂ eq. par tonne de concentré. Le score d'éco-efficience calculé pour les concentrés se situait entre ceux associés aux concentrés protéiques d'origine végétale et animale confirmant le bénéfice environnemental de la production de concentrés protéiques à partir de vers de farine malgré les étapes de transformation nécessaires à leur production. / The edible insect industry, particularly the mealworm Tenebrio Molitor, is growing in Québec due to its environmental and nutritional benefits. Although entomophagy's low acceptability represents this sector's main issue, it was demonstrated that the production of insect protein concentrates (generated after delipidation and protein extraction) could improve the consumer acceptability. Currently, no studies are available regarding the environmental impact of the production of mealworm protein concentrates. Consequently, this work aimed to produce mealworm protein concentrates by successive steps of delipidation by solvents followed by protein extraction and evaluate its environmental impact. A lipid extraction rate of 86.9% was obtained. Four protein extraction methods (one NaOH solubilization with and without HCl precipitation and two NaOH solubilizations with and without HCl precipitation) were then performed. The four protein concentrates had protein content ranging from 54.7 to 80.0%. The global warming potential of these four concentrates was calculated according to two different allocation methods: one considering all the valuable co-products and the other considering only the fat and the valuable protein extract. Depending on the protein extraction method chosen and the allocation method used, the global warming potential of an insect protein concentrate varied between 3 050 kg and10 871 kg CO₂ eq. per ton of mealworm protein concentrate. The eco-efficiency score calculated for these concentrates was between those associated with protein concentrates of plant and animal origin, confirming the environmental benefit of producing mealworm protein concentrates despite the processing steps required for their production.

Une des premières caractéristiques reconnues dans les cellules cancéreuses fut l’observation d’aberrations chromosomiques au cours de la division cellulaire. Parmi ces aberrations, on retrouve l’aneuploïdie, une mutation génétique définie par un nombre de chromosomes anormal de la cellule. Première cause associée aux fausses couches et au retard mental, l’aneuploïdie participe également à la progression tumorale. Plusieurs mécanismes sont mis en place par la cellule pour parer à ces aberrations chromosomiques. Le « spindle assembly checkpoint » (SAC) fait partie de ces mécanismes qui assurent la ségrégation précise des chromosomes au cours de la mitose. La kinase à double spécificité MPS1 codée par le gène TTK est une composante critique du SAC. La régulation de l’activité et de la localisation de MPS1 reste encore incomprise dans son ensemble. La localisation de MPS1 aux kinétochores (KT, structure des centromères permettant la mise en place du SAC) nécessite une région d’environ 50 acides aminés appelée NTE (N-Terminal Extension) qui ne possède pas de domaine fonctionnel clairement défini. Des données récentes ont montré que la région N-Terminale de MPS1 est impliquée dans la régulation de son activité. L’objectif principal de ces travaux est de comprendre dans quelle mesure la région NTE participe à la régulation de l’activité kinase et à la localisation de MPS1. Mettant en place une approche basée sur l’hypothèse que la conservation de la structure à travers l’évolution peut correspondre à une fonction, nous avons mis en évidence que la région NTE de MPS1 contribue à sa localisation et son activation par 2 modules indépendants. Nous avons démontré que les résidus 19-29 sont absolument requis pour la localisation de MPS1 déterminant ainsi plus précisément une région responsable de sa localisation. Cette région est également nécessaire pour diminuer l’interaction entre MPS1 et sa protéine partenaire ARHGEF17/TEM4 qui participe à son recrutement au KT, régulant de ce fait la localisation de MPS1. Le second module concerne les résidus 40-49 et c’est en particulier la phosphorylation de cette région qui contribue à l’activation de la kinase, vraisemblablement par la relâche d’un mécanisme d’auto-inhibition de la kinase. Ce mécanisme, participant à la régulation de l’activité kinase de MPS1, semble se produire successivement avec la dimérisation, puis la phosphorylation initiale de la région NTE et est enfin suivie de la trans-autophosphorylation de la boucle d’activation du domaine kinase. L’importance de la région NTE dans l’accomplissement des fonctions de MPS1 au cours de la mitose a été démontrée ainsi que la nécessité de ces deux régions particulières de la NTE requises indépendamment pour le fonctionnement optimal et le maintien de la robustesse du SAC. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension des mécanismes régulant l’activité kinase et la localisation au kinétochore de MPS1 par l’intermédiaire de sa région NTE. / One of the first recognized characteristics in cancer cells was the observation of chromosomal aberrations during cell division. Among these aberrations, there is aneuploidy, a genetic abnormality defined by having an incorrect number of chromosomes in the cell. As the leading cause of miscarriages and mental retardation, aneuploidy also contributes to tumor progression. Several mechanisms are established by the cell to counter these chromosomal aberrations. The "spindle assembly control point" (SAC) is one of these mechanisms which ensures accurate segregation of chromosomes during mitosis. The dual specificity kinase MPS1 coded by the TTK gene is a critical component of the SAC. The regulation of the activity and the localization of MPS1 is still not wholly understood. The localization of MPS1 to the kinetochores (KT, structure of the centromeres allowing SAC organization) requires a region of approximately 50 amino acids called NTE (N-Terminal Extension) which does not exhibit a known functional domain. Recent data have demonstrated that the N-Terminal region of MPS1 is involved in the regulation of its activity. The main objective of this project is to understand to what extent the NTE region participates in the regulation of the kinase activity and the localization of MPS1. Using a structure-based approach, we have demonstrated that the NTE region of MPS1 contributes to its localization and activation by 2 independent modules. We demonstrated that residues 19-29 are absolutely required for the localization of MPS1, thus defining more accurately the region responsible for its localization. This region is also necessary to decrease the interaction between MPS1 and its partner protein ARHGEF17/TEM4, which participates in its recruitment to the KT thereby regulating the localization of MPS1. The second module concerns the residues 40-49, especially the phosphorylation of this region which contributes to the activation of the kinase, presumably by the release of a mechanism of auto-inhibition of the kinase. This mechanism, which participates in the regulation of the MPS1 kinase activity, appears to occur successively with dimerization then the initial phosphorylation of the NTE region and finally followed by trans-autophosphorylation of the activation loop of the kinase domain. The importance of the NTE region in performing the functions of MPS1 during mitosis has been demonstrated as well as the need for these two particular regions of the NTE which are independently required for optimal functioning and maintaining the robustness of the SAC. Thus, this thesis provides additional and indispensable information for understanding the mechanisms regulating the kinase activity and the kinetochore localization of MPS1 via its NTE region.

La protéine PARL (Presenilins-Associated Rhomboid-Like protein) est une nouvelle protéine présentant des similarités significatives avec la famille de régulateurs développementaux de Drosophila melanogaster Rhomboid, assurant la protéolyse intramembranaire régulée (RIP). La RIP est un processus par lequel certaines protéines transmembranaires sont clivées à l'intérieur de la membrane pour libérer un domaine cytoplasmique actif. Pour valider l'homologie fonctionnelle entre PARL et Rhomboid-1, nous avons conduit une analyse phylogénétique complète portant sur l'ensemble des membres de la super-famille Rhomboid. Cette étude révèle que cette famille est présente à tous les niveaux évolutifs et que tous ses membres, y compris PARL, sont des sérine-protéases catalysant la RIP. Nos études immunohistochimiques démontrent que le profil d'expression de PARL est régulé dynamiquement au cours du développement postnatal du cerveau de souris. D'autre part, PARL est sélectivement exprimée dans les cellules mitotiques et les neurones indifférenciés, mais pas dans les cellules gliales. De plus, chez l'adulte, l'expression de PARL est restreinte aux zones de neurogenèse active tout au long de la vie de l'animal. L'ensemble de ces résultats indique que l'expression de PARL commence durant la phase proliférative des précurseurs neuronaux, continue dans les étapes précoces de la différenciation neuronale et qu'elle est ensuite régulée négativement au cours de la différenciation. Nous proposons donc que l'activité de RIP-protéase de la protéine PARL joue un rôle essentiel dans l'engagement de la cellule vers la destinée neuronale et dans la neurogenèse.

Les microARN sont de courtes molécules d’ARN qui jouent un rôle important dans la régulation posttranscriptionnelle des gènes. Ces molécules ont d’abord été découvertes chez le nématode Caenorhabditis elegans mais sont maintenant reconnues comme des régulateurs importants de l’expression génique chez plusieurs animaux et plantes. Pour accomplir cette fonction, les microARN doivent s’associer à un complexe protéique nommé le miRISC (microRNA-induced silencing complex) qui est composé principalement d’une protéine Argonaute et des protéines GW182. Les microARN sont liés directement par les protéines Argonautes et peuvent ainsi guider celles-ci à la région 3’ nontraduite d’un ARNm cible par complémentarité de base. Le miRISC peut ensuite induire différents mécanismes de répression allant de la répression traductionnelle à la dégradation de la cible. À ce jour, les mécanismes qui modulent l’activité du miRISC ainsi que les interacteurs de ce complexe sont peu caractérisés. L’objectif principal de mon doctorat était donc d’étudier les processus qui régulent l’activité du complexe effecteur des miARN, le miRISC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’importance de composantes connues du miRISC, soit les protéines GW182. Pour ce faire, nous avons aboli l’interaction entre les protéines Argonautes et GW182 et nous avons étudié l’effet de cette perte d’interaction sur la fonction du miRISC au cours du développement de C. elegans. Nous avons ainsi démontré que l’association de GW182 au miRISC n’était pas nécessaire pour le développement embryonnaire de l’animal. Nous avons par la suite confirmé que certaines cibles de microARN embryonnaires n’étaient pas affectées par l’absence de GW182. Nous avons ainsi conclu que le miRISC pouvait exister et fonctionner sous différentes formes et que les protéines GW182 étaient dispensables à l’activité du miRISC dans certains contextes. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d’identifier de nouveaux facteurs qui contribuent à l’activité du miRISC en réalisant un criblage génétique. Nous avons ainsi identifié la RabGAP tbc-11 comme un nouvel acteur contribuant à la fonction des microARN. Nous avons démontré que tbc-11 agit sur la petite GTPase rab-6 et que la régulation de celle-ci est importante pour assurer la localisation intracellulaire adéquate de la protéine Argonaute ALG-1. Nos résultats ont permis de démontrer qu’une localisation inadéquate de la protéine ALG-1 engendre un défaut dans la répression de cibles de iii microARN. Nous avons ainsi pu conclure que le transport vésiculaire joue un rôle important dans la fonction des microARN. Les travaux réalisés au cours de mon doctorat ont permis de démontrer que la localisation et la composition du miRISC contribuent à la modulation de sa fonction. Ces résultats ont pu approfondir nos connaissances sur les mécanismes utilisés par la cellule pour moduler l’activité des microARN, et ouvrent ainsi la voie à d’autres recherches pouvant étudier les fonctions des microARN dans divers contextes. / MicroRNAs are small RNA molecules that play an important role in post-transcriptional gene silencing. These molecules were first discovered in the nematode Caenorhabditis elegans but are now known as important regulators of gene expression in most animals and plants. To accomplish this function, microRNAs interact with a protein complex called the miRISC (microRNA-induced silencing complex) which is formed by an Argonaute protein and GW182 proteins. MicroRNAs interact directly with Argonaute and can guide them to the 3’ UTR region of a target mRNA by base pairing. The miRISC will then induce several repression mechanisms, ranging from translational repression to target decay. To this day, the mechanisms that modulate miRISC activity as well as the proteins that interact with the complex are poorly characterized. The main objective of my PhD was therefore to study the processes that regulate the activity of the effector complex of microRNAs, the miRISC. First, we evaluated the importance of a known component of the miRISC; the GW182 proteins. To accomplish this, we abolished the interaction between Argonaute and GW182 proteins and we studied the effect of this loss of interaction on miRISC function during C. elegans development. We have shown that the association of GW182 to the miRISC is dispensable for the animal’s embryonic development. We then confirmed that certain embryonic microRNA targets were not affected by the loss of GW182. These results allowed us to conclude that the miRISC can exist and function under different forms and that GW182 proteins are dispensable for the miRISC activity under certain conditions. Second, we wanted to identify new factors that contribute to miRISC silencing by performing a forward genetic screen. This allowed us to identify the RabGAP tbc-11 as a new factor contributing to microRNA function. We have shown that tbc-11 acts on the small GTPase rab-6 and that its regulation is important for proper intracellular localization of the Argonaute ALG-1. Our results have shown that an improper localization of ALG-1 leads to defects in microRNA target repression. We have therefore concluded that vesicular transport plays an important role in microRNA function. Our results have shown that the localization and composition of the miRISC contributes to the modulation of its activity. This study has deepened our knowledge on the mechanisms that modulate microRNA activity and opens the door for other research on microRNA function in different contexts.

La moléculture végétale a connu un essor considérable ces dernières années, permis parnombre d’avantages pratiques associés aux plantes incluant une mise à l’échelle aisée pour la production de vaccins ou d’anticorps thérapeutiques en grandes quantités. De nombreuses études ont été réalisées, ces dernières années, pour optimiser les rendements en protéines d’intérêt médical chez Nicotiana benthamiana, une cousine sauvage du tabac.Ces études ont été menées, toutefois, sans tenir compte de la teneur foliaire en protéines endogènes, souvent considérées comme des contaminants majeurs au moment de la purification des protéines d’intérêt. Dans ce contexte, notre principal objectif de recherche pour cette étude a été d’évaluer l’influence de traitements culturaux variés aussi bien sur le rendement total en protéine recombinante dans des plants agroinfiltrés de N. benthamianaque sur la teneur relative en ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO),principal contaminant endogène du tissu foliaire. Nos résultats confirment un impact souvent significatif des conditions culturales sur le rendement total en protéine recombinante dans la plante, mais peu d’effets sur la part relative en RuBisCO dans le tissu foliaire. / Plant molecular farming has grown considerably in recent years, thanks to a number of benefits associated with plants including a convenient scaling-up of production settings that allow for the production of large quantities of vaccines or therapeutic antibodies. Numerous studies have been conducted in recent years to optimize the yields of medically valuable recombinant proteins in the wild tobacco relative Nicotiana benthamiana. Most of these studies, however, have not considered the host plant endogenous proteins, which oftenrepresent major contaminants during the downstream purification of recombinant proteins.In this context, our main research objective for this project has been to evaluate the relative impacts of cultural conditions on recombinant protein yield and relative content of ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO), the major endogenous protein contaminant in leaf tissue. Our results confirm the influence of most cultural conditions on total recombinant protein yield, but a negligible effect of these conditions on the relative amount of RuBisCO in leaf tissue.

La mitose est un point critique de la division cellulaire, où la distribution précise du matériel génétique garantit la viabilité de la descendance. En conséquence, la ségrégation correcte des chromosomes pendant la mitose dépend de la capacité du point de contrôle d'assemblage du fuseau mitotique (SAC) à détecter l’interaction des chromosomes avec les microtubules. Ainsi, la voie de signalisation du SAC est responsable d’inhiber la séparation des chromatides-sœurs jusqu’à l’attachement correct de tous les chromosomes aux microtubules provenant des pôles opposés du fuseau mitotique. Une fois que les chromosomes sont fixés, le signal du SAC est éteint. L'extinction du SAC dépend d'une réaction rapide aux attachements, orchestrée par deux forces qui s’opposent au niveau des centromères : les activités kinases et phosphatases. Lorsque tous les chromosomes sont correctement attachés, l'activité phosphatase augmente et éteint le signal du SAC. Notamment, la protéine pseudokinase BUBR1 est cruciale pour la génération de l’activité phosphatase au niveau d’un grand complexe protéique établi aux centromères, le kinétochore. En bref, la voie de contrôle mitotique conduit à la phosphorylation de la protéine KNL1, un des principaux centres d’échafaudage du kinétochore, provoquant une accumulation de BUBR1 et d'autres protéines impliquées dans le SAC. La phosphorylation de BUBR1 à son domaine KARD crée un motif de liaison pour la sous-unité B56 de la phosphatase PP2A. Par conséquent, le complexe BURR1-PP2AB56 est essentiel pour la dephosphorylation de plusieurs sites aux kinétochores et éteindre le SAC. Pour cette raison, comprendre comment le chemin évolutif de la pseudokinase BUBR1 l'a amenée à promouvoir la déphosphorylation est une question intrigante. D'un point de vue évolutif, les gènes de la famille Bub, incluant le gène codant pour BUBR1, ont évolué à partir d'un seul gène ancestral appelé Madbub. Le gène Madbub a subi des événements de duplication de gènes distincts au cours de l'évolution conduisant à une sous-fonctionnalisation de la protéine produisant deux copies de gène différentes. Premièrement, la copie BUB1 a perdu un domaine indispensable pour le SAC appelé KEN box, mais a conservé un autre domaine crucial, le domaine kinase. Cependant, l'autre copie MAD3 a conservé le domaine KEN box et a perdu le domaine kinase. Remarquablement, la copie de la protéine MAD3 chez un certain nombre d'insectes et de vertébrés, appelé BUBR1, a conservé le domaine kinase malgré une dégénérescence résultant un domaine kinase inactif, ou pseudokinase. Il existe, notamment, des exceptions comme la Drosophila, qui présente une kinase active. En tous cas, l'avantage évolutif conféré par le maintien de ce domaine serait la stabilité qu’il confère à la protéine entière. Les mutations dans le gène codant pour BUBR1 qui causent la déstabilisation de la protéine sont associées à l’aneuploïdie variée en mosaïque, une maladie sévère qui entraîne le développement du cancer chez l’enfant. Également, des mutations au niveau de plusieurs résidus situés au niveau du domaine pseudokinase de BUBR1 déstabilisent la protéine entière. Toutefois, étant donné que BUBR1 tronqué au niveau de son domaine kinase est en fait plus stable que le type sauvage et que l'homologue BUBR1 dépourvu de kinase, MAD3, est présent dans la majorité des organismes inférieurs, cela soulève la question de savoir si le domaine pseudokinase confère un autre attribut à la fonction ou régulation de BUBR1, en particulier chez les organismes plus complexes. La présente étude vise à préciser si le domaine pseudokinase de BUBR1 régule la fonction du domaine KARD pendant la mitose. Nous présentons un aperçu d'un domaine de pseudokinase dans le contrôle de la liaison d'une phosphatase, car nos données confirment que le domaine pseudokinase régule l'affinité du KARD pour la phosphatase PP2AB56. Finalement, nous avons dévoilé un nouveau rôle du domaine pseudokinase de BUBR1 qui est crucial pour certaines fonctions mitotiques et qui aide à expliquer le chemin évolutif particulier subit par son gène. / Mitosis is a critical point of cell division, where the accurate distribution of genetic material guarantees the viability of the progeny. Proper chromosome segregation during mitosis relies on the capacity of the spindle assembly checkpoint (SAC) to sense the attachment of chromosomes to microtubules. The SAC pathway is responsible for halting sister chromatid separation until all chromosomes are correctly attached to microtubules originating from opposing poles of the mitotic spindle. After the chromosomes are successfully attached, the SAC signal is extinguished. SAC extinction depends on a swift response to microtubule attachments to sister-chromatids, which is orchestrated by the tug-of-war between two opposing sides: kinase and phosphatase activities. Each sister-chromatid possesses a kinetochore, a great protein complex that serves as interface between chromosomes and microtubules. At kinetochores unattached to microtubules, kinase activity dominates and turns the signalling on. Once all kinetochores are properly attached, phosphatase activity increases and silences the signalling. Importantly, the protein pseudokinase BUBR1 is crucial for the generation of phosphatase activity at kinetochores. When active, the mitotic checkpoint leads to the phosphorylation of MELT motifs in the kinetochore protein KNL1, causing BUBR1 and other SAC protein accumulation at kinetochores. In turn, BUBR1 phosphorylation at its kinetochoremicrotubule attachment domain (KARD) creates a binding motif for the B56 subunit of the phosphatase PP2A. Surprisingly, the pseudokinase BUBR1, in complex with PP2AB56, acts as an important phosphatase of the mitotic checkpoint by counteracting the SAC-activating kinases AURORA B and MPS1. How the evolutionary path of a protein kinase ultimately led it to promote dephosphorylation, the opposite role from its original kinase domain, is an intriguing question. From an evolutionary perspective, the Bub family gene evolved from a single ancestral gene, termed Madbub, that presented two essential domains for mitosis, v the kinase and the KEN box domain. Accordingly, Madbub undertook distinct gene duplication events throughout evolution leading to a parallel subfunctionalization of the protein yielding two different copies. One of the copies, BUB1, lost the KEN box domain but retained the kinase domain. However, the other copy, MAD3, retained the KEN box and lost the kinase domain. Barring a few exceptions, the MAD3 copy in a number of insects and vertebrates, called BUBR1, retained the kinase domain albeit severely degenerated, yielding an inactive kinase domain, or pseudokinase. Retaining this catalytically inactive domain is believed to be an evolutionary advantage since it confers stability to the whole protein. Indeed, mutations in the BUBR1 pseudokinase domain are associated with the disease Mosaic Variegated Aneuploidy, a severe condition that causes the development of cancer in children due to a reduction in BUBR1 levels. Nevertheless, since BUBR1 truncated at its kinase domain is in fact more stable than wild-type and the kinase-lacking BUBR1- homolog MAD3 is present in the majority of lower eukaryotes s raise questions concerning whether the pseudokinase domain provides another attribute to BUBR1 function or regulation, especially in more complex organisms. The present study aims to clarify whether the pseudokinase domain of BUBR1 regulates KARD function in mitosis. We present the first insight of a pseudokinase domain controlling its binding to a phosphatase, as our data supports that the pseudokinase regulates KARD affinity to PP2AB56. Here we demonstrate that, besides its role in AURORA B centromeric recruitment, BUB1 has also a role in opposing AURORA B activity by promoting PP2AB56 tethering to BUBR1. Collectively, we unraveled a new role of the BUBR1 pseudokinase domain that is crucial for proper mitotic functions and helps explain the characteristic evolutionary path undertaken by the Bub1b gene.