Foi produzida a proteína recombinante do domínio extracelular da subunidade 2 do receptor do IFN-alfa em forma de proteína de fusão com a glutatione-S-transferase (GST-IFNAR2cEC) em E. coli, com o objetivo de avaliar seu efeito bloqueador sobre a ação do IFN-alfa. A GST-IFNAR2cEC de forma solúvel, com peso molecular 54 kDa, foi obtida quando a proteína recombinante foi expressa a 25 graus C por indução de IPTG e foi lisada por French Press. A avaliação do efeito bloqueador da GST-IFNAR2cEC foi feita utilizando-se 3 métodos: 1) Ensaio antiproliferativo com células Daudi, 2) ensaio antiviral com células Hep 2/c e vírus encefalomiocarditis, e 3) expressão gênica semi-quantitativa do STAT 1 (transdutor de sinal e ativador de transcrição) e da 2',5'-oligoadenilato sintetase (OAS) pela RT-PCR duplex nas células Daudi e Hep 2/c. A GST-IFNAR2cEC, mesmo a 420 nM, não inibiu as atividades antiproliferativa e antiviral de 24,5 pM e 49 pM de rIFN-alfa2 provavelmente devido à sua ineficiência na competição com o IFNAR da superfície celular durante o longo período de incubação nos ensaios realizados. A expressão gênica do STAT 1 não foi inibida pela GST-IFNAR2cEC nas células Daudi e Hep 2/c, porém inibiu-se a da 2’, 5’-OAS. Estes resultados sugerem que a expressão gênica do STAT 1 é independente da ligação do IFN-alfa com a IFNAR 2c, e que a da 2’, 5’-OAS é dependente dessa ligação nessas células

NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli. 2008. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:23:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:42:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_drnepomuceno.pdf: 815376 bytes, checksum: 17de51e5080e91f90b2ad84ac669dbba (MD5) Previous issue date: 2008 / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein. / As lectinas constituem ferramentas biotecnológicas de fundamental importância em estudos histoquímicos e citoquímicos para a detecção de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicações, destacam-se a identificação de receptores de membrana e a detecção de estruturas características de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, já foi utilizada na detecção histoquímica de lesões malignas de mama e tireóide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressão do gene da frutalina em células de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteína através da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estágios de maturação dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqüenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia única, formada pela cadeia beta com 20 resíduos, ligada a um peptídeo de ligação com quatro resíduos, e a cadeia alfa com 133 resíduos. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), após a indução com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios de ligação a carboidratos das moléculas. As mutações nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína.

Foi produzida a proteína recombinante do domínio extracelular da subunidade 2 do receptor do IFN-alfa em forma de proteína de fusão com a glutatione-S-transferase (GST-IFNAR2cEC) em E. coli, com o objetivo de avaliar seu efeito bloqueador sobre a ação do IFN-alfa. A GST-IFNAR2cEC de forma solúvel, com peso molecular 54 kDa, foi obtida quando a proteína recombinante foi expressa a 25 graus C por indução de IPTG e foi lisada por French Press. A avaliação do efeito bloqueador da GST-IFNAR2cEC foi feita utilizando-se 3 métodos: 1) Ensaio antiproliferativo com células Daudi, 2) ensaio antiviral com células Hep 2/c e vírus encefalomiocarditis, e 3) expressão gênica semi-quantitativa do STAT 1 (transdutor de sinal e ativador de transcrição) e da 2',5'-oligoadenilato sintetase (OAS) pela RT-PCR duplex nas células Daudi e Hep 2/c. A GST-IFNAR2cEC, mesmo a 420 nM, não inibiu as atividades antiproliferativa e antiviral de 24,5 pM e 49 pM de rIFN-alfa2 provavelmente devido à sua ineficiência na competição com o IFNAR da superfície celular durante o longo período de incubação nos ensaios realizados. A expressão gênica do STAT 1 não foi inibida pela GST-IFNAR2cEC nas células Daudi e Hep 2/c, porém inibiu-se a da 2’, 5’-OAS. Estes resultados sugerem que a expressão gênica do STAT 1 é independente da ligação do IFN-alfa com a IFNAR 2c, e que a da 2’, 5’-OAS é dependente dessa ligação nessas células

A leptospirose é uma zoonose de distribuição global causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença possui um quadro de manifestações clínicas muito variadas em humanos, que pode apresentar febre, dores de cabeça e muscular, até um quadro clínico mais severo, conhecido como síndrome de Weil, caracterizado por hemorragias, icterícia, falência renal e hepática. Até o presente momento, os mecanismos de patogenicidade da leptospira não são totalmente claros e não existe uma vacina eficaz contra a doença. O sequenciamento de genomas de leptospiras patogênicas possibilitou a identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre cepas patogênicas, que são os principais alvos de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade e possivelmente o desenvolvimento de uma vacina. Nesse sentido, foram selecionados por bioinformática os genes LIC11711 e LIC12587 a partir do genoma sequenciado de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, os quais codificam para duas preditas lipoproteínas hipotéticas de funções desconhecidas. Os genes foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico da bactéria e clonados no vetor de expressão pAE. As proteínas recombinantes foram expressas em E. coli BL21 DE3 Star pLysS e purificadas por cromatografia de afinidade a metal. As proteínas recombinantes foram inoculadas em camundongos para avaliação da sua atividade imunogênica e obtenção de soros imunes. Ambas as proteínas recombinantes se mostraram reativas com anticorpos em soros de pacientes diagnosticados com a doença, apresentando uma sensibilidade maior em relação ao teste de aglutinação microscópica (MAT), e alta especificidade, diferenciando anticorpos presentes em soros de pacientes diagnosticados com outras doenças não relacionadas. Os resultados de ELISA de bactéria intacta, proteólise por proteinase K e imunofluorescência sugerem que ambas as proteínas estão localizadas na membrana externa bactéria. Com base no ensaio de conservação por western blotting, as proteínas nativas estão presentes em diferentes cepas patogênicas de Leptospira, e ausentes na espécie saprófita L. biflexa. Em ensaios de adesão in vitro, as proteínas recombinantes interagiram com os componentes humanos laminina, e-caderina, plasminogênio, fibrinogênio, fibronectina plasmática, vitronectina, C7, C8 e C9 de forma dose-dependentes, porém com valores de afinidade baixos. Estes resultados sugerem que as proteínas codificadas pelos genes LIC11711 e LIC12587 são expressas durante a patogênese e podem desempenhar múltiplas funções a partir da interação com diferentes componentes, e deste modo auxiliam nas etapas de invasão, disseminação e evasão do sistema imune, auxiliando as leptospiras no processo de infecção. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. The disease has a wide range of clinical manifestations in humans, which can present with fever, headaches and muscular pain, to a more severe clinical condition, known as Weil\'s syndrome, characterized by hemorrhages, jaundice, renal and hepatic failure. So far, the pathogenicity mechanisms of leptospira are not entirely clear and there is no effective vaccine against a disease. Sequencing of pathogenic leptospires genomes has enabled the identification of conserved outer membrane proteins among pathogenic strains, which are the main research focus to understand the mechanism of pathogenicity and possibly identify a vaccine candidate. In this sense, the genes LIC11711 and LIC12587 were selected from the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni by bioinformatics, which encode two hypothetical predicted lipoproteins of unknown functions. The genes were amplified by PCR from the genomic DNA of the bacteria and cloned into pAE expression vector. The recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 DE3 Star pLysS and purified by metal affinity chromatography. Recombinant proteins were inoculated in mice to evaluate their immunogenic activity and to obtain immune sera. Both recombinant proteins are reactive with antibodies in sera from patients diagnosed with a disease, presenting higher sensitivity than the microscopic agglutination test (MAT), high specificity, differentiating antibodies present in sera from patients diagnosed with other non-specific diseases related. The results of intact bacterial ELISA, proteinase K proteolysis and Immunofluorescence suggest that both proteins are located in the surface of the bacteria. Based on western blotting conservation assay, the coding sequences are present in different pathogenic strains of Leptospira, and absent in the nom-pathogenic L. biflexa. In in vitro adhesion assays, recombinant proteins showed interaction with the human components laminina, e-cadherin, plasminogen, fibrinogen, plasma fibronectina, vitronectin, C7, C8 and C9, in dose-dependent manner, but with low affinity values. These results suggest that the proteins encoded by the genes LIC11711 and LIC12587 are expressed during the infection and may perform multiple tasks and thus assist in the steps of invasion, dissemination and evasion of the immune system, helping leptospires during the establishment of the disease.

A leptospirose é uma zoonose amplamente disseminada, causada pelo gênero patogênico de Leptospira. Essa doença apresenta grande interesse humano e veterinário, devido aos danos econômicos gerados. Em áreas urbanas, os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença, pois albergam as leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretam vivas na urina. Os humanos podem ser infectados de forma direta ou indireta, através de solo ou água contaminados. Após infecção pode-se apresentar sintomas leves ou mais severos como icterícia e hemorragia. O diagnóstico clínico da leptospirose é dificultoso devido aos sintomas iniciais serem comuns à de outras doenças. As vacinas existentes são baseadas em bactérias inativadas, não conferem proteção duradoura, além de serem específicas para os sorovares presentes na preparação. Atualmente, já foram identificados mais de 250 sorovares diferentes da bactéria, sendo assim, a identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre diferentes espécies e sorovares de Leptospira e que podem interagir com o hospedeiro são os principais alvos de pesquisa para o desenvolvimento de vacinas. Estas proteínas podem induzir uma resposta imune no hospedeiro e são importantes para elucidar os mecanismos de patogenicidade. Deste modo, diversos estudos têm buscado caracterizar e identificar as proteínas de superfície que sejam antigênicas e presentes nos diversos sorovares de Leptospira interrogans. O primeiro passo deste trabalho foi avaliar por programas de bioinformática a localização celular, a presença de sinal de exportação e/ou lipidação, presença de domínios conservados e similaridade com outras sequências. Inicialmente, os genes LIC10562 e LIC13259 foram amplificados por PCR utilizando o DNA da L. interrogans. sorovar Copenhageni e os fragmentos de DNA gerados foram clonados no vetor pGEM T-Easy e subclonados no vetor de expressão pAE e expressas em cepas de Escherichia coli . As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. A proteína recombinante codificada pelo gene LIC10562 apresentou dificuldades durante a purificação. Por esse motivo, os estudos com esse gene foram interrompidos. Por outro lado, a purificação da LIC13259 foi obtida com sucesso. Desse modo, a presença de estrutura secundária da rLIC13259 foi avaliada por dicroísmo circular e sua atividade imunogênica foi analisada após imunização em Camundongos Balb/c. Ensaios de localização celular demonstraram a exposição da proteína na superfície das bactérias, o que corrobora com as análises de bioinformática. Além disso, rLIC13259 foi reconhecida por soro de indivíduos infectados, sugerindo sua expressão durante a infecção. Ensaios de interação com componentes do hospedeiro mostraram que a proteína rLIC13259 foi capaz de se ligar a laminina, plasminogênio, vitronectina, C7, C8 e C9 de maneira dosedependente. Além disso, rLIC13259 foi capaz de recrutar estes componentes direto do soro humano, revelando a importância desta interação. A ligação de rLIC13259 com PLG foi capaz de gerar plasmina, sugerindo que esta proteína pode contribuir nos processos de invasão da bactéria no hospedeiro. A interação da rLIC13259 com os componentes do sistema complemento parece ocorrer via os domínios de heparina. Além disso, o envolvimento da proteína recombinante com C9 foi capaz de inibir a polimerização de C9, consequentemente, inibindo a formação do complexo de ataque à membrana (MAC). Em conjunto, nossos dados sugerem a participação da proteína LIC13259 nos mecanismos de invasão e evasão do sistema imune do hospedeiro. / Leptospirosis is a widely disseminated zoonosis, caused by the pathogenic genus Leptospira. This disease presents great human and veterinary interest due to economic. In urban areas, rodents are the major reservoir of the disease. The leptospires colonize the proximal renal tubules and shedding them live in urine. Humans can be infected directly or indirectly through contaminated soil or water. After the infection, mild or more severe symptoms such as jaundice and bleeding may occur. The clinical diagnosis of leptospirosis is difficult because the initial symptoms are common in other diseases. Existing vaccines are based on inactivated bacteria, do not confer lasting protection, and are serovar specific. Currently, more than 250 different serovars of the bacterium have been identified, therefore, the identification of outer membrane proteins conserved between different species and serovars of Leptospiraand that may interact with the host are the main research targets for the vaccine development. These proteins can serve as targets for the immune system of the host. Thus, several studies have sought to characterize and identify as surface proteins that are antigenic and present in the various serovars of Leptospira interrogans. The first step of this work was to evaluate the cellular localization, presence of export signal and / or lipidation, presence of conserved domains and similarity with other sequences through the bioinformatics programs. Initially, LIC10562 and LIC13259 genes were amplified by PCR using the L. interrogans serovar Copenhageni DNA. The generated DNA fragments were cloned into the pGEM T-Easy vector and subcloned into the pAE expression vector and expressed in strains of Escherichia coli. Recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography. The recombinant protein encoded by the LIC10562 gene presented difficulties during purification. For this reason, study with this gene has been discontinued. On the other hand, the purification of LIC13259 was successfully achieved. The presence of secondary structure of rLIC13259 was assessed by circular dichroism and its immunogenic activity was analyzed after immunization in Balb / c mice. Cell localization assays have demonstrated the exposure of the protein to the surface of the bacteria, which corroborates with bioinformatics analyzes. In addition, rLIC13259 was recognized by sera from infected individuals, suggesting its expression during infection. Interaction with host components showed that the rLIC13259 protein was able to bind laminin, plasminogen, vitronectin, C7, C8 and C9 in a dose-dependent manner. In addition, rLIC13259 was able to recruit these components directly from human serum, revealing the importance of this interaction. The binding of rLIC13259 to PLG was able to generate plasmin, suggesting that this protein may contribute to the invasion processes of the bacterium in the host. The interaction of rLIC13259 with components of the complement system appears to occur via the heparin domains. In addition, the involvement of the recombinant protein with C9 was able to inhibit the polymerization of C9, consequently,inhibiting a formation of the membrane attack complex. Taken together, our data suggest the participation of the LIC13259 protein in the mechanisms of invasion and evasion of the host immune system.

Photorhabdus luminescens MN7 é uma enterobactéria associada a seus simbionte, nematoides da espécie Heterorhabditis baujardi LPP7, coletada em Monte Negro (RO), Brasil. As bactérias do gênero Algumas linhagens de P. luminescens possuem no seu citoplasma dois cristais proteicos compostos das CIPs (Crystal Inclusion Proteins A e B). Na fase estacionária de crescimento esses cristais são até 40% do total de proteínas na célula. Fizemos uma estratégia para clonar e expressar a ORF completa dos genes que codificam CipA, CipB e CipB2 de MN7. Os três genes foram amplificados e subclonados, mas apenas CipA foi expressa em Escherichia coli. A proteína recombinante foi purificada em coluna de Níquel N2+ e utilizada para inóculo em camundongos Balb/c. CipB foi clonada no plasmídeo de expressão, mas não foi expressa quando induzida. CipB2 foi amplificada, mas não foi clonada no plasmídeo de expressão. Também foi amplificado e subclonado o fragmento de miniSOG (mini Singlet Oxygen Generator), para ser ligado aos genes das CIPs que foram clonados para ensaios de fluorescência. / Photorhabdus luminescens MN7 is an enterobacterium associated with its symbiont, nematodes of the Heterorhabditis baujardi LPP7 species, collected in Monte Negro (RO), Brazil. Bacteria of the genus of P. luminescens lineages do not have their cytoplasm two protein crystals composed of CIPs (Crystal Inclusion Proteins A and B). In the stationary phase of growth of the crystals are up to 40% of the total proteins in the cell. We have devised a strategy to clone and express a complete ORF of the genes encoding MN7 CipA, CipB and CipB2. All three genes were amplified and subcloned, but only CipA was expressed in Escherichia coli. The recombinant protein was purified on a Nickel N2+ column and used for inoculum in Balb / c mice. CipB was cloned without expression plasmid, but was not expressed when induced. CipB2 was amplified, but was not cloned without expression plasmid. The miniSOG (mini Singel Oxygen Generator) fragment was also amplified and subcloned to be linked to the genes of the CIPs that were so cloned for fluorescence assays.

A papilomatose bovina é uma doença infectocontagiosa de ocorrência mundial, que assola o rebanho brasileiro, sem qualquer atitude efetiva de controle, e que tem como enfermidades associadas a tumores de bexiga hematúria enzoótica e tumores de trato digestório superior caraguatá, responsáveis por sensíveis perdas para a pecuária. Várias tentativas vacinais têm sido empreendidas com finalidades profiláticas ou terapêuticas, porém sem resultados eficazes. Esta situação se deve a aspectos relacionados à estrutura viral que dificultam uma manipulação eficiente para produção de produtos vacinais. Para que tais dados possam ser obtidos, faz-se necessário uma melhor compreensão da ação das proteínas recombinantes. A clonagem em vetores bacterianos para a expressão e purificação dessas proteínas serve a diferentes propósitos. Entre eles, a produção de insumos imunológicos, como testes diagnósticos ou mesmo vacinas. O presente projeto visou à expressão e purificação da proteína de capsídeo recombinante L2 de BPV-2. A proteína foi expressa em bactéria e tentou-se a purificação por coluna de afinidade; entretanto, problemas na purificação não possibilitaram a conclusão deste objetivo. Todas as abordagens e protocolos utilizados nesse trabalho são discutidos para contribuição ao conhecimento do processo. / The bovine papillomatosis is an infectious disease of worldwide occurrence, plaguing the Brazilian herd, without any effective attitude control, and whose illnesses associated with bladder tumors \"enzootic hematuria\" and upper digestive tract tumors \"caraguatá\" sensitive responsible for losses to livestock. Several attempts have been undertaken vaccine with prophylactic or therapeutic purposes, but without effective results. This is due to issues related to viral structure that hinder efficient manipulation for production of vaccine products. In order to obtain such information, it is necessary better understanding of the action of recombinant proteins. The bacterial cloning vectors for the expression and purification of such proteins serve different purposes. Among them, the production of immune inputs, such as diagnostic tests or vaccines. This project aimed the expression and purification of recombinant L2 capsid protein of BPV-2. The protein was expressed in bacteria and purification was carried out by affinity column. However, difficulties in the purification process, impaired the full completion of this objective. All the attempted approaches and protocols were discussed and potential solutions proposed.

A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-09T14:09:38Z No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T14:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 / Equine Infectious Anemia (EIA) is caused by a lentivirus of the family Retroviridae and is considered one of the most important viruses in horses in the world. It is a chronic infection, untreated, prevalent in hot and humid climate regions favorable to transmission by hematophagous insects. The official diagnosis of the disease is made through the detection of circulating antibodies in the IDGA and ELISA tests. In order to increase protein yield and improve the performance of serological tests, the p26 gene sequence was optimized for preferred codons for use in E. coli and fused to maltose binding protein. The resulting recombinant fusion protein (p26rec) was detected by SDS-PAGE and Western blot with anti- HIS monoclonal antibody and used as an antigen in the development and evaluation to evaluate an IDGA and an ELISA (IDGArec and ELISArec) for the diagnosis of EIA. After analysis of 569 equine sera, diagnostic sensitivity (SeD) and diagnostic specificity (SpD) were determined. The cutoff point for ELISArec (> 29.51%) was determined by the ROC curve analysis. For IDGArec both SeD and SpD were 100% and for ELISArec were 100% and 99.6% respectively. The p26rec has been maintained with stable working dilutions for more than three years stored at 4 ° C. The results demonstrated the high degree of confidence obtained with p26rec in the IDGArec and ELISArec tests and could therefore be recommended in the serological diagnosis of the AIE. / A Anemia Infecciosa Equina (AIE) é causada por um lentivírus da família Retroviridae e é considerada uma das viroses mais importantes em equinos no mundo. É uma infecção crônica, sem tratamento, prevalente em regiões de clima quente e úmido favorável à transmissão por insetos hematófagos. O diagnóstico oficial da doença é realizado através da detecção de anticorpos circulantes nos testes IDGA e ELISA. Visando aumentar a produção proteica e melhorar o desempenho dos testes sorológicos, a sequência do gene p26 foi otimizada com relação aos códons preferenciais para uso em E. coli e fusionada à proteína ligante de maltose com rendimento 2mg/ml de cultura celular. A proteína de fusão recombinante resultante (p26rec) foi detectada por SDS- PAGE e Western blot com anticorpo monoclonal anti-HIS. A p26rec do VAIE foi utilizada como antígeno no desenvolvimento e avaliação por IDGA e ELISA (IDGArec e ELISArec). Após a análise de 569 soros de equinos, foi determinada a sensibilidade diagnóstica (SeD) e a especificidade diagnóstica (SpD). O ponto de corte para o ELISArec (>29.51%) foi determinado pela análise da curva ROC. Para o IDGArec ambos a SeD e a SpD foram de 100% e para o ELISArec foram de 100% e 99,6% respectivamente. A p26rec vem se mantendo com título estável há mais de três anos armazenada a 4°C. Os resultados encontrados mostram o alto grau de confiança obtido com a p26rec nos testes IDGArec e ELISArec, podendo assim ser recomendados no diagnóstico sorológico da AIE.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-05T15:16:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Alana Batista Fernandes.pdf: 1845250 bytes, checksum: 5a81b4935b1849b58c0184317d0b69cf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-05T15:17:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Alana Batista Fernandes.pdf: 1845250 bytes, checksum: 5a81b4935b1849b58c0184317d0b69cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T15:17:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Alana Batista Fernandes.pdf: 1845250 bytes, checksum: 5a81b4935b1849b58c0184317d0b69cf (MD5) Previous issue date: 2016-04-19 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Chikungunya virus (CHIKV) is an RNA virus (family Togaviridae, genus Alphavirus) transmitted to humans through the bite of female mosquitoes Aedes aegypti and Aedes albopictus. The clinical onset in CHIKV infection is most often characterized by fever and joint pain, and so far there is no specific antiviral therapy or vaccine for the treatment of the infection. The diagnosis of CHIKV infection is based on clinical and laboratory findings, with the latter being performed by virus isolation, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), serology, and rapid tests: To produce a recombinant antigen through the cloning and expression of the capsid protein (C) of CHIKV in order to detect anti-CHIKV antibodies in human serum samples by immunoenzymatic assay. A synthetic gene (gBlock), specifically designed for this study, corresponding to the protein C (400 base pair) of Chikungunya virus, was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then cloned into pGEM-T Easy system-Escherichia coli. The transformant clones were sequenced, and recombinant products were digested using the restriction endonucleases EcoRI and BamHI, and then subcloned and expressed in the vector pET-23a+ Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant protein C expression and the molecular weight were determined by SDS-PAGE and Dot Blot and purified by affinity chromatography using nickel column. A immunoenzymatic assay was performed using the recombinant antigen to detect IgM and IgG antibodies in sera from patients with CHIKV infection confirmed by the National Reference Laboratory of the Ministry of Health, as well as sera from patients tested positive for Mayaro virus, Dengue virus and Cytomegalovirus infection. The derived recombinant protein showed size and antigenicity compatible with the native protein C from the CHIKV; a concentration of 0.342 ng/mL of recombinant protein C was obtained using the pET-23a+ E. coli BL21 (DE3); the affinity chromatography using nickel column was effective to obtain the soluble protein C, confirmed by the Bradford method; the immunoenzymatic assay using the recombinant antigen showed cross-reactivity to others Alphavirus pathogens. The results indicate that the expression system pET-23a+ E. coli BL21 (DE3) was effective to produce the recombinant protein C of CHIKV, however the antigen was not sensitive enough to detect only the CHIKV infection. / O vírus Chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA (família Togaviridae, gênero Alphavirus), transmitido aos seres humanos através da picada de mosquitos fêmeas de Aedes aegypti e Aedes albopictus. O início das manifestações clínicas da infecção por CHIKV na maioria das vezes é caracterizada por febre e dor nas articulações, e até agora não existe uma terapia antiviral específico ou vacina para o tratamento da infecção. O diagnóstico da infecção CHIKV é baseado em achados clínicos e laboratoriais, com o último sendo realizada por isolamento do vírus, transcrição reversa-polimerase reação em cadeia (RT-PCR), sorologia e testes rápidos. Para produzir um antígeno recombinante através da clonagem e expressão da proteína do capsídeo (C) de CHIKV de modo a detectar anticorpos anti-CHIKV em amostras de soro humano, por ensaio imunoenzimático. Um gene sintético (gBlock), especificamente concebidos para esse estudo, correspondente à proteína C do capsídeo (400 pares de bases) do vírus Chikungunya, foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e, em seguida, clonado em pGEM-T Easy sistema de Escherichia coli. Os clones transformantes foram sequenciados, e os produtos recombinantes foram digeridos com as endonucleases de restrição EcoRI e BamHI, e depois subclonado e expresso no vector pET-23a+ e Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína C recombinante e o peso molecular foram determinados por SDS-PAGE e Dot Blot e purificado por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de níquel. Um ensaio imunoenzimático foi realizada utilizando o antígeno recombinante para detecção de anticorpos IgM e IgG em soros de pacientes com infecção CHIKV confirmados pelo laboratório nacional de referência do Ministério da Saúde, bem como soros de pacientes positivos para o vírus Mayaro, vírus da dengue e citomegalovírus infecção. O derivado da proteína recombinante mostrou tamanho e antigenicidade compatível com a proteína C nativa do CHIKV; uma concentração de 0,342 ng / mL de proteína C recombinante foi obtido utilizando o pET-23a+ de E. coli BL21 (DE3); a cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de níquel foi eficaz para obter a proteína C solúvel, confirmada pelo método de Bradford; o ensaio imunoenzimático utilizando o antígeno recombinante mostrou reatividade cruzada com outros agentes patogénicos de Aphavírus. Os resultados indicam que o sistema de expressão pET-23a+ de E. coli BL21 (DE3) foi eficaz para produzir a proteína C recombinante de CHIKV, no entanto, o antígeno não foi suficientemente sensível para detectar apenas a infecção CHIKV.