Orientador: Maria Angela de Almeida Petenate / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T13:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pellegrino_AngelaMariaQueiroz_M.pdf: 4545249 bytes, checksum: eafe47c24edfcb2e657e29390328886c (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: A cinética da floculação das proteínas e sólidos do soro de queijo foi estudada em reator de batelada. Amido de milho orto-fosfatado (grau de substituição~0,1) foi usado como agente précipitante para estudos da influência do pH e concentração de dispersões de amido na recuperação de proteína do soro de queijo, especialmente a-lactoglobulina e ß-lactoalbumina. Amidos de fontes naturais, tais como amido de mandioca, amido de milho puro (Maizena) e, também, amidos de milho fosfatados, como ortofosfatado monosó-dico (grau de substituição ~ 0,1) e tripolifosfatado (grau de substituição ~ 0,01) foram empregados para estudo de suas eficiências na recuperação de proteínas e remoção de sólidos da solução. As experiências foram conduzidas em um reator especialmente construído para manter condições de mistura uniforme. Experimentos de filtração foram feitos para que se tives¬se melhor idéia do tamanho da partícula amido-proteína formada durante o processo de floculação e, também, dos mecanismos que promo¬vem a agregação dos dois polímeros. Dos resultados obtidos concluiu-se que as condições ótimas de precipitação das proteínas do soro de'queijo se dão a um pH em torno de 2,0 e a uma concentração da dispersão de amido de milho ortofosfatado monosódico de 5,0 g/l. A agregação das partículas mostrou um caráter fortemente iônico com contribuição, na etapa de crescimento, dos mecanismos de adsorção e formação de pontes. A solubilidade do agente précipitante, seu poder de gelatinização e grau de fosfatação influíram de maneira significativa na floculaçâo das proteínas e sólidos do soro de queijo / Abstract: The kinetics of flocculation of proteins and solids from whey was studied in a stirred batch reactor. Orthophosphated corn starch (degree of substitution ~0,1) was taken as a precipitant agent-to investigate the influences of pH and concentration of starch in the reactor for the whey proteins recovery, specially ß-lactoglobulin and a-lactalbumin. Starches from other -natural sources such as tapioca starch, corn starch and also other phosphated corn starches like orthophosphated ( degree of substitution ~ 0,1) and tripolyphosphated (degree of substitution 0,01) were used in the analysis of their efficiency in the recovery of proteins and solids removal from the solution. The experiments were carried out in a reactor built to keep uniform mixing conditions. Filtration experiments were performed in order to get an insight of the size of the protein-starch particle formed during the flocculation process, and of the particle aggregation mechanism. From the data obtained we could conclude that the optimum conditions for protein precipitation occur at a pH around 2,0 and at a concentration of starch dispersion equal to 5,0 g/1. The particle aggregation was shown to have a strong ionic characteristic with a contribution of the adsorption and bridging mechanisms. The solubility of the precipitant agent, its degree of gelatinization and phosphorus contents influence in a significant way the flocculation of whey proteins and solids / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientadores: João Santana da Silva, Antonio Campos Neto / Resumo: As duas lectinas presentes em sementes de A. intergrifolia foram obtidas por cromatografia de afinidade. Uma é a lectina não mitogênica Jacalina, ligante de D galactose; e a outra é a lectina mitogênica Artocarpina que possue especificidade para resíduos manosídeos. Essas duas lectinas foram utilizadas para se estudar o perfil de citocinas produzidas por células esplênicas murinas quando estimuladas por lectinas com distintas especificidade para carboidratos. Os resultados mostraram que a F. Arto é capaz de estimular a síntese de IL-2, IL-4, TNF e IFN-?. Esta lectina não foi no entanto capaz de induzir a síntese de TGF-ß. Em contraste a Jacalina induziu altos níveis de TGF-ß, baixos níveis de TNF mas não induziu a secreção de IL-2, IL-4 e IFN-?. As citocinas IL-3/GM-CSF e IL-6 foram estimuladas igualmente por ambas lectinas. Estes resultados sugerem por conseguinte que: as sínteses de TNF, IL-3/GM-CSF e IL-6 estão associadas aos resíduos glicídicos de D manose ou D-galactose; as sínteses de IL-2, IL-4, IFN-? estão associados ao resíduo de D-manose e a síntese de TGF- ß está associada ao resíduo de D-galactose / Abstract: In the present thesis we investigated the pattem of cytokine secretion by murine spleen cells after the stimulation with two lectins specific for distinct carbohydrates. The lectins Jacalin and Artocarpin, specific for D-galactose and D-mannose respectively were obtained from the seeds of Artocarpus integrifolia by affnity chromatography and were used in these studies. Both lectins bind to murine spleen cells but the fate of this binding is different. The binding to the D-mannose containing cell surface molecules caused the spleen cells to proliferate. In contrast the cell activation via D-galactose containing cell surface molecules did not induce the spleen cells to proliferate. Consistent with these results was the pattern of cytokine secreted by the spleen cells. Thus, the activation of the spleen cells with F. Artocarpin caused the secretion of IL 2, IL 4, IFN-? and TNF. However the binding of F.Artocarpin to the spleen cells did not induce the secretion of TGF-ß. In contrast the activation of the spleen cells via the D-galactose cell surface molecules, induced by Jacalin, resulted in large production of TGF-ß, little production of TNF and no secretion of IL 2, IL 4 and IFN-?. The secretion of IL3/GM-CSF and IL 6 was equally induced by the binding of the lectins to either D-mannose or D-galactose containing cell surface molecules / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biolgia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:42:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_Maristela_M.pdf: 2676142 bytes, checksum: 8c382e538652cd9b31d0d9a814dc35b7 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Mestre em Imunologia

Orientador: Augusto Ducati Luchessi / Banca: Alice Cristina Rodrigues / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) caracteriza-se por ser a única proteína conhecida que apresenta o aminoácido hipusina, formado a partir de uma modificação pós-traducional chamada hipusinação. Apesar de originalmente eIF5A ter sido denominado como fator de início de tradução, a função de eIF5A têm sido relacionada principalmente com a etapa de elongação da tradução. Desde 2013, trabalhos importantes apresentaram evidências de que eIF5A hipusinado possui um papel fundamental na tradução de mRNAs específicos de proteínas que contém consecutivos resíduos de aminoácidos prolina (PPP ou PPG). Tendo em vista estas informações, o objetivo principal deste trabalho consiste no estudo da dependência de eIF5A na tradução da proteína ribosomal S6 kinase 2 (S6K2), pois a mesma apresenta em sua extremidade C-terminal uma região contendo cinco resíduos consecutivos de prolinas. Neste contexto, por meio da produção de uma proteína mutante (S6K2∆Pro), substituindo a região de poli-prolina de S6K2 pela sequência correspondente da proteína homóloga ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), foram avaliadas a produção e habilidade fosforilativa da proteína mutante em comparação com S6K2 selvagem. Observou-se que S6K2ΔPro é produzida e sua superexpressão aumenta o conteúdo da proteína ribossomal S6 fosforilada, principal alvo de fosforilação das proteínas S6Ks, assim como a superexpressão das proteínas S6K1 e S6K2. Análises de silenciamento gênico em células HeLa, utilizando moléculas de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A), which is highly conserved among eukaryotes, contain the unusual amino acid hypusine, synthesized by a posttranslational modification called hypusination. Even though eIF5A was first denominated as an initiation factor, it has been related to elongation step of the translation process. Since 2013, many studies proposed that eIF5A acts on rescue the ribosome stalling promoted by synthesis of poly-proline motifs containing PPP or PPG sequences. The aim of this study is to evaluate the eIF5A dependence on Ribosomal S6 kinase 2 protein (S6K2) translation, once S6K2 contains a poly-proline stretch on its C-terminus with five consecutive prolines (PPPPP). By producing a mutant protein (S6K2Pro), replacing the polyproline motif on S6K2 for the same region found on homologous protein Ribosomal S6 kinase 1 (S6K1), the content and phosphorylation activity were evaluated. It was observed that S6K2ΔPro is produced by HeLa cells and its RPS6 phosphorylation ability, which is the mainly target of S6Ks phosphorylation, is maintained. Analyzes using siRNA molecules for eIF5A gene silencing in HeLa cells have shown that the endogenous S6K2 protein does not have its content altered as a function of the depletion of the eIF5A content, under the conditions evaluated. Furthermore, by regulating the TIF51A gene expression (homologous of the human EIF5A gene) in Saccharomyces cerevisiae it was observed that the translation of S6K2 was only sli... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-24T17:32:02Z No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T17:32:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) Previous issue date: 2016-09-06 / CAPES / As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania da família Trypanosomatidae. Tais enfermidades atingem populações pobres de países subdesenvolvidos e sua incidência está associada, em parte, à ausência de quimioterápicos efetivos, o que enfatiza a importância de estudos focados na biologia desses patógenos. Nos tripanossomatídeos o controle da expressão gênica ocorre, predominantemente, a nível pós-transcricional, envolvendo a regulação da síntese proteica através dos fatores de iniciação da tradução eucarióticos (eIFs). Em mamíferos, a regulação global da tradução ocorre majoritariamente através do complexo heterotrimérico eIF2 (constituído de eIF2α, eIF2β e eIF2γ), o qual é responsável pela interação com o tRNA iniciador, GTP e a subunidade ribossomal 40S. No presente trabalho, objetivou-se contribuir na caracterização do complexo eIF2 em L infantum. Inicialmente, confirmou-se a expressão constitutiva da subunidade eIF2α durante o crescimento e diferenciação do parasito, bem como, sua associação funcional com a subunidade menor ribossomal. Mais ainda, demonstrou-se sua associação com as subunidades eIF2β e eIF2γ e com os parceiros diretos eIF2B e eIF5, nesse momento confirmando a identificação do complexo eIF2B em Leishmania. Nos tripanossomatídeos, a subunidade eIF2α apresenta uma extensão N-terminal característica, a qual se mostrou importante nas interações com eIF2B, eIF5 e ribonucleoproteínas. Interessantemente, identificou-se um novo parálogo da subunidade eIF2γ, sendo denominado aqui eIF2γ-2. Evolutivamente, o eIF2γ-2 surgiu após provável evento de duplicação exclusivo na família Trypanosomatidae e derivou acumulando características singulares em sua sequência gênica. O eIF2γ-2 é capaz de interagir com eIF2α, eIF2β, na formação de um segundo complexo eIF2 exclusivo de tripanossomatídeos, assim como, com o eIF2B e eIF5. Através de ensaios de deleção e complementação gênica, confirmou-se a essencialidade de eIF2γ e se demonstrou a incapacidade de substituição deste pelo seu parálogo eIF2γ-2. Estes resultados demonstram novos aspectos inéditos na identificação e função do eIF2 dos tripanossomatídeos, não observados em outros organismos. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa from the genus Leishmania of the Trypanosomatidae family. These diseases affect poor people in developing countries and its incidence is associated, in part, to the absence of effective chemotherapy, which emphasizes the importance of studies focused on the biology of these pathogens. In trypanosomatids the control of gene expression occurs predominantly at post-transcriptional level involving the regulation of protein synthesis through the eukaryotic initiation factors (eIFs). In mammals, the global translation regulation is mostly controlled by the heterotrimeric complex eIF2 (formed by eIF2α, eIF2β and eIF2γ), which is responsible for the interaction with the initiator tRNA, GTP and 40S ribosomal subunit. In the present study, by characterizing the eIF2 complex in L infantum, we confirmed the constitutive expression of the eIF2α subunit during the growth and differentiation of the parasite, as well as, their functional association with the minor ribosomal subunit. Furthermore, while demonstrating the association of eIF2α with eIF2β and eIF2γ subunits and with the direct partners eIF2B and eIF5, we confirmed the identification of Leishmania eIF2B complex. Herein, we also showed that eIF2α subunit in trypanosomatids has a unique N-terminal extension that is important for interaction with eIF2B, eIF5 and ribonucleoproteins. Interestingly, a paralog of eIF2γ subunit, named here eIF2γ-2, was identified for the first time. Evolutionarily, the eIF2γ-2 gene arose most likely after a duplication event in the Trypanosomatidae family and further accumulated singular characteristics in its coding sequence. The eIF2γ-2 is able to interact with eIF2α and eIF2β, acting during the formation of a second eIF2 complex exclusive to trypanosomatids, as well as with eIF2B and eIF5. By gene deletion and complementation assays, we confirmed the essentiality of eIF2γ and demonstrated the inability to replace it by eIF2γ-2. Altogether, our data demonstrate novel features of eIF2 function of trypanosomes, not seen in other organisms.

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Co-orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Otavio Henrique Thiemann / Banca: Rafael Victorio Carvalho Guido / Banca: Mario Henrique Bengtson / Resumo: eIF5A é uma proteína altamente conservada entre arqueas e eucariotos e apresenta uma modificação pós-­‐traducional única e essencial para sua função, chamada de hipusinação. eIF5A foi inicialmente identificado como um fator de início de tradução (eukaryotic translation Initiation Factor 5A) porém foi demonstrado que eIF5A atua na elongação da tradução. Recentemente foi demonstrado que eIF5A seja mais importante na tradução específica de proteínas contendo resíduos consecutivos de prolina. No intuito de aprofundar o conhecimento da participação de eIF5A no processo de tradução, o presente trabalho de doutorado estudou a relação funcional entre eIF5A e o tRNA de alanina (tRNAAla), revelada como uma interação genética em Saccharomyces cerevisiae, assim como avaliou a relação de eIF5A com eventos da síntese proteica como Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF), misincorporation e readthrough, utilizando repórteres de duas luciferases. Primeiramente, foi analisada a especificidade alélica da supressão em alto número de cópias ocasionada por tRNAAla e a capacidade de tRNAs para outros aminoácidos suprimirem o fenótipo de crescimento de mutantes de eIF5A, e os resultados mostraram que esta supressão não se dá de maneira alelo específica e curiosamente, dentre os outros tRNAs testados, apenas o tRNAiMet é capaz de suprimir o fenótipo de crescimento do mutante tif51AK56A de eIF5A. A supressão observada por estes tRNAs não reflete na melhora do defeito no perfil polissomal, para ambos os casos. Foi testada também a interação física direta entre eIF5A e o tRNAAla, utilizando o sistema de triplo-­‐híbrido, no entanto, nenhuma interação foi detectada, sugerindo que a interação observada entre eIF5A e o tRNA em complexo com 80S seja dependente do ribossomo. Os experimentos de Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF) revelaram um aumento na taxa de PRF para... / Abstract: eIF5A is highly conserved between archaea and eukaryotes and has a unique and essential postranslational modification, called hypusination. eIF5A was initially described as a translation initiation factor (eukaryotic Initiation Factor 5A) but it was shown that eIF5A engaged in translation elongation. Recently findings demonstrated that eIF5A is most important for specific translation of proteins containing consecutive proline residues. In order to deepen the knowledge of function of eIF5A during the translation process, this research studied the functional correlation between eIF5A and the alanine tRNA (tRNAAla), revealed as a genetic interaction in Saccharomyces cerevisiae, and also evaluated the effect of eIF5A in events of protein synthesis as Programmed Ribosomal frameshifting (PRF), misincorporation and readthrough using dual luciferase reporters. First, the allele specificity of the high copy suppression caused by tRNAAla and the ability of tRNAs for other amino acids to suppress the growth of eIF5A mutants were analyzed, and the results showed that this deletion does not occur in an allele specific manner and interestingly, among other tRNAs tested, only tRNAiMet is able to suppress the growth phenotype of the eIF5A mutant tif51AK56A. The suppression induced by these tRNAs does not reflect in improvement of the mutant defect in polysomal profile, for both cases. It was also tested direct physical interaction between eIF5A and tRNAAla using three-­‐hybrid system, however, no interaction was detected, suggesting that the interaction observed between eIF5A and tRNA in the 80S complex is dependent on the ribosome. The Programmed Ribosomal frameshifting (PRF) experiments showed an increase in PRF numbers for the signals of the virus LA and HIV-­‐1 in eIF5A mutant strains, demonstrating that eIF5A function interferes with mRNA recoding events. Furthermore, the same mutants showed an increase... / Doutor

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Co-orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Valéria Valete / Banca: Rafael Victorio Carvalho Guido / Banca: Érico Tosoni Costa / Resumo: eIF5A é a única proteína conhecida que contém o resíduo do aminoácido incomum hipusina (hidroxiputrescina-lisina). Este resíduo de hipusina é essencial para a função de eIF5A e é formado pela modificação de um resíduo específico de lisina em uma reação póstraducional, dependente da poliamina espermidina. A modificação no resíduo de lisina para a formação da hipusina é chamada de hipusinação, que ocorre em duas etapas: primeiramente, a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) transfere o radical 4-aminobutil proveniente da espermidina para um resíduo específico de lisina em eIF5A (posição 50 em mamíferos); em seguida, este é hidroxilado pela desoxi-hipusina hidroxilase (DOHH). Muitos autores têm demonstrado que a inibição da hipusinação pelo inibidor de DHPS GC7 ou o silenciamento de eIF5A leva à inibição da proliferação celular em vários tipos de células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais, e também induzem um efeito anti-inflamatório, evidenciado em modelo murino de diabetes e sepse. Este trabalho buscou utilizar a linhagem transformada de macrófagos RAW 264.7 para entender melhor os mecanismos pelos quais GC7 possui sua atividade. De forma complementar, foi também testado o efeito de GC7 em macrófagos de cultura primária e também em ratos. Como esperado, demonstramos aqui que GC7 inibe de maneira importante a hipusinação em linhagem RAW 264.7 e que, no entanto, este tratamento com GC7 não compromete a viabilidade celular nem altera significativamente o proteoma de células RAW 264.7. Por outro lado, GC7 inibe a produção e liberação da citocina pró-inflamatória TNF-α sem alterar os níveis de mRNA desta citocina, indicando uma modulação pós-transcricional, mais provavelmente no nível traducional, dada a função de eIF5A no processo de síntese proteica. De forma bastante interessante, este efeito de inibição na liberação de TNF-α... / Abstract: eIF5A is the only known protein containing the unusual amino acid residue hypusine (hydroxiputrescine-lysine). This hypusine residue is essential for eIF5A function and it is formed by modifying a specific lysine residue in a posttranslational reaction dependent on the polyamine spermidine. The modification of the lysine residue for the formation of hypusine is called hypusination, which occurs in two steps: first, the enzyme deoxyhypusine-synthase (DHPS) transfers the 4-aminobutyl moiety from spermidine to a specific lysine residue in eIF5A (position 50 in mammals); then it is hydroxylated by deoxyhypusine-hydroxylase (DOHH). Many authors have demonstrated that inhibition of hypusination by the DHPS inhibitor GC7 or silencing eIF5A leads to inhibition of cell proliferation in several types of mammalian cells, including tumor cell lines, and also induce an anti-inflammatory effect, as evidenced in a murine model of diabetes and sepsis. This study aimed to use the macrophage cell line RAW 264.7 to better understand the mechanisms by which GC7 has its activity. Complementarily, its was also tested the effect of GC7 in primary culture of macrophages and in rats. As expected, we show here that GC7 inhibits hypusination in RAW 264.7 cells and, on the other hand, this treatment with GC7 does not compromise cell viability nor significantly alter the proteome of RAW 264.7 cells. Moreover, GC7 inhibits the production and release of TNF-α without affecting mRNA levels of this cytokine, indicating a posttranscriptional modulation, most probably at the translational level, given the eIF5A function in the process of protein synthesis. Interestingly, this inhibitory effect on TNF-α release was also observed in primary cultures of macrophages and in vivo in rats. It was also examined the GC7 ability to inhibit cell proliferation of RAW 264.7 cells, which occurs prior to the S phase of the cell cycle and does not... / Doutor

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Coorientadora: Tatiana Maria de Souza Moreira / Banca: Alexandra Ivo de Mendeiros / Banca: Geisiany Maria de Queiroz-Fernandes / Resumo: O fator de tradução de eucariotos eIF5A é descrito como a única proteína que apresenta o aminoácido hipusina, o qual é gerado por uma modificação pós-traducional essencial para a proliferação celular em todos os eucariotos estudados até o momento, sendo que a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) é responsável pela primeira etapa da formação desse aminoácido em eIF5A. Portanto, a inibição de DHPS também impede a modificação de eIF5A, tornando esta proteína não funcional, o que pode ter aplicação no tratamento dos tipos de câncer em que o fator está envolvido. Embora N1-guanil-1,7-diamino-heptano (GC7) seja potente inibidor da enzima DHPS, foram observados outros efeitos na célula devido à atuação do composto em alvos não específicos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo a busca por novos inibidores de DHPS, com baixa citotoxicidade e que reduzam a proliferação celular ou que inibam o crescimento de micro-organismos eucarióticos patogênicos, como algumas espécies de fungos. Primeiramente, foi avaliada a citotoxicidade de diferentes compostos com núcleo guanidínico frente a macrófagos murinos. Entre os compostos testados, aqueles que apresentaram menor citotoxicidade foram o composto GC7 e os compostos de núcleo guanidínico com um grupo fenil substituído em para por uma metila e outro por um flúor. A partir deste resultado, os compostos foram submetidos à avaliação de sua atividade antiproliferativa frente às mesmas células. GC7 promoveu inibição da proliferação c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Eukaryotic translation factor eIF5A is described as the only protein that presents the amino acid hypusine that is generated by a post-translational modification, which is essential for cell proliferation in all the eukaryotes studied to date. The enzyme deoxyhypusine synthase (DHPS) is responsible for the first stage of formation of this amino acid in eIF5A. Therefore, the inhibition of DHPS also prevents the modification of the eIF5A, making this protein non-functional, which may have application in the treatment of cancer kinds in which this factor is involved. Although N1-guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7) is a strong inhibitor of the DHPS enzyme, other effects on the cell were observed due to the acting of the compound on non-specific targets. Thus, the present work aims to search for new DHPS inhibitors, with low cytotoxicity and able to reduce cell proliferation or inhibit the growth of pathogenic eukaryotic microorganisms such as some fungal species. Firstly, the cytotoxicity of different compounds with guanidinic nucleus against murine macrophages was evaluated. Among the compounds tested, those that showed the lowest cytotoxicity were the GC7 compound and the guanidine core compounds with a phenyl group substituted in para for one methyl and another with fluorine. From these data, the antiproliferative activity of the compounds towards the same cells was evaluated. GC7 promoted inhibition of proliferation as already described in the literature, but the compounds tested... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by ALEXANDRA DANIELA BARRIOS EGUILUZ (alexandra_be88@hotmail.com) on 2018-04-26T15:34:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Alexandra Daniela Barrios Eguiluz.pdf: 2081089 bytes, checksum: 486c23815d757cd635ac788df1396c47 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-05-02T19:02:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eguiluz_adb_me_araiq_int.pdf: 2011000 bytes, checksum: becbe4b2b7cc79b7be570531023dc459 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-02T19:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eguiluz_adb_me_araiq_int.pdf: 2011000 bytes, checksum: becbe4b2b7cc79b7be570531023dc459 (MD5) Previous issue date: 2018-04-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O fator de tradução de eucariotos eIF5A é descrito como a única proteína que apresenta o aminoácido hipusina, o qual é gerado por uma modificação pós-traducional essencial para a proliferação celular em todos os eucariotos estudados até o momento, sendo que a enzima desoxi-hipusina sintase (DHPS) é responsável pela primeira etapa da formação desse aminoácido em eIF5A. Portanto, a inibição de DHPS também impede a modificação de eIF5A, tornando esta proteína não funcional, o que pode ter aplicação no tratamento dos tipos de câncer em que o fator está envolvido. Embora N1-guanil-1,7-diamino-heptano (GC7) seja potente inibidor da enzima DHPS, foram observados outros efeitos na célula devido à atuação do composto em alvos não específicos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo a busca por novos inibidores de DHPS, com baixa citotoxicidade e que reduzam a proliferação celular ou que inibam o crescimento de micro-organismos eucarióticos patogênicos, como algumas espécies de fungos. Primeiramente, foi avaliada a citotoxicidade de diferentes compostos com núcleo guanidínico frente a macrófagos murinos. Entre os compostos testados, aqueles que apresentaram menor citotoxicidade foram o composto GC7 e os compostos de núcleo guanidínico com um grupo fenil substituído em para por uma metila e outro por um flúor. A partir deste resultado, os compostos foram submetidos à avaliação de sua atividade antiproliferativa frente às mesmas células. GC7 promoveu inibição da proliferação como já descrito na literatura, mas os compostos testados não tiveram efeito na proliferação. Por meio de avaliação in vitro da inibição direta sobre a enzima DHPS, os compostos de núcleo guanidínico com um grupo fenil substituído em para por Br, I e sem substituição mostraram inibição da atividade enzimática com uma resposta dose-dependente. Pela avaliação da susceptibilidade, o composto TrisBrEsp, com três grupos guanidínicos substituídos, apresentou as menores concentrações inibitória e fungicida mínimas contra espécies de Candida, Cryptococcus e Paracoccidioides, enquanto que GC7 mostrou inibição do crescimento apenas para as espécies de Cryptococcus. Assim, embora GC7 e os compostos testados com núcleo guanidínico contendo uma fenila substituída por um grupo halogênio ou um apolar apresentem inibição direta sobre a enzima DHPS, não foi possível, nas concentrações testadas, confirmar a atividade que o inibidor GC7 possui, que é a de retardar a proliferação celular. Por outro lado, o mecanismo da inibição do crescimento dos fungos aqui testados deve ser melhor estudado, visto que GC7 apresentou pouco efeito inibidor e o composto com melhor atividade não inibiu a DHPS diretamente nas concentrações testadas. / Eukaryotic translation factor eIF5A is described as the only protein that presents the amino acid hypusine that is generated by a post-translational modification, which is essential for cell proliferation in all the eukaryotes studied to date. The enzyme deoxyhypusine synthase (DHPS) is responsible for the first stage of formation of this amino acid in eIF5A. Therefore, the inhibition of DHPS also prevents the modification of the eIF5A, making this protein non-functional, which may have application in the treatment of cancer kinds in which this factor is involved. Although N1-guanyl-1,7-diaminoheptane (GC7) is a strong inhibitor of the DHPS enzyme, other effects on the cell were observed due to the acting of the compound on non-specific targets. Thus, the present work aims to search for new DHPS inhibitors, with low cytotoxicity and able to reduce cell proliferation or inhibit the growth of pathogenic eukaryotic microorganisms such as some fungal species. Firstly, the cytotoxicity of different compounds with guanidinic nucleus against murine macrophages was evaluated. Among the compounds tested, those that showed the lowest cytotoxicity were the GC7 compound and the guanidine core compounds with a phenyl group substituted in para for one methyl and another with fluorine. From these data, the antiproliferative activity of the compounds towards the same cells was evaluated. GC7 promoted inhibition of proliferation as already described in the literature, but the compounds tested had no effect on proliferation. By means of in vitro evaluation of direct inhibition on the DHPS enzyme, the guanidine core compounds with a phenyl group substituted in the para position by Br, I and without substitution showed inhibition of enzyme activity with a dose-dependent response. By the susceptibility evaluation, the TrisBrEsp compound with three-substituted guanidine groups showed the lowest concentrations for inhibitory and minimum fungicidal against Candida, Cryptococcus and Paracoccidioides species. Whereas, the GC7 showed inhibition of growth only for Cryptococcus species. Thus, although GC7 and compounds tested with a guanidine nucleus containing a phenyl substituted by a halogen or a nonpolar group show direct inhibition on the DHPS enzyme, it was not possible, at the concentrations tested, to confirm the activity of the GC7 inhibitor, which is to retard cell proliferation. On the other hand, the mechanism of inhibition of the growth of the fungi tested here should be better studied, since the GC7 showed little inhibitory effect and the compound with the best activity did not inhibit the DHPS directly at the tested concentrations.

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Russo_MorganaRejaneRabeloRosa_D.pdf: 4218123 bytes, checksum: b0799db6946f29ef482adbc56a8add73 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O aminoácido leucina é conhecido por ativar a via de síntese protéica muscular. Pesquisas recentes relatam alterações moleculares de proteínas envolvidas na via de síntese protéica após sessões agudas de exercício. No entanto, o efeito da leucina associada ao treinamento aeróbio foi pouco investigado. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar o papel da suplementação crônica com leucina, durante um programa de exercício aeróbio, sobre proteínas sinalizadoras da via de sensibilidade à insulina e síntese protéica em músculo esquelético e fígado de camundongos adultos. Os animais foram divididos em 4 grupos: controle (C), controle suplementado com leucina (CS), grupo de natação treinado (T) e grupo de natação treinado suplementado com leucina (TS). Após 12 semanas de exercício (1h30, 5 vezes/semana), o peso corporal do grupo T estava menor em relação ao outros grupos. O conteúdo de glicogênio muscular e hepático aumentou nos grupos CS, T e TS comparados ao grupo C. Os animais treinados (T e TS) apresentaram atividade da Cis e sensibilidade à insulina aumentada e menor porcentagem de gordura comparado aos animais controle (C e CS). A suplementação aumentou acentuadamente o teor de insulina e leucina plasmática no CS e TS comparado ao C e T. Em músculo esquelético, a suplementação com leucina, apesar de aumentar a fosforilação do IR, não alterou o contéudo total de IR e IRS-1 e a fosforilação do IRS-1, no entanto, a expressão gênica, o conteúdo total da mTOR e a fosforilação da p70s6k estavam aumentados. O treinamento aeróbio elevou o conteúdo total do IR e a fosforilação do IR e IRS-1, entretanto, reduziu o contéudo da p70s6k e não alterou o contéudo total da mTOR e fosforilação da p70s6k. A associação dos tratamentos elevou o conteúdo total e a fosforilação do IR acima dos valores encontrados quando os tratamentos foram administrados de forma individual e a fosforilação do IRS1 em relação aos grupos controle. Houve elevação da expressão gênica e conteúdo total da mTOR e conteúdo total e fosforilação da p70s6k acima dos valores encontrados para o grupo T, porém abaixo dos valores do grupo CS. No músculo esquelético, os resultados da associação dos tratamentos sugerem que a leucina diminuiu o efeito do exercício aeróbio sobre a via da mTOR/p70s6k. No fígado, a suplementação com leucina aumentou o conteúdo de IR e IRS-1 e a fosforilação do IR, assim como o conteúdo total da mTOR e fosforilação da p70s6k. O treinamento aeróbio, apesar de ter aumentado a fosforilação do IR, diminuiu o conteúdo total de IR, IRS-1, mTOR e p70s6k, assim como, a fosforilação do IRS-1. Quando os tratamentos foram associados, a leucina reverteu o efeito atenuador do exercício sobre a via da mTOR/p70s6k e sobre o IR e IRS-1. Estes resultados indicam que a administração de suplementação crônica com leucina para camundongos adultos durante um programa de exercício aeróbio pode ser importante por proporcionar maior ativação de proteínas da via de síntese protéica em músculo esquelético e fígado quando comparadas à atividade expressa somente em função do exercício aeróbio / Abstract: The amino acid leucine is known to activate the pathway of muscle protein synthesis. Recent surveys have reported molecular alterations after acute exercise sections. However, the effect of leucine associated with the aerobic training was seldom investigated. Thus, this study aimed to evaluate the role of chronic leucine supplementation during a program of aerobic exercise on protein signaling pathway in insulin sensitivity and protein synthesis in skeletal muscle and liver of adult mice. The animals were divided into four groups: control (C), control supplemented with leucine (CS), swim trained group (T) and swim-trained group supplemented with leucine (TS). After 12 weeks of exercise (1h30, 5 times / week), body weight of group T was lower than in the other groups. The glycogen content in muscle and liver increased in T and TS compared with group C. Trained animals (T and TS) had increased activity of Cis, insulin sensitivity and lower fat percentage compared to control animals (C and CS). The supplementation increased significantly the level of plasma insulin and leucine in CS and TS compared to C and T. In skeletal muscle, supplementation with leucine, despite increasing the phosphorylation of IR, did not alter the total content of IR and IRS-1 and phosphorylation of IRS-1; however, gene expression, the entire contents of mTOR and phosphorylation of p70s6k were increased. Aerobic training increased the total content of IR and phosphorylation of IR and IRS-1, however, reduced the content of p70s6k and did not alter the content of total mTOR and phosphorylation of p70s6k. The combination treatment increased the total content and phosphorylation of IR above the values found when the treatments were administered individually and phosphorylation of IRS-1 above the values control groups. There was an elevation of mRNA expression and mTOR total content, and phosphorylation of p70s6k above the values found for the T group, but below the CS group. In skeletal muscle, the results of the association, suggest that leucine reversed the effect of aerobic exercise on the pathway of mTOR/p70s6k. In the liver, leucine supplementation increased the content of IR and IRS-1 and phosphorylation of IR, the entire contents of phosphorylation of mTOR and p70s6k. The aerobic training, although it increased the phosphorylation of IR, decreased the total content of IR, IRS-1, mTOR and p70s6k, as well as the phosphorylation of IRS-1. When the treatments were associated leucine, it reversed the negative effect of exercise on the path of mTOR/p70s6k and the IR and IRS-1. These results indicate that chronic administration of leucine supplementation to adult mice during an aerobic exercise program may be important for making proteins pathways more active to protein synthesis in skeletal muscle and liver when compared to the activity expressed only in terms of aerobic exercise / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Ladslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:18:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Horta_AnaCeciliaGoes_D.pdf: 8864702 bytes, checksum: 86f218c1a0ae8915087764c5e1886df5 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Nos dois sistemas de cultura utilizados no presente trabalho, cotiledones isolados e explantes, GLN e ASN foram igualmente eficientes em promover acúmulo de proteinas. Entretanto, a eficiencia da ALN, em cotilédones isolados, foi bastante inferior a ASN e GLN. Já em cultura de explantes, a ALN superou as outras fontes de nitrogênio, uma vez que, segundo RAINBIRD et al., 1984), "in situ" os ureideos são degradados dentro do tegumento ou vagem e o nitrogênio resultante é convertido em GLN e translocado para os cotilédones. Em ausência de N, observou-se incremento no teor de proteínas de sementes de explantes, enquanto em cotilédones isolados, apesar do aumento em peso de matéria seca, o teor de proteínas permaneceu o mesmo. Por PAGE-SD8 foi verificado que, em presença de GLN e ASN, as proteinas de reserva dos cotilédones foram sintetizadas com mais eficiencia do que nas sementes crescidas "in vivo". Enquanto em sementes de explantes a ALN promoveu a síntese de todas as subunidades das proteínas de reserva, em cotilédones isolados, sua ineficiencia foi confirmada. Na ausência de N, em cotilédones isolados, foi observado uma metabolização preferencial das subunidades alfa', alfa (78) e cadeias acidas (118), não ocorrendo sintese detectável da subunidade beta (7S). Em todos os tratamentos, mudanças substanciais na composição de aminoacidos livres, foram observadas. Um dos efeitos mais interessantes foi com respeito ao teor de ARG. Enquanto que em sementes de explantes este teor decresceu igualmente em todos os tratamentos, em cotilédones isolados, GLN promoveu um aumento de 26 vezes. No sistema de cultura de explantes, não foi observado acúmulo de ASP e nem foi detectada GLN livre na semente como observado no sistema de cultura de cotilédones isolados, no tratamento com ALN. A adição de metionina ao meio básico estimulou o crescimento e ocasionou variações na composição de aminoácidos livres e modificações qualitativas nas proteínas de reserva de cotilédones de soja. Em cotilédones isolados o aumento em peso de matéria seca e proteínas por cotiledones foi maior do que em sementes de explantes em presença de MET (MB+MET e MB-S+MET). Cotilédones crescidos em meio deficiente em enxofre (MB-S), teve 71,4 do peso de matéria fresca e 72% do peso de matéria seca dos cotilédones crescidos com sulfato <M8). Neste tratamento o teor de proteinas decresceu de 57% em relação ao MB, mas ainda alcançando o teor de proteínas das sementes desenvolvidas na planta pelo mesmo periodo. Em cultura de explantes, o teor de proteínas foi semelhante estatisticamente ao meio básico. Por PAGE-SDS, observou-se que a adição de MET inibiu especificamente a síntese da subunidade beta da fração 7S não ocorrendo modificações detectavels nas outras frações nos dois sistemas de cultura. HOLOWACH et al. (1986) mostraram que esta inibição e reversível, ou seja, com a transferência dos cotiledones crescidos em meia contendo MET para o meia básico, a subunidade acumula a taxas comparaveis ao controle. Quando cotilédones mais velhos (100 mg de peso de matéria fresca) da variedade de soja estudada neste trabalho, que ja continham subunidade beta, foram cultivados em presença de MET, a quantidade desta subunidade permaneceu constante, mostrando que esta é estavel na presença de MET. Cotilédones isolados mantidos em meio deficiente em enxofre (MB-5) acumularam todas as subunidades das conglicininas (7S) em razão similar aos cotilédones crescidos na presença de sulfato. Nesse tratamento as subunidades ácidas das glicininas (11S) foram fracamente detectadas quando comparadas com o meio básico. em sementes de explantes, a síntese das subunidades das proteinas de reserva nao foi afetada pela ausencla de enxofre no mêlo, porem, aparentemente, a concentração da subunidade beta superou aquela de sementes mantidas em meio básico. Metionina exógena afetou Significativamente a concentração de alguns aminoácidos, especialmente SER, ALA, LYS, ARG, ASP e GLU, que aumentaram em malores proporções nos dois sistemas. Entretanto, o teor de VAL aumentou somente em cotiledones isolados, enquanto que em sementes de explantes este aminoacido não foi detectado. Na ausencia de enxofre (MB-S), em cultura de cotilédones isolados, foi observado aparecimento de SER, aumento de LYS e ARG e um decréscimo em ALA, VAL e ASN quando comparados com MB. Ja em cultura de explantes foi observado um decrescimo em SER e ARG nesse tratamento. Em relação a composição de aminoácidos das diferentes subunidades das proteinas de reserva de sementes quiescentes e interessante ressaltar que, na subunidade alfa' o conteúdo de HIS e cerca de 3 vezes maior do que nas outras subunidades e que a subunidade beta se destacou por possuir o nivel mais bailxo de metionina / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas