Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / p54nrb est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire impliquée dans plusieurs processus cellulaires tels que la transcription, la maturation des ARNm et la rétention des ARNs hyper-édités. Cette protéine multifonctionnelle fait partie de la machinerie d'épissage et participe à ce processus en liant directement le site d'épissage en 5' du pré-ARNm. De plus, p54nrb se concentre dans un corps nucléaire nommé le paraspeckle en liant une fraction riche en G de l'ARNnc NEAT1. Récemment, nous avons démontré que la phosphorylation mitotique de la threonine 15 de p54nrb, située en N-terminal de deux RRMs en tandem, régule négativement sa capacité de liaison aux ARNs excepté pour ceux riches en G comprenant l'ARNnc NEAT1 (Bruelle et al., sous presse, annexe A). Afin de caractériser la liaison des différents RRMs de p54nrb à l'ARN, une dissection moléculaire de son domaine de liaison à l'ARN (DLA) a été réalisée. Cette section contient les deux RRMs de la protéine précédés d'une région riche en H, Q, et P contenant le résidu T15 phosphorylable. Des tests de liaison in vitro à l'ARN du site d'épissage en 5' (5'SS, 11 nucleotides) et à des ARNs de polyguanosines ont permis de démontrer que le RRM1 de p54nrb est responsable de l'affinité de la protéine pour ces ligands. De plus, la cartographie des sites d'interaction du RRM1 avec le 5'SS et avec un ARN de polyguanosines (polyG, 11 nucleotides) a été réalisée par RMN et a révélé un site de liaison unique pour chacune de ces molécules. En effet, nous avons démontré que le RRM1 de p54nrb lie l'ARN polyG par un site de liaison non classique différent du site de liaison classique utilisé par la protéine pour lier le 5'SS. Ces expériences ont aussi permis de voir que le RRM1 de p54nrb avait plus d'affinité pour le polyG que pour le 5'SS. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois, à notre connaissance, la possibilité pour un seul RRM de posséder deux sites distincts de liaison à l'ARN. De plus, cette liaison non classique du RRM1 de p54nrb aux ARNs de polyguanosines pourrait potentiellement expliquer pourquoi la liaison de la protéine à ce type d'ARN n'est pas affectée par sa phosphorylation.

Notre projet visait en premier à étudier la protéolyse sécrétée par l'endomètre eutopique provenant de femmes atteintes de la maladie et la comparer avec l'endomètre eutopique provenant de femmes saines. Nous avons démontré une augmentation dans l'activité protéolytique et nous avons identifié une augmentation de la sécrétion et de l'expression de la MMP-9 par l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de la maladie. Nous avons par la suite étudié l'effet de l'activité protéasique sur la dégradation de l'IL1 rll. Nous avons démontré que l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de l'endométriose cause la dégradation de l'IL-lrlI. La troisième partie du projet consistait en l'identification de molécules bioactives sécrétées par les cellules endométriosiques qui seraient responsables de l'angiogénèse retrouvée chez les femmes souffrant de la maladie. Nous avons réussi à identifier la nm23b, une protéine qui possède une influence angiogénique chez certains cancers lorsqu'elle est surexprimée.

Les démences affectent des millions de personnes dans le monde et la forme la plus répandue est la maladie d’Alzheimer (MA). Malgré des décennies de recherches, il n’y a toujours pas de traitement efficace pour contrer cette maladie. Elle est caractérisée par deux marqueurs distincts : les plaques amyloïdes extracellulaires générées par le clivage de la protéine Amyloid Precursor Protein (APP) ainsi que les enchevêtrements neurofibrillaires formés de la protéine tau. Cette dernière est également dérégulée dans une vingtaine de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. Plusieurs études ont montré que les niveaux des microARNs (miRs) sont altérés chez des personnes atteintes de maladies neurodégénératives telles que la MA. Notamment, le miR-132 se retrouve à être l’un des plus réduit. Pour mieux comprendre l’implication des microARNs (miRs) dans la progression de la MA et les tauopathies, mon objectif de doctorat a été d’étudier le rôle du miR-132 sur la régulation de tau en utilisant aussi bien des outils in vitro que des méthodes in vivo. Nous avons identifié in vitro un facteur d’épissage, PTBP2 pouvant réguler l’inclusion d’un exon important de tau. Ce facteur est augmenté et corrèle inversement avec l’expression de miR-132 chez un groupe de patients atteints de paralysie supranucléaire progressive (PSP), une maladie tauopathique. À l’aide de tests comportementaux, nous avons également démontré qu’une abolition génétique de miR-132 chez la souris réduisait l’apprentissage et la mémoire qui sont des conséquences connues de la MA. Enfin, nous avons établi que l’absence du miR-132 accélère la phosphorylation et l’agrégation de tau dans un modèle de souris Alzheimer. Nous avons démontré que miR-132 régule directement tau par son 3’Untranslated Region (3’UTR) et que l’expression de miR-132 corrèle avec différents tests cognitifs dans une cohorte de patients atteints de la MA. De plus, nous avons développé une approche thérapeutique prometteuse en utilisant ce miR comme agent de traitement dans le cerveau d’un modèle de souris Alzheimer. Ces travaux ont contribués à la compréhension de la progression des maladies neurodégénératives multifactorielles telles que la MA. / Dementia affects millions of people worldwide and the most common form is Alzheimer’s disease (AD). After more than a century of research, there is no efficient cure for this neurodegenerative disease. There are two pathological hallmarks : senile plaques formed by beta-amyloid peptide deposits and neurofibrillary tangles composed of a hyperphosphorylated and aggregated protein called tau. Tau pathology is also found in twenty neurodegenerative diseases called tauopathies. Studies have shown that miRNA expression profiles are deregulated in post-mortem brain tissues of patients. Of interest, miRNA-132 (miR-132) was the most downregulated. To understand the role of miRNAs in AD, my main goal was to study the involvement of miR-132 in tau regulation using in vitro tools and transgenic mice. We have identified a splicing factor, PTBP2 which affects tau exon inclusion. This factor is upregulated in a subset group of tauopathic patients, (progressive supranuclear palsy (PSP)). The miR-132 level reduction was also correlated with the PTBP2 upregulation in this cohort of patients. In the second study, we have demonstrated that learning, memory formation and retention are altered in a miR-132 knockout mouse model. Finally, we have found that a long-term loss of miR-132 promotes tau hyperphosphorylation and aggregation in AD mice. We have demonstrated that tau is a direct target of miR-132 and their expression levels in human correlate with different cognitive test scores from in AD patients. Finally, we have developed a miR-132-based therapeutic strategy in the AD mouse brain with promising results. Taken together, these results have contributed to the better understanding of complex neurodegenerative diseases such as AD.

Introduction. La distribution asymétrique des composantes cellulaires au sein des cellules épithéliales résulte en une polarité apico-basale, laquelle divise la cellule en un domaine apical, un domaine latéral et un domaine basal. Cette polarité est essentielle à la physiologie des tissus épithéliaux et à l’homéostasie des organes. D’ailleurs, la perte de polarité épithéliale favorise la progression tumorale. Crumbs est une protéine de la polarité limitant la progression tumorale. Chez la drosophile, la protéine Yurt, associée au cortex cellulaire, inhibe Crumbs. De plus, les orthologues humains de Yurt – EPB41L5 et EPB41L4B – sont surexprimés dans plusieurs cancers. Leur surexpression amplifie la formation de métastases et est donc associée à un mauvais pronostic. Ces protéines seraient de bonnes cibles thérapeutiques, mais leurs modes de régulation sont peu connus. Nous émettons l’hypothèse que la localisation subcellulaire est importante pour la régulation de Yurt et ses orthologues. Ce projet vise à 1) définir les domaines de Yurt lui permettant de lier le cortex cellulaire et 2) déterminer les mécanismes régissant cette localisation. Méthodologie et résultats. Nous avons procédé à une analyse structure-fonction couplée à des immunofluorescences pour identifier les domaines protéiques responsables de la localisation corticale de Yurt. Diverses troncations et délétions au sein de la protéine nous ont permis d’identifier un motif basique et hydrophobe et un domaine Pleckstrin Homology-like au sein du domaine FERM permettant de cibler Yurt au cortex. Cette association se fait par des interactions électrostatiques avec des lipides membranaires. Conclusion. Nous avons mis en lumière de nouveaux mécanismes régulant la protéine Yurt. Ces connaissances pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en oncologie ciblant les orthologues humains de Yurt. / Introduction. Epithelial polarity is characterized by the asymmetrical distribution of cellular components in epithelial cells, which divides the cell into an apical domain, a lateral domain, and a basal domain. This polarity is essential for proper tissue function and the homeostasis of organs. Indeed, loss of epithelial polarity contributes to cancer progression. Crumbs is a polarity protein that limits tumour progression. In Drosophila, the protein Yurt, which associates to the cell cortex, limits the activity of Crumbs. Moreover, the human orthologs of Yurt – EPB41L5 and EPB41L4B – are overexpressed in many cancers. This overexpression increases metastasis formation and is thus associated with a poor prognosis. These proteins represent potential targets in the treatment of cancer, but little is known about their modes of regulation. We hypothesize that subcellular localization is important for the regulation of Yurt and its human orthologs. The aims of this project are to 1) define which domains of Yurt target it to the cell cortex and 2) determine the mechanisms responsible for this localization. Methodology and results. We performed a structure-function analysis coupled to immunofluorescence to identify the protein domains responsible for the cortical localization of Yurt. Many truncations and deletions were tested and allowed the identification of one basic and hydrophobic motif along with a Pleckstrin Homology-like domain within the FERM domain that are essential for Yurt’s cortical localization. This localization is mediated by electrostatic interactions with membrane lipids. Conclusion. We have successfully identified novel mechanisms regulating Yurt localization. These findings could contribute to the development of new therapeutics in oncology that target the human orthologs of Yurt.

Les petites protéines de stress/Small heat shock proteins (sHsps) sont des chaperons moléculaires ATP-indépendants ubiquitaires retrouvées chez les procaryotes et eucaryotes. Elles sont dynamiques structurellement et la majorité d’entre elles possèdent la capacité de former de gros complexes oligomériques. Également, elles protègent les cellules du stress protéotoxique causé par divers facteurs de stress abiotiques en prévenant l’agrégation des protéines dénaturées et en promouvant leur repliement par les chaperons moléculaires ATP dépendants tels que Hsp70/DnaK. Récemment, la présence de gènes de sHsp (HspSP-ShM2) chez des virus marins et plus précisément chez des cyanophages infectant le genre Synechococcus sp. et Prochlorococcus sp ont été caractérisés in silico. Au niveau de sa séquence, la sHsp de 18 kDa de Synechococcus sp. montre un domaine alpha crystallin de 92 acides aminés hautement conservé au sein des sHsps, une région C-terminale contenant le motif CAM canonique de type (L-X-I/L/V) et une région N-terminale relativement courte. Nous avons établi grâce à la chromatographie par exclusion stérique (SEC) et le système de Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) sa capacité à former des complexes oligomériques de haut poids moléculaires (600 kDa et 200kDa). De plus, nous avons démontré qu’elle prévient l’agrégation de la citrate synthase, la malate dehydrogenase et la luciférase en condition de stress thermique suggérant qu’elle possède une faible spécificité et un large spectre de protéines clientes/substrats. La prévention complète de l’agrégation a été obtenue à différents ratios (sHsp:substrat) selon le substrat, ce qui indique qu’il y aurait possiblement des interactions différentes et uniques avec chacun d’eux. Nous avons ensuite mis en évidence la formation d’hétéro-oligomères stables et solubles entre HspSP-ShM2 et son substrat dans les mêmes conditions, ce qui est en accord avec les caractéristiques des sHsps en général. Quant à elle, la sHsp de la cyanobactérie Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803) possède un poids moléculaire de 15 kDa et montre une capacité à former des tétramères (60 kDa) sur essai de SEC par FPLC en présence de Triton™X-100 pour le maintien de sa solubilité. Contrairement à HspS-ShM2, HspS-WH7803 ne démontre aucune activité protectrice sur l’agrégation des substrats mentionnés précédement à différents ratios molaires. Finalement, des analyses par SEC/FPLC suggèrent la formation de complexes hétéro-oligomériques entre HspSP-ShM2 et celle de son hôte, HspS-WH7803 de Synechococcus WH7803. Cette interaction entre les sHsps pourrait soit optimiser ou inhiber l’activité de chaperon moléculaire et la réponse au stress de son hôte dans le but de favoriser le cycle viral. / Small heat shock proteins (sHsps) are ubiquitous ATP-independent molecular chaperones found in prokaryotes and eukaryotes. They are structurally dynamic and most of them have the ability to form large oligomeric complexes and to protect cells from proteotoxic stresses by preventing aggregation of non-native proteins and promoting their refolding via ATP-dependent chaperones such as Hsp70/DnaK. Recently, the presence of a sHsp gene (HspSP-ShM2) in marine viruses has been reported using bioinformatics tools. More precisely, the gene has been found in cyanophages infecting cyanobacteria of the genre Synechococcus sp. and Prochlorococcus sp. The Synechococcus phage sHSP has a MW of 18 kDa and shows the highly conserved core alpha crystalline domain of 92 amino acids and relatively short N- and C-terminal arms, the later containing the classical CAM domain (L-X-I/L/V). We established its oligomeric profile using a size exclusion chromatography (SEC) and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system and demonstrated its ability to form large oligomeric complexes in native conditions (600 kDa and 200kDa). Furthermore, we report its capacity to prevent the aggregation of citrate synthase, malate dehydrogenase and luciferase suggesting that it has a weak specificity and wide range of protein substrates. The complete prevention of aggregation was achieved at different ratios (sHsp:substrate) depending on the substrate indicating that the sHSP may have different and unique interactions with each of its clients. We also showed the formation of a stable and soluble hetero-oligomeric complex of the phage sHSP and its substrates under heat stress, which is in accordance with the characteristics of sHSP in general. The cyanobacteria Synechococcus WH7803 15 kDa sHSP (HspS-WH7803) shows the ability to form tetramers in the presence of Triton™X-100 for the maintenance of its solubility using the SEC/FPLC method. For its capability to prevent the aggregation of different substrates, HspS-WH7803 demonstrates no chaperon like activity in all the assays and molar ratios used. Finally, SEC/FPLC results indicate the possible formation of a hetero-oligomeric complex between the sHSP of the phage and the one from its host Synechococcus WH7803 (HspS-WH7803). This interaction could either optimize the chaperone activity and the stress response of its host or inhibit the host sHSP to facilitate the viral life cycle.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative causée par la mutation du gène codant la protéine huntingtine (HTT). Cette protéine, exprimée par toutes les cellules de l'organisme, peut adopter une forme mutée qui lui confère un aspect toxique. Dans les cellules, la mHTT va s'agréger et former di érentes structures dont des agrégats, marqueurs distinctifs de la maladie, ou des brilles. Dans le cerveau, la présence de la mHTT va causer une mort neuronale dramatique entraînant, à l'échelle de l'individu, une panoplie de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques. Depuis plusieurs années des études tendent à démontrent que la mHTT peut se propager de cellules à cellules et corrompre la HTT non mutée tel un prion. Pour mon projet de recherche, j'ai ainsi investigué les propriétés prioniques de la mHTT sous sa forme fibrillaire particulièrement toxique. Des fibrilles synthétiques contenant la mutation pathologique ont été utilisées pour infecter des cellules en culture et des souris. De cette manière, nous avons démontré la capacité des fibrilles à se propager et à provoquer des dommages divers dans 3 types de cellules humaines. La présence des fibrilles a également induit l'agrégation de la forme non mutée de la HTT endogène, normalement présente dans les cellules. Chez la souris, ces résultats ont été confirmés suite à l'injection des fibrilles dans le cerveau des animaux. La présence des fibrilles dans le système nerveux central des souris sauvages a provoqué la manifestation de signes caractéristiques de la MH (troubles cognitifs et moteurs). De plus, une apparition de déficits moteurs et cognitifs qui s'apparentent à la maladie a été observée chez des souris R6/2, modèle transgénique de la MH, suite à l'injection des fibrilles. Les résultats de mon projet de recherche renforcent ainsi l'hypothèse prionique de la mHTT et appuient l'hypothèse que ces propriétés pourraient être impliquées dans la physiopathologie de la MH.

La malaria est une maladie endémique qui a affecté 212 millions de personnes en 2015, et fait plus de 429 000 morts. Parmi les espèces causant la malaria humaine, Plasmodium falciparum est celle qui est associée au plus haut taux de morbidité et de mortalité. L’invasion du globule rouge par le parasite de la malaria, P. falciparum, est une étape clé qui est médiée par la sécrétion coordonnée de différentes protéines contenues dans les organites du complexe apical : les rhoptries, les micronèmes et les granules denses. La biogenèse de ces organites et le transport des différentes protéines apicales sont des phénomènes encore mal compris et peu étudiés. Des travaux ont montré que des microdomaines présents dans la membrane de l’appareil de Golgi possèderaient une composition lipidique et protéique distincte et seraient impliqués dans la sélection différentielle des protéines destinées aux organites du complexe apical. Cependant, la façon dont ces microdomaines sont discriminés l’un de l’autre et les mécanismes régissant leur transport à partir de l’appareil de Golgi vers le complexe apical sont présentement inconnus. Nous avons donc entrepris d’identifier les différents acteurs moléculaires impliqués dans ce trafic différentiel des protéines apicales. Les travaux réalisés dans le cadre d’un premier projet ont permis de démontrer que la sortiline, un récepteur de cargo conservé chez les eucaryotes, joue un rôle essentiel dans le transport de protéines vers les différents organites apicaux. Nous avons également démontré que la sortiline interagit avec le complexe de protéines RAMA/RAP afin d’assurer leur transport spécifique vers les rhoptries. L’analyse du phénotype en situation de « knock-down » de la sortiline a révélé à la fois un rôle essentiel de la sortiline dans la biogenèse des organites du complexe apical, mais aussi dans le processus de cytokinèse lors de la division cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle central et essentiel de la protéine escorte sortiline dans le système de transport protéique chez le parasite de la malaria P. falciparum. Dans le cadre d’un second projet, nous avons caractérisé une potentielle protéine de rhoptries (PRP2) identifiée chez Plasmodium berghei et chez Toxoplasma gondii. Nous avons cependant démontré que chez P. falciparum, cette hypothétique protéine de rhoptries est plutôt localisée à l’appareil de Golgi et n’est pas impliquée dans les évènements d’invasion. De ce fait, nous avons renommé cette protéine « Golgi protein 1 » (GP1) . Nous avons également découvert que GP1 interagit avec une protéine transmembranaire non caractérisée (« Golgi protein 2 », GP2). Nos travaux ont donc mené à la découverte d’un nouveau complexe de protéines situé dans l’appareil de Golgi et important pour la survie du parasite.

La superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT) est constituée de glycoprotéines résidant au réticulum endoplasmique et sujettes aux modifications post-traductionnelles (PTM, post-translational modifications). L’enzyme UGT2B7 est d’un intérêt particulier vu son action sur une grande variété de médicaments. La plupart des études actuelles n’ont pour sujet que les variants communs de cette enzyme et n’examinent donc qu’une fraction de la diversité génétique de celle-ci. En effet, les variants rares (fréquence allélique en deçà de 1%) peuvent potentiellement avoir un effet considérable puisqu’ils sont prédits comme étant bien plus nombreux que les variants communs au sein du génome humain. La présente étude fait état de la découverte d’un variant rare d’UGT2B7 possédant un intérêt pharmacogénétique potentiel et encodant une substitution d’acide aminé au codon 121. Cette variation peu fréquente, retrouvée chez deux individus au sein d’une population de 305 sujets sains, mène à la traduction d’une asparagine (Asn) plutôt qu’un acide aspartique (Asp) au codon 121 (UGT2B7 p.D121N). Cette substitution est prédite comme créant un motif de N-glycosylation NX(S/T) subséquemment validé par traitement à l’endoglycosidase de fractions microsomales issues de surexpressions dans des cellules HEK293 et par inhibition à la tunicamycine de la N-glycosylation d’UGT2B7 produites de façon endogène dans des HEK293. De plus, la présence d’un oligosaccharide additionnel sur l’enzyme UGT2B7, affectant potentiellement son repliement, résulte en la diminution, respectivement par 49 et 40%, de la formation de glucuronides à partir de la zidovudine et de l’acide mycophénolique. Une analyse de la base de données dbSNP a permis la découverte de 32 variants rares pouvant potentiellement créer ou abolir des motifs de N-glycosylation au sein d’enzymes UGT2B. Ensemble, ces variants ont le potentiel d’augmenter la proportion de la variance de la voie des UGT qui est expliquée par des modifications post-traductionnelles telles la N-glycosylation, affectant ainsi le métabolisme des médicaments. / The UDP-glucuronosyltransferase (UGT) superfamily consists of glycoproteins resident of the endoplasmic reticulum membranes that undergo post-translational modifications (PTM). UGT2B7 is of particular interest because of its action on a wide variety of drugs. Most studies currently survey common variants and are only examining a small fraction of the genetic diversity. However, rare variants (frequency < 1%) might have significant effect as they are predicted to greatly outnumber common variants in the human genome. Here, we discovered a rare single nucleotide UGT2B7 variant of potential pharmacogenetic relevance that encodes a nonconservative amino acid substitution at codon 121. This low-frequency variation, found in two individuals of a population of 305 healthy volunteers, leads to the translation of an asparagine (Asn) instead of an aspartic acid (Asp) (UGT2B7 p.D121N). This amino acid change was predicted to create a putative N-glycosylation motif NX(S/T) subsequently validated upon endoglycosidase H treatment of microsomal fractions and inhibition of N-glycosylation of endogenously produced UGT2B7 with tunicamycin from HEK293 cells. The presence of an additional N-linked glycan on the UGT2B7 enzyme, likely affecting proper protein folding, resulted in a significant decrease, respectively by 49 and 40%, in the formation of zidovudine and mycophenolic acid glucuronides. A systematic survey of the dbSNP database uncovered 32 rare and naturally occurring missense variations predicted to create or disrupt N-glycosylation sequence motifs in the other UGT2B enzymes. Collectively, these variants have the potential to increase the proportion of variance explained in the UGT pathway due to changes in PTM such as N-linked glycosylation with consequences on drug metabolism.

Le transporteur MRP2 est connu comme étant la seule pompe qui occupe une position apicale au sein des cellules polarisées, elle est responsable du transport des anions organiques et des drogues, le mécanisme de transport de ces substrats était le sujet de recherche de plusieurs études, et dans ce travail nous étions capable de dévoiler l'importance des acides aminés chargés négativement (D333, D427, D433, D496, E532, D575) situés dans ou prés des hélices transmembranaires TM6, TM8, TM9, TM10 et TM11 de la protéine, ces derniers jouent des rôles cruciales dans l'activité de transport et dans le maintien de la structure fonctionnelle de MRP2.

Montréal Trigonix inc. 2018