Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Traina_Fabiola_D.pdf: 10463418 bytes, checksum: a1c92a0820404ccf5ce6623bff80018a (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas / Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Felipe Lapenda (felipe.lapenda@ufpe.br) on 2015-03-18T14:06:39Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO KELLYANE da CRUZ.pdf: 891441 bytes, checksum: 77667e280aae2c996010889f779323bd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T14:06:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO KELLYANE da CRUZ.pdf: 891441 bytes, checksum: 77667e280aae2c996010889f779323bd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-08-15 / A hidrólise proteica e a síntese de aminoácidos livres podem refletir do ponto de vista nutricional, a melhoria de parâmetros como: Digestibilidade e utilização proteica. Dentre os vários tipos de produtos, os suplementos alimentares surgem como um mercado em constante ascensão e de fácil acesso pela população, mesmo quando possuem indicações restritas de uso. O presente trabalho se propôs a avaliar a qualidade proteica de suplemento alimentar destinado a atletas, quanto ao teor de proteínas totais e grau de hidrólise. Foram selecionados produtos de elevada concentração proteica, tais como: hidrolisados do soro do leite, aminoácidos de cadeia ramificada, glutamina e creatina. Os produtos foram analisados a partir de três diferentes métodos de quantificação de proteína total: Biureto, Kjeldahl e Análise alimentar através da aplicação de equação preditiva sugerida por Kumae. As frações peptídicas dos hidrolisados foram analisadas através da precipitação com ácido tricloroacético e tungstato de sódio, e também por espectroscopia de massas. Conforme análises química e elementar foram encontradas inadequações significativas entre quantidade proteica declarada no rótulo em 20% destes produtos. Foi observada forte correlação (r>0,83) entre os métodos de quantificação de nitrogênio total: Kjeldahl e Análise elementar; e fraca correlação (r<0,33) destes com o método colorimétrico Biureto. A precipitação diferencial com ácidos representa uma alternativa para a caracterização de frações peptídicas de hidrolisados proteicos, sendo necessárias adaptações metodológicas para atender às características destes produtos. Os suplementos nutricionais necessitam de maior monitoramento e controle de qualidade para sua comercialização.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Máquinas de aprendizagem têm sido aplicadas em diferentes problemas em Bioinformática. Similarmente, algoritmos de descoberta de padrões também têm sido usados para descobrir motifs em seqüências de proteínas, contribuindo na definição de assinaturas (tais como impressões digitais) que caracterizam classes funcionais de proteínas. Como por exemplo, a classe de receptores acoplados a proteína-G (GPCR) que representam uma das maiores famílias no Genoma Humano. Esta família é um dos grandes alvos de pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de novas drogas, conseqüentemente, de grande interesse para a indústria farmacêutica. O modelo proposto nesta dissertação combina máquinas de aprendizagem, como SVM (Support Vector Machine) e MLP (Multilayer Perceptron), e métodos de descoberta de padrões no desenvolvimento de um procedimento para predizer a relação entre uma seqüência primária de proteínas e sua classe funcional. Como caso de estudo, este trabalho apresenta experimentos com a superfamília GPCR, usando padrões em forma de expressões regulares desta família extraídos pelo SPEXS (Sequence Pattern EXhaustive Search), um algoritmo para descoberta de padrões

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-04-26T17:24:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Amanda Emanuella Rocha de Souza.pdf: 3703211 bytes, checksum: 0ff76a59bbd3e8c7f557c0b7613322b6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T17:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Amanda Emanuella Rocha de Souza.pdf: 3703211 bytes, checksum: 0ff76a59bbd3e8c7f557c0b7613322b6 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / CAPES / CNPQ / A cana-de-açúcar é uma das principais fontes de açúcar e etanol do planeta. A planta é um híbrido de duas espécies de gramíneas C4, que tem alto desempenho fotossintético. Os efeitos das mudanças climáticas, como o aumento dos níveis de UVB e seca, junto com a elevação nos custos do petróleo aliadas às necessidades estratégicas de produção de energia, impeliram ações em nível global para o desenvolvimento de pesquisas na área de combustíveis renováveis. Atualmente, a conversão de material lignocelulósico da parede celular de cana-de-açúcar em açúcares fermentáveis para produção de etanol vem sendo considerada como uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol necessária para atender à demanda mundial. Do ponto de vista funcional, a parede celular é essencial para o crescimento e diferenciação, sinalização, resposta e defesa contra estresses bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danos ocasionados pelos estresses ambientais UVB e seca, este trabalho apresentou três enfoques principais: o desenvolvimento de um protocolo para extração de proteínas enriquecida de parede celular em tecido foliar de cana-de-açúcar; o estudo em cana-de-açúcar da interação entre os fatores de estresse UVB e seca moderada; e o estudo da imposição dos estresses simultâneos UVB e estresse hídrico severo, em busca de uma melhor compreensão da interação desses estresses abióticos nos processos fisiológicos, enzimáticos e no proteoma diferencial em cana-de-açúcar. O desenvolvimento do protocolo para extração de proteínas com enriquecimento para parede celular de folhas de cana-de-açúcar foi eficiente e validou a utilização conjunta dos extratos com CaCl2 e LiCl para maior representatividade do proteoma extracelular nesta espécie. De maneira geral, os estresses impostos nos dois estudos provocaram alterações significativas no proteoma da fração enriquecida de parede celular nas folhas de cana-de-açúcar, bem como, ocasionaram estresse oxidativo nas duas variedades. As proteínas diferencialmente acumuladas identificadas nos dois estudos podem estar associadas a mecanismos de regulação gênica, ligadas as variações fisiológicas, enzimáticas e metabólicas aqui detectadas, potencialmente responsáveis pela tolerância ao déficit hídrico e à radiação UVB. Na aplicação dos estresses simultâneos, seca moderada e UVB, a análise por espectrometria de massas identificou 14 proteínas responsivas a estresses, fotossíntese e enzimas da parede celular associados à biossíntese de ligninas e/ou flavonóides. Durante a interação simultânea com déficit hídrico severo e UVB, o proteoma da cana-de-açúcar em análise por espectrometria de massas identificou 42 proteínas especialmente envolvidas em defesa celular, resposta a estresse abiótico, biossíntese de lignina, síntese de flavonóides e algumas constituintes de parede celular. Os resultados obtidos compõem um conjunto de proteínas (e genes codificantes) promissoras como marcadores funcionais auxiliares no melhoramento genético, para desenvolvimento de variedades tolerantes ao estresse hídrico e UVB. / Sugarcane is one of the main sources of sugar and ethanol in the world. The plant is a hybrid of two species of C4 grasses, which has high photosynthesis performance. The effects of climate change, such as increased levels of UVB and drought, along with rising oil costs together with strategic energy needs have lead to global actions for the development of research in the area of renewable fuels. Currently, the conversion of lignocellulosic material of the cell wall of sugarcane into fermentable sugars for ethanol production has been regarded as a promising alternative to increase ethanol production required to meet global demand. From the functional point of view, the cell wall is essential for growth and differentiation, signaling, response and defense against biotic and abiotic stresses. Due to the importance of culture and the damage caused by environmental stresses UVB and dry, this work focused three main approaches: the development of a protocol for protein extraction of enriched cell wall in foliar tissue of sugar cane; the study on sugar cane from the interaction between the factors of UVB and moderate drought stresses; and the the study of the charge of the simultaneous stressing factors UVB and severe water deficit, in search of a better understanding of the interaction of these abiotic stresses on physiological and enzymatic processes and on sugarcane differential proteome. The development of the protocol for protein extraction with enrichment of cell wall from sugarcane leaves was efficient and validated the use of extracts with CaCl2 and LiCl for greater representativity of the extracellular proteome in this species. In general, the stresses imposed on two studies led to significant changes in the proteome of cell wall-enriched fraction in leaves of sugarcane, as well as caused oxidative stress in both varieties. Differentially accumulated proteins identified in both studies could be associated with genetic regulatory mechanisms, physiological variations and linked to enzymes detected potentially responsible for tolerance to water deficit and UVB radiation. On application of the simultaneous stresses, moderate drought and UVB, the analysis by mass spectrometry identified 14 stress-responsive proteins , photosynthesis and cell wall enzymes involved in the biosynthesis of lignins or flavonoids. During the simultaneous interaction with severe water deficit and UVB, the differential proteome of sugarcane in mass spectrometry analysis identified 42 proteins specially involved in cell defense response against abiotic stress, lignin biosynthesis, synthesis of flavonoids and some components of the cell wall. The results comprise a set of proteins (and coding genes) promising as markers in breeding, functionally useful to the development of tolerant varieties to water deficit and UVB.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-13T11:33:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 336296 bytes, checksum: 79768a6a328743883d2882be857e731c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T11:33:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 336296 bytes, checksum: 79768a6a328743883d2882be857e731c (MD5) Previous issue date: 2001-12-14 / Dois experimentos foram realizados com o objetivo de avaliar a digestibilidade ileal aparente e verdadeira de aminoácidos em diversos alimentos utilizados na alimentação de suínos. No primeiro experimento, foi avaliada a digestibilidade de aminoácidos do farelo de arroz, levedura de cana de baixa proteína e levedura de cana de alta proteína. Seis suínos machos castrados com peso médio de 40 kg foram utilizados para este objetivo. O segundo experimento objetivou a determinação da digestibilidade dos aminoácidos de farinha de vísceras de aves, farinha de vísceras de suínos, de farinha de vísceras mista e farinha de penas, utilizando oito suínos machos castrados, pesando inicialmente 40 kg em média. Em ambos experimentos, os animais foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições realizadas em dois períodos experimentais. O alimento a ser testado constituiu a única fonte de proteína da dieta. A ração foi fornecida com base no peso metabólico dos animais. O fornecimento de água foi à vontade. A determinação dos aminoácidos endógenos foi feita através da utilização de uma dieta isenta de proteína. Todos os alimentos testados apresentaram coeficientes de digestibilidade de seus aminoácidos parâmetro, serem de satisfatório empregados a alto, como podendo, substitutos com dos base neste alimentos convencionalmente utilizados na formulação de dietas para suínos desde que respeitados os níveis de inclusão mais adequados para cada alimento. / Two trials were carried out in order to determine the apparent and true ileal digestibilities of amino acids in some feeds used in formulation of growing swines diets. In the first experiment, rice bran, low protein dry yeast and high protein dry yeast were evaluated. Six castrate males with initial average weight of 40 kg were fitted with a simple T-cannula in the distal ileum. In the second experiment was determined the digestibility of amino acids in poultry by-products meal, swine by-products meal, a mixture of poultry and swine by-products meal and feather meal. Eight castrate males with initial average weight of 40 kg were fitted with a simple T-cannula in the distal ileum. Both trials were conducted in a randomized design with three treatments and four replications carried out in two experimental periods. The feeds evaluated was the only protein source of diet.. Animals received the meals according to the metabolic weight. The water was given ad libitum. A protein free diet was used to determine the endogenous losses. The digestibility coefficients of amino acids in all tested meals were satisfactory or high. Based on this results the feedstuffs evaluated are good alternatives for the conventional ingredients in the swine formulation diets. Attention must be taken with respect to the adequate level of inclusion of this feeds in the diets. / Dissertação importada do Alexandria

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / La polimerización y agregación del péptido Aβ1-42 son procesos poco dilucidados hasta el momento, sin embargo, están fuertemente relacionados al desarrollo de la Enfermedad de Alzheimer, trastorno neurodegenerativo, causante principal de demencia senil para el cual no existe cura o prevención efectiva hasta nuestros días. Una de las estrategias estudiadas con el fin de prevenir y buscar la cura de esta enfermedad es la de buscar compuestos que inhiban la agregación de Aβ1-42 y consecuentemente la formación de especies tóxicas que causan la muerte neuronal y el desarrollo de la enfermedad. En esta tesis se evaluó la acción inhibidora de la agregación de una serie de 6 derivados dihidropiridínicos (fenil-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH- DHP y 3,4,5-OH-DHP) que difieren en el número y posición de hidroxilos en la molécula que por semejanzas estructurales con otros compuestos encontrados en la literatura se constituyeron en buenos candidatos para este fin. Estos compuestos poseen además las propiedades de ser inhibidores de la generación de radicales libres, inhibidores de canales de calcio y posibles antihipertensivos, constituyéndose en compuestos aún más atractivos, ya que el estrés oxidativo, el desbalance en la homeostasis de calcio y la hipertensión, son también factores desencadenantes de la EA. Mediante las técnicas de Fluorescencia por Interacción con tioflavina-T, Electroforesis en Geles y TEM, los resultados demostraron que los compuestos con uno o ningún grupo hidroxilo (fenil-DHP, 3-OH-DHP y 4-OH-DHP) no son inhibidores de la agregación de Aβ1-42. Sin embargo, los compuestos , 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP y 3,4,5-OH-DHP son inhibidores de la agregación siendo 3,4-OH-DHP el compuesto más eficaz con una inhibición máxima de 88±5% y una IC50 de 5.6±0.1µM siendo significativamente más potente que el resveratrol (IC50=9.8±1.3 µM), compuesto polifenólico usado como control en esta tesis. Los efectos sobre la toxicidad celular inducida por fibras amiloides fueron evaluados, para los compuestos activos, en cultivo primario de hipocampo de ratas E18; observándose que una inhibición en la agregación de Aβ1-42 está relacionada con una inhibición de la muerte celular inducida por fibras amiloides. Por otra parte, en esta tesis se desarrolló un nuevo método electroquímico que permite evaluar el proceso de agregación y desagregación de Aβ1-42 con el fin de complementar, con nueva información, la metodología existente, ya que los métodos convencionales poseen diversas limitaciones y no pueden ser constituidos como un único método válido. Se generaron electrodos de carbón vítreo modificados con nanotubos de carbono y fue posible seguir el proceso de agregación mediante la señal de oxidación del residuo de Tyr en estadios tempranos cuando oligómeros pequeños son formados, revelando información conformacional del extremo N-terminal de la molécula. Además, este nuevo método fue útil para evaluar la desagregación del péptido LPFFD-NH2, conocido desagregante. / Polymerization and aggregation of the Aβ1-42 peptide are not complete elucidated processes until now, however, they are strongly related to the development of Alzheimer's disease, a neurodegenerative disorder, the primary cause of dementia for which no cure or effective prevention exist so far. One of the strategies studied in order to prevent and to find a cure for this disease is to find compounds that inhibit the aggregation of Aβ1-42 and consequently the formation of toxic species that cause neuronal death and disease development. In this thesis, the aggregation inhibitory activity of a series of 6 dihydropyridine derivatives (phenyl-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5- OH-DHP) was evaluated. These compounds differ to each other in the number and position of hydroxyl groups in the molecule and since they have structural similarities with other compounds found in the literature they are constituted in good candidates for this purpose. These compounds also have other characteristics like inhibitors of free radical generation, calcium channel blockers and potential antihypertensive activity that make them more attractive since oxidative stress, the imbalance in calcium homeostasis and hypertension, are also triggers factors of Alzheimer's disease. By mean of Thioflavin-T Fluorescence Assay, Gel Electrophoresis and TEM the results demonstrated that the compounds with one or no hydroxyl group (phenyl-DHP, 3-OH-DHP and 4-OH-DHP) are not inhibitors of Aβ1-42 aggregation. However, the compounds, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5-OH-DHP are inhibitors of the aggregation being 3.4-OH-DHP the inhibitor compound with the highest maximum inhibition of 88 ± 5% and an IC50 of 5.6 ± 0.1μM being significantly more potent than resveratrol (IC50 = 9.8 ± 1.3 µM), a polyphenolic compound used as a control in this thesis. The effects on cellular toxicity induced by amyloid fibrils were evaluated for these compounds in primary cultures of E18 rat hippocampus. It was observed that the inhibition on the aggregation of Aβ1-42 is related to the inhibition of cell death induced by amyloid fibers. On the other hand, in this thesis was developed a new electrochemical method to assess the process of aggregation and disaggregation of Aβ1-42 in order to supplement, with new information, the existing methodology, since conventional methods have several limitations and cannot be constituted as a single valid method. Glassy carbon electrodes modified with carbon nanotube were generated and it was possible to follow up the aggregation process by mean of the oxidation signal of Tyr residue in the early stages when small oligomers are formed, revealing conformational information of the N-terminal part of the molecule. In addition, this new methodology was useful for assessing the disaggregation activity of LPFFD-NH2 peptide, a known disaggregating compound. / Fondecyt

A existência de aminoácidos co-traducionalmente codificados pelo código genético tem estimulado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação nas cadeias polipeptídicas nascentes. Como exemplo, pode-se destacar a via específica de biossíntese do aminoácido selenocisteína, presente em eucariotos e procariotos, cuja incorporação ocorre juntamente ao códon de parada UGA. Em bactérias, a via de biossíntese de Sec é composta pelas proteínas Selenocisteína sintase (SelA), Fator de Elongação Específico (SelB), Selenofosfato sintetase (SelD), Seril-tRNA sintetase (SerRS) e Selenocisteína liase (CsdB). A via de síntese e incorporação de Sec depende também de dois RNAs; um tRNA específico (tRNASec) e uma sequência no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS), sinalizadora para correta incorporação de Sec junto ao códon UGA. Em eucariotos, essa via difere pela presença das proteínas O-fosfoseril-tRNASec Quinase (PSTK) e Selenocisteil-tRNASec sintase (SepSecS), em substituição a SelA, e pela presença de proteínas ligadoras ao elemento SECIS (SBP2). Pelo fato do selênio ter uma citotoxicidade elevada, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNASec. Em 2009, foi proposta a interação entre CsdB e SelD, porém não sendo demonstradaexperimentalmente até o momento. Dessa forma, esse estudo traz pela primeira vez, a caracterização biofísica e estrutural da interação macromolecular entre CsdB e SelD bacterianas, indicando uma elevada afinidade de interação entre elas sob diferentes condições experimentais. Estudos biofísicos mostraram que a interação aumenta a estabilidade térmica e os estudos estruturais resultaram em um modelo em baixa resolução do complexo, indicando uma assimetria para o complexo formado. Além disso, em 2013 nosso grupo anotou uma sequência putativa para uma SBP2 em N. gruberi, ameba não patogênica empregada como modelo para estudos de N. fowleri, conhecida a infectar humanos, resultando na patologia conhecida como Meningoencefalite Amebiana Primária. Deste modo, esse estudo também traz, pela primeira vez, a demonstração experimental da presença de uma SBP2 em N. gruberi Ademais, a interação desta proteína como o elemento SECIS também foi caracterizada através de diversos estudos biofísicos. Demonstrou-se que a NgSBP2 possui alto percentual de regiões de desordem e que ao interagir com o elemento SECIS apresenta enovelamento devido à interação. Dessa forma, este estudo trouxe um avanço no conhecimento das interações moleculares presentes na via de incorporação de selenocisteínas, sendo de grande relevância no entendimento dos determinantes moleculares de interação entre proteína-proteína e proteína-RNA. / The existence of co-translationally encoded amino acids by the genetic code has stimulated studies on the mechanisms of synthesis, recognition, and incorporation into new polypeptide chains. As an example, the selenocysteine (Sec) biosynthesis pathway, present in eukaryotes and prokaryotes, where the amino acid incorporation occurs at the canonical UGA stop-codon. In Bacteria, the Sec biosynthesis pathway is formed by Selenocysteine synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate synthetase (SelD), Seryl-tRNA synthetase (SerRS) and Selenocysteine lyase (CsdB). The synthesis route also needs two RNAs; a specific tRNA (tRNASec) and a sequence in the mRNA (SelenoCysteine Insertion Sequence - SECIS) that encodes for the in-frame UGA Sec incorporation. In eukaryotes, the pathway is distinguished through the presence of O-phosphoseryl-tRNASec kinase (PSTK) and Selenocysteinyl-tRNASec synthase (SepSecS), replacing SelA, also the presence of SECIS binding proteins (SBP2). Once selenium presents high cell toxicity, it is crucial to fully understand the catalytic metabolism and complex formation for the tRNASec incorporation. In 2009, CsdB and SelD interaction was proposed, however, it has not been experimentally demonstrated until now. Thus, this project reports at the first time the biophysical and structural characterization of bacterial CsdB and SelD macromolecular interaction, indicating to a high-affinity interaction between these enzymes for the complex formation. Biophysical assays showed that the complex increased the thermal stability and structural studies showed a low-resolution model also indicating the macromolecule asymmetry. In addition, our research group reported in 2013 the putative SBP2 sequence in N. gruberi, the non-pathogenic amoeba used as a model for studies of N. fowleri, known as human infective, responsible for the pathology known as the Primary Amebic Meningoencephalitis. Moreover, this project also reports, at the first time, the experimental presence of N. gruberi SBP2. The SBP2.SECIS was also characterized by several biophysical methods. NgSBP2 has a high percentage of regions of disorder and access to each element SECIS presents due to interaction. Thus, this study was promoted in advance on the molecular interactions present in the incorporation of selenocysteines, being important for the understanding of the molecular determinants of the interaction between protein-protein and RNA-protein.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-01T08:42:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2627831 bytes, checksum: 2e76f89a095d25b9ff1841a8430eb04b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T08:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2627831 bytes, checksum: 2e76f89a095d25b9ff1841a8430eb04b (MD5) Previous issue date: 2008-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo do trabalho foi sintetizar a hidroxiapatita, para separar a β - lactoglobulina e α - lactoalbumina do soro de leite, obtido da fabricação de queijo Minas, por cromatografia de adsorção em hidroxiapatita. A hidroxiapatita é um fosfato de cálcio pertencente à família de apatitas com fórmula química Ca 10 (PO 4 ) 6 Ca(OH) 2 com grande capacidade de adsorver proteínas. A presença de proteínas de alta qualidade no soro e com diversas aplicações na indústria de alimento, tem sido um fator atraente para a recuperação das mesmas, e ainda, contribuir na redução da poluição ambiental quando o soro é descartado de forma inadequada em mananciais. Os componentes do soro de leite, se isolados, podem ser usados na indústria de alimentos com alto valor agregado, como matéria prima de formulados, podendo também ser empregado nas indústrias de cosméticos, farmacêutica, nas áreas médicas e nutricionais. Foram utilizados três métodos de adsorção diferentes para separação de proteínas: 1) a cromatografia líquida em coluna de hidroxiapatita; 2) a adsorção das proteínas do soro seguido de centrifugação; 3) e a adsorção seguido de filtração a vácuo, buscando técnicas alternativas e de baixo custo para separar os componentes do soro de leite. A cromatografia líquida em coluna foi realizada adicionando o soro de leite em coluna de hidroxiapatita, onde foi aplicado a eluição seqüencial com tampão fosfato de sódio em diferentes concentrações e pH, promovendo a dessorção das proteínas adsorvidas na coluna de hidroxiapatita. A adsorção das proteínas do soro de leite seguido de centrifugação e filtração a vácuo, também foi feito a eluição seqüencial com os mesmos tampões da cromatografia líquida em coluna, porém em processo descontínuo de dessorção. A cromatografia foi a metodologia que apresentou melhor recuperação e separação da α - lactoalbumina que teve um melhor desempenho dinâmico em colunas verticais, sendo eluídas com tampão fosfato de sódio 400 mM, pH 5,0. A adsorção das proteínas seguido de centrifugação apresentou melhor recuperação da β – lactoglobulina quando eluídas no tampão fosfato de sódio 400 mM, pH 6,0 e 7,0. Considerando a recuperação total de proteínas, a cromatografia de adsorção em coluna e adsorção seguida de centrifugação pelas análises estatísticas, apresentaram melhor desempenho na recuperação total das proteínas com valor de 91,0 % de rendimento. A adsorção das proteínas seguido de filtração a vácuo apesar de ter tido boa separação das proteínas, nas condições do experimento, foi a que apresentou menor rendimento na recuperação total das proteínas equivalente a 73,7 %. / The objective of this study was to synthesize hidroxyapatite and to use it to separate β - lactoglobulin and α - lactoalbumin of milk whey through adsorption chromatography. Hidroxyapatite is a calcium phosphate belonging to the family of apatites with a chemical formula Ca 10 (PO 4 ) 6 Ca(OH) 2, with great capacity of proteins adsorption. The presence of high quality proteins in whey and their various applications in food industry has been an attractive aspect for their recovering, besides contributing to reduce the environmental pollution. The isolated whey proteins can be used in the food industry as basic ingredient for formulations because of its high value; moreover, it can be used in cosmetic and pharmacy industries, including medical and nutritional areas. Three different methods of adsorption were used for the separation of the proteins: 1) continuous liquid adsorption chromatography in hidroxyapatite columns; 2) batch adsorption of proteins of whey milk followed by the centrifugation; 3) and batch adsorption followed by vacuum filtration, searching for alternative techniques at a low cost to separate the components of whey. The continuous liquid adsorption chromatography was done by adding the whey in a prepared hidroxyapatite column, where sequential elution with buffer sodium phosphate in different concentrations and pH was applied, causing desorption of the proteins adsorbated in the hidroxyapatite column. In the adsorption of the proteins of whey followed by the centrifugation and vacuum filtration, sequential elution was also done with the same buffers of liquid chromatography in column, however in a discontinuous process of desorption. The continuous adsorption chromatography was the method that best showed the recovering and separation of α – lactoalbumin. This protein had the best dynamic performance in vertical columns, being eluted with 400 mM, pH 5,0 sodium phosphate buffer. The adsorption of proteins followed by centrifugation showed best recovering of β – lactoglobulin when eluted in the 400 mM, pH 6,0 e 7,0 sodium phosphate buffer. Considering the total recuperation of proteins, the adsorption chromatography in columns and the adsorption followed by centrifugation, showed best performance in the recovering of proteins, 91,0 % in the total recovering yield . The adsorption of proteins followed by vacuum filtration, despite having good separation of proteins, under the experimental conditions, showed the least total recovering yield, 73,7 %. / Dissertação antiga.