Cette thèse de doctorat porte sur le transport du silicium (Si) par les aquaporines animales. Le Si est un élément abondant dans la nature où il joue des rôles im-portants, chez les plantes notamment. Il jouerait également des rôles importants en physiologie animale en contribuant à l’intégrité osseuse, à la santé tégumen-taire et au maintien du collagène. Bien que des transporteurs de Si soient déjà connus chez les diatomées et les plantes, aucun n’a encore été décrit chez l’animal. Toutefois, la compartimentalisation du Si au sein de l’organisme et son assimilation nutritionnelle suppose l’existence de tels transporteurs. En raison de l’homologie qu’elles partagent avec les transporteurs de Si chez les plantes, les aquaporines (AQPs) animales correspondent à des candidats pertinents. Dans ce contexte, les objectifs de la thèse étaient de déterminer si les AQPs sont per-méables au Si et, le cas échéant, de caractériser le rôle physiologique du trans-port en Si par les AQPs et d’identifier des résidus qui permettent à ces canaux d’agir ainsi. Nos travaux ont permis de constater que les AQP3, AQP7, AQP9 et AQP10 humaines, connues sous le nom d’aquaglycéroporines (AQGPs), peuvent toutes agir comme des transporteurs de Si ou plus spécifiquement de l’acide or-thosilicique qui permet à l’atome d’exister sous forme soluble. Le transport obser-vé est de nature michaelienne, sensible à la phlorétine (AQP7 et AQP9) mais in-sensible aux changements de pH et d’osmolalité extracellulaire. Aussi, la distribu-tion tissulaire de ces transporteurs concorde avec celle du Si, et l’expression des AQP3, AQP7 AQP9 dans le petit intestin de la souris est augmentée avec une diète faible en Si. Par ailleurs, nous avons démontré que la région des AQPs connue sous le nom de filtre aromatique/Arginine joue un rôle important dans la sélectivité à l’OSA, et que les résidus L84 chez AQP1 et N208 chez AQP10 jouent un rôle dans la sélectivité à l’eau et au Si respectivement. Ces travaux ont mené à la première description de transporteurs de Si chez l’animal, et à une meilleure compréhension de la physiologie de l’atome chez les mammifères. / The subject of this Ph.D. thesis is the transport of silicon (Si) by animal aqua-porins. Si is an abundant element in nature where it plays important roles, namely in plants. It also appears to play important physiological roles in animal physiolo-gy, by contributing to bone integrity, tegumentary health and collagen mainte-nance. Even though Si transporters have already been identified in diatoms and plants, none have been described in animals thus far. However, compartmentali-zation of Si throughout the mammalian body and nutritional assimilation suggest the existence of such transporters. Given the homology that they share with the Si transporters of plants, the mammalian aquaporins (AQPs) correspond to relevant candidates. In this context, the thesis’ objectives were, to determine whether AQPs are permeable to Si, and if so, to characterize the physiological role of Si transport by the AQP and to identify residues that allow these channels to act as such. Our work has allowed us to observe that human AQP3, AQP7, AQP9 and AQP10, also known as aquaglyceroporins (AQGPs), can all act as transporters for Si or more specifically for orthosilicic acid (OSA) that allow Si to be soluble in this form. The observed transport is michaelian in behavior, sensitive to phloretin (AQP7 and AQP9), but insensitive to changes in pH and extracellular osmolality. Also, tissular distribution of these carriers concords with that of Si, and expression of AQP3, AQP7 and AQP9 in the small intestine of mice is upregulated through a Si-poor diet. Otherwise, we have demonstrated that the region within the AQP that is knows as that aromatic/arginine filter (ar/R) plays an important role in OSA selec-tivity, and that residues L84 in AQP1 and N208 in AQP10 plays an important role in water permeability and Si permeability respectively. These results have led to the first description of Si transporters in animals, and a better understanding of the role played by this atom in mammalian physiology.

La voie endogène des microARN (miARN) est un processus de régulation cellulaire responsable principalement de réguler la traduction des ARN messagers (ARNm). Les miARN sont de petits ARN d'environ 21 à 23 nucleotides qui se lient spécifiquement à des sites de liaison retrouvés dans la région 3' non-codante des ARNm. Bien que le processus régule une panoplie d'ARNm différents, seulement quelques composantes protéiques sont impliquées afin de réaliser la biogenèse des miARN et de médier leur action régulatrice sur l'expression des gènes. La ribonucléase III Dicer est responsable de la génération des miARN, alors que la protéine Argonaute 2 (Ago2) est au centre du complexe effecteur de nature microribonucléoprotéique (miRNP). Afin d'étudier le fonctionnement de la voie des miARN chez l'humain, nous avons élaboré différents protocoles afin de pouvoir monitorer l'activité catalytique des protéines Dicer et Ago2 in vitro. Dicer a précédemment été localisée au reticulum endoplasmique (RE), mais ne possède pas de signal connu de localisation au RE. L'objectif général de mon projet de doctorat était donc d'identifier si des partenaires protéiques peuvent expliquer la présence de Dicer au RE. Dans ce travail, nous avons identifié et caractérisé la «cytoskeleton-linking endoplasmic reticulum membrane protein of 63 kDa» (CLIMP-63) comme nouveau partenaire protéique de Dicer. Impliquant une portion luminale de la CLIMP-63, l'interaction semble se produire à l'intérieur du RE. Dans les cellules humaines, on retrouve un complexe DicerCLIMP-63 de très haut poids moléculaire, une caractéristique possiblement conférée par la formation d'oligomères de la CLIMP-63. Le marquage métabolique des protéines cellulaires a permis d'observer que la CLIMP-63 interagit avec la forme nouvellement synthétisée de Dicer. La CLIMP-63 semble stabiliser la protéine Dicer, car sa surexpression augmente l'expression de la protéine endogène et surexprimée. La diminution de l'expression de la CLIMP-63, quant à elle, influence négativement l'expression de Dicer de même que celle d'un gène rapporteur contenant des sites de liaison à un miARN. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la CLIMP-63 est importante pour le bon fonctionnement de la voie endogène des miARN en interagissant et en stabilisant les formes nouvellement synthétisées de la protéine Dicer.

Bien que les protéines S100A8/A9 et S100A12 exprimées par les neutrophiles ne possèdent pas de peptide signal, elles sont retrouvées dans le sérum de patients souffrant de diverses maladies inflammatoires. Les mécanismes de sécrétion de ces protéines demeurent peu connus ainsi que les agonistes qui favorisent leur sécrétion. Nous avons donc émis l´hypothèse que plusieurs voies de sécrétion alternative ainsi que plusieurs agonistes des neutrophiles pourraient participer à la libération de ces protéines. Dans un premier temps, nous avons étudié les stimuli capables de provoquer la sécrétion de la calprotectine et/ou de la S100A12. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux signaux et mécanismes alternatifs de sécrétion impliqués dans le relargage de ces protéines. L’ensemble de ces travaux montre la complexité des voies de sécrétion alternatives impliquées dans la sécrétion des protéines S100 et comment ces voies sont influencées par l’activation des neutrophiles par différents agonistes. / Although S100A8/A9 (calprotectin) and S100A12 proteins expressed by neutrophils lack a signal peptide, they are found in the serum of patients with various inflammatory diseases. However, the mechanisms of secretion and the agonists that promote their secretion are still unknown. We hypothesized that several alternative secretory pathways and several agonists of neutrophils may participate in the release of S100A8/A9 and S100A12 protein. Initially, we studied the stimuli inducing the secretion of calprotectin and / or S100A12. In a second part, we were interested in signals and alternative mechanisms of secretion involved in the release of the calprotectin and S100A12. In conclusion, this study shows the complexity of alternative secretion pathways involved in S100 secretion and that these pathways are influenced by the activation of neutrophils by various agonists.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La maladie de Huntington (MH) est un désordre neurodégénératif très complexe, caractérisé par un éventail de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques. La maladie origine d'une mutation du gène de la *huntingtine* (*HTT*), laquelle mène à la production de la protéine HTT mutée (mHTT) qui s'agrège et interfère avec les fonctions cellulaires. Bien que la mHTT soit au cœur de la pathologie, de plus en plus d'évidences suggèrent que des formes anormales de la protéine Tau se retrouvent dans les structures cérébrales touchées par la MH. Cependant, ses mécanismes de toxicité sont peu connus. Mon projet de thèse avait donc pour but d'élucider la fonction de Tau dans le contexte de la MH. Nous avons choisi d'étudier l'administration de formes fibrillaires de Tau à des modèles murin et cellulaire de la maladie. L'injection intracérébrale de fibrilles a eu pour effet de précipiter et d'exacerber les déficits cognitifs ainsi que les comportements de type anxieux des souris traitées, lesquels étaient accompagnés par une augmentation des niveaux de protéines insolubles et du nombre d'agrégats de mHTT dans les régions du cerveau ciblées par la maladie. Les observations post-mortem ont de surcroit indiqué que les formes fibrillaires de Tau affectent d'autres éléments clés de la MH, tels que la neuroinflammation microgliale et l'atrophie cérébrale. L'exposition de formes pathologiques de Tau à une lignée striatale immortalisée modélisant la MH a également démasqué une altération de la fonctionnalité de la cellule, dépeinte par une augmentation des niveaux de calcium cytosolique. De là, nous avons émis l'hypothèse que l'accumulation d'inclusions de mHTT, suite à l'administration *in vivo* et *in vitro* de Tau, serait causée, entre autres, par un dysfonctionnement des voies de clairance protéique. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux chaperonnes moléculaires, Hsp70 et Hsp90, impliquées dans la protéostase. Nous avons observé que les niveaux solubles de ces protéines étaient effectivement altérés suite à l'exposition aux fibrilles et qu'ils étaient séquestrés à même les agrégats de mHTT. Ces résultats suggèrent une altération du fonctionnement de ces chaperonnes, conduisant à des problèmes de dégradation de protéines pathologiques, et donc une augmentation du nombre d'agrégats mHTT. Nos résultats mettent en lumière les conséquences de Tau sur plusieurs aspects associés à la MH ainsi que sur l'agrégation de la mHTT via un dysfonctionnement de voies de protéostase. Ceci ouvre la voie sur de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter la MH, soit en ciblant Tau ou encore en corrigeant/améliorant la dégradation de protéines pathologiques. / Huntington's disease (HD) is a very complex neurodegenerative disorder, characterized by a range of motor, cognitive and psychiatric impairments. The disease originates from a mutation in the *huntingtin* gene (HTT), which leads to the production of the mutated HTT protein (mHTT) that can in turn aggregate and interfere with cellular functions. Although mHTT is a core feature of the pathology, accumulating evidence suggests that abnormal forms of the Tau protein are also found in brain structures affected by HD but little is known about its mechanisms of toxicity. The aim of my thesis was to elucidate the function of Tau in the pathophysiology of HD. We therefore administered fibrillar forms of Tau to mouse and cell models of the disease. Intracerebral injection of fibrils precipitated and exacerbated cognitive deficits and anxiety-like behaviors in treated mice, which was accompanied by increased levels of insoluble proteins and mHTT aggregates in disease-targeted brain regions. Post-mortem observations further revealed that fibrillar forms of Tau affect other key elements of HD, such as microglial neuroinflammation and brain atrophy. Exposure of pathological forms of Tau to an immortalized striatal cell line also unmasked altered cell functionality, depicted by increased cytosolic calcium levels. From this, we hypothesized that the accumulation of mHTT aggregates, following *in vivo* and *in vitro* Tau exposure, would be caused, among other things, by interference of protein clearance pathways. We were particularly interested in the molecular chaperones Hsp70 and Hsp90 involved in proteostasis. We observed that soluble levels of these proteins were indeed altered following exposure to fibrils, and that they were sequestered within mHTT aggregates. These results suggest an alteration in the function of these chaperones, leading to problems with the degradation of pathological proteins, and hence an increase in the number of mHTT aggregates. Our results highlight the consequences of Tau on several aspects associated with HD, as well as on mHTT aggregation via dysfunctional proteostasis pathways. Our findings pave the way for the identification of new therapeutic approaches to treat HD, either by targeting Tau or by correcting/enhancing the degradation of pathological proteins.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Cette étude est consacrée à l'analyse des propriétés électrostatiques et structurales des protéines diffractant à haute résolution. Les travaux se déclinent en deux aspects principaux qui sont, d'une part, l'analyse d'un point de vue fondamental des propriétés dérivées de leur distribution de charge des structures des protéines, et, d'autre part, l'application pratique des méthodes de la cristallographie haute résolution des macromolécules à deux enzymes.Grâce à une analyse structurale et électrostatique de la protéine PfluDING, le mode de fixation du phosphate a été mis en évidence à deux pH différents. En particulier, cette étude a permis de démontrer la présence d'une liaison hydrogène diffuse assurant un mode de fixation identique quelque soit le pH. La seconde enzyme étudiée est la protéine DFPase, capable de dégrader les organophosphorés. La structure de la DFPase obtenue par diffraction X haute résolution et la structure affinée contre des données neutroniques ont été comparées. L'analyse pointe les différences d'interprétation des deux modèles, et permet de proposer un nouveau mécanisme d'action.Les aspects plus fondamentaux de cette étude portent sur les éléments de structure secondaire des protéines : leurs propriétés électrostatiques en termes de moments électriques (moments dipolaires et quadripolaires des hélices et des feuillets), et le réseau des interactions (dont les liaisons H) assurant la cohésion des hélices ont été analysés. Il a été démontré comment certaines interactions entre liaisons peptidiques au sein d'hélices, classiquement représentées comme des liaisons hydrogène, devaient être considérés comme des contacts purement électrostatiques / This study is about the electrostatic and structural properties of proteins diffracting at high X-ray resolution. Two different aspects are tackled which are 1) the analysis of properties derived from their charge distribution, parting from a fundamental point of view and 2) the application of methods used in high resolution macromolecular crystallography to two enzymes of major interest.After the analysis of the structure and electrostatic properties of PfluDING protein, the binding mode of a phosphate ion, located in the active site, was elucidated at two different pH values. Particularly, this study demonstrates that a diffuse hydrogen bond assures the protonation state of the phosphate ion, which is thus identical at each pH value. The second enzyme studied is the proteine DFPase which is capable of hydrolysing nerve agents. A high resolution X-ray structure and a medium resolution neutron structure where compared. The analysis points out the differences between the two models and a new catalytic mechanism could be proposed.The more fundamental aspects of this study are about the secondary structural elements of proteins: their electrostatic properties in terms of electrostatic moments (dipole and quadrupole moments of helices and sheets) as well as the hydrogen bond network assuring the cohesion of helices have been analyzed. It has been shown that certain interactions between peptide units within helices, represented usually as hydrogen bonds, should actually be considered as pure electrostatic contacts

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval comme exigence partielle du programme de maîtrise en Médecine Expérimentale offert à l'Université du Québec à Chicoutimi en vertu d'un protocole d'entente avec l'Université Laval pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)" / Huntingtin interacting protein-1 (HIP1) et Huntingtin interacting protein-1-related (HIP1R) ont été identifiées comme des protéines intervenant dans l’endocytose médiée par les vésicules de clathrine par leurs interactions avec d ’autres protéines endocytaires. Pour mieux comprendre les rôles attribués à HIP1/R dans cette machinerie, nous avons procédé à l’identification de nouveaux partenaires d ’interaction. Au cours de notre étude, nous avons identifié HSC70 (Heat-shock Cognate Protein70) comme un nouveau partenaire pour les domaines TALIN des deux protéines par des essais de pull-down et analyse par spectrométrie de masse. Au cours de cette étude nous avons identifié également que l’association d ’HSC70 avec le domaine TALIN d ’HIPIR, compromet sa sédimentation avec les filaments d ’actine. HIP1R est une composante du manteau de clathrine, son interaction avec HSC70 l’a impliquée dans le démantèlement des vésicules. Dans cette étude, nous avons vérifié l’intervention d ’HIPIR dans le démantèlement de la clathrine suite à son interaction avec HSC70 et la relation de ce mécanisme avec la perte d ’interaction avec l’actine.

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65. / In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.