A cana-de-açúcar é uma gramínea com fotossíntese do tipo C4, com capacidade de acumular sacarose nos colmos em quantidades que excedem 50% de seu peso seco, característica única no reino vegetal (Moore, 1995). Sacarose e seu derivado mais importante, etanol, são dois produtos de grande importância mundial. Assim, o teor de sacarose em cana tem fundamental importância no aumento da produtividade dessas duas commodities. O melhoramento clássico parece ter alcançado seu limite, já que incrementos expressivos no teor de sacarose em novas variedades não têm sido observados e tudo aponta para a necessidade de estudos que levem a uma maior compreensão dos mecanismos moleculares associados à produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana (Casu et al., 2005; Moore, 1995). Procurar seqüências promotoras de genes de interesse é importante para a obtenção de transgênicos, já que promotores constitutivos não apresentam resultados satisfatórios em cana (Lakshmanan et al., 2005). É também objetivo aqui hibridar mRNA de genótipos de cana-de-açúcar com segregação para acúmulo de sacarose, em uma plataforma customizada de oligos (Agilent), com aproximadamente 44k elementos, que compõe uma representatividade gênica não alcançada em esforços anteriores com microarranjos de cDNA. Genome walking foi a técnica utilizada na obtenção de regiões à montante do primeiro éxon, predito in silico, para três proteínas quinase de interesse, SASGMS11561, SASGMS16343 e SASGMS09047, que se mostraram moduladas em experimentos anteriores de hibridação com amostras segregantes para conteúdo de sacarose. Foi obtido sucesso nos três casos, tendo os fragmentos de DNA sido seqüenciados e oportunamente alinhados à montante dos correspondentes genes ortólogos em sorgo, bem como ao banco ainda em construção de contigs do genoma de cana-de-açúcar, obtidos por shotgun. A plataforma Agilent, com seus 43803 SAS únicos, mostrou-se uma ferramenta muito adequada para as hibridações de genótipos de mais alto Brix contra genótipos de mais baixo Brix. Um total de 569 genes diferencialmente expressos foram obtidos em pelo menos uma das três hibridações realizadas. Um grupo de genes, de diferentes categorias e perfis de modulação, foi validado por PCR em tempo real, obtendo uma taxa de aproximadamente 90%. Apesar do grande número de SAS diferencialmente expressos, por volta de 70% dos mesmos ainda se encontram não categorizados, seja por falta de similaridade de seqüência em bancos de dados de organismos próximos ou pela alta complexidade e esforço prático na cura desse processo de categorização manual. Assim, três fragmentos de seqüências promotoras para três proteínas quinase de interesse foram obtidos e seqüenciados, como parte dos esforços do grupo em formar um catálogo de promotores específicos para cana-de-açúcar. Um grupo de genes foi analisado dos resultados das hibridações por seus papéis relevantes nos processos que levam ao maior teor de sacarose em cana, devidamente corroborados por trabalhos do próprio grupo, bem como de outros / Sugarcane is a C4 plant with the unique characteristic of being capable of accumulating sucrose in its culms in quantities that exceed 50% of its dry weight (Moore, 1995). Sucrose and ethanol are highly valued products in the world of today. Sucrose content is a trait with fundamental importance in the on-going process of increasing productivity of these two sugarcane byproducts. Classic improvement of sugarcane seems to have reached its practical limits, given that it has become increasingly harder to obtain varieties with increased sugar content. This obstacle points towards the necessity of better comprehension of the molecular mechanisms associated to the production, transport and accumulation of sucrose in sugarcane (Casu et al., 2005; Moore, 1995). The search for promoter sequences of genes of interest is crucial for the production of transgenic lines, since the use of constitutive promoters in sugarcane has been highly problematic, leading to unsatisfactory results in most cases (Lakshmanan et al., 2005). Another objective was to hybridize sugarcane genotypes with contrasting sugar content in a customized Agilent oligo platform, containing approximately 44k elements, which signifies the best effort so far regarding gene representativeness. Genome walking was the chosen technique to obtain upstream regions of the first in silico predicted exon of three proteins kinases of interest, SASGMS11561, SASGMS16343 and SASGMS09047, all of them selected from previous hybridization experiments with contrasting sucrose content samples. Success was achieved in all three cases, and the obtained fragments were sequenced and aligned to their respective syntenic region on the sorghum genome as well as on contigs from an increasingly larger bank of genomic sugarcane sequences, from our group, which has been acquired using the shotgun sequencing method. The Agilent platform, with its 43803 unique sugarcane assembled sequences (SAS), has proven valuable as a powerful high scale tool for the hybridization of genotypes with contrasting Brix values (high versus low Brix). A total of 569 differentially expressed genes were obtained from at least one of the three experiments accomplished. A group of genes from different categories and modulation profiles was depicted and validated through real time PCR, with an approximate validation rate of 90%. Although the number of differentially expressed genes is high, around 70% of them is still uncategorized, mostly because of their unique identity and therefore lack of reference organisms to compare with and the high complexity and laboriousness of categorizing them manually. In summary, three promoter fragments from three different protein kinases of interest were obtained and sequenced, as a part of a greater effort to create a sugarcane promoter sequence catalogue. From the hybridization assays, a group of genes were analyzed, due to their putative importance in the processes that lead to a higher sucrose content in sugarcane, also corroborated by previous studies from our group as well as from others.

A cana-de-açúcar é uma gramínea com fotossíntese do tipo C4, com capacidade de acumular sacarose nos colmos em quantidades que excedem 50% de seu peso seco, característica única no reino vegetal (Moore, 1995). Sacarose e seu derivado mais importante, etanol, são dois produtos de grande importância mundial. Assim, o teor de sacarose em cana tem fundamental importância no aumento da produtividade dessas duas commodities. O melhoramento clássico parece ter alcançado seu limite, já que incrementos expressivos no teor de sacarose em novas variedades não têm sido observados e tudo aponta para a necessidade de estudos que levem a uma maior compreensão dos mecanismos moleculares associados à produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana (Casu et al., 2005; Moore, 1995). Procurar seqüências promotoras de genes de interesse é importante para a obtenção de transgênicos, já que promotores constitutivos não apresentam resultados satisfatórios em cana (Lakshmanan et al., 2005). É também objetivo aqui hibridar mRNA de genótipos de cana-de-açúcar com segregação para acúmulo de sacarose, em uma plataforma customizada de oligos (Agilent), com aproximadamente 44k elementos, que compõe uma representatividade gênica não alcançada em esforços anteriores com microarranjos de cDNA. Genome walking foi a técnica utilizada na obtenção de regiões à montante do primeiro éxon, predito in silico, para três proteínas quinase de interesse, SASGMS11561, SASGMS16343 e SASGMS09047, que se mostraram moduladas em experimentos anteriores de hibridação com amostras segregantes para conteúdo de sacarose. Foi obtido sucesso nos três casos, tendo os fragmentos de DNA sido seqüenciados e oportunamente alinhados à montante dos correspondentes genes ortólogos em sorgo, bem como ao banco ainda em construção de contigs do genoma de cana-de-açúcar, obtidos por shotgun. A plataforma Agilent, com seus 43803 SAS únicos, mostrou-se uma ferramenta muito adequada para as hibridações de genótipos de mais alto Brix contra genótipos de mais baixo Brix. Um total de 569 genes diferencialmente expressos foram obtidos em pelo menos uma das três hibridações realizadas. Um grupo de genes, de diferentes categorias e perfis de modulação, foi validado por PCR em tempo real, obtendo uma taxa de aproximadamente 90%. Apesar do grande número de SAS diferencialmente expressos, por volta de 70% dos mesmos ainda se encontram não categorizados, seja por falta de similaridade de seqüência em bancos de dados de organismos próximos ou pela alta complexidade e esforço prático na cura desse processo de categorização manual. Assim, três fragmentos de seqüências promotoras para três proteínas quinase de interesse foram obtidos e seqüenciados, como parte dos esforços do grupo em formar um catálogo de promotores específicos para cana-de-açúcar. Um grupo de genes foi analisado dos resultados das hibridações por seus papéis relevantes nos processos que levam ao maior teor de sacarose em cana, devidamente corroborados por trabalhos do próprio grupo, bem como de outros / Sugarcane is a C4 plant with the unique characteristic of being capable of accumulating sucrose in its culms in quantities that exceed 50% of its dry weight (Moore, 1995). Sucrose and ethanol are highly valued products in the world of today. Sucrose content is a trait with fundamental importance in the on-going process of increasing productivity of these two sugarcane byproducts. Classic improvement of sugarcane seems to have reached its practical limits, given that it has become increasingly harder to obtain varieties with increased sugar content. This obstacle points towards the necessity of better comprehension of the molecular mechanisms associated to the production, transport and accumulation of sucrose in sugarcane (Casu et al., 2005; Moore, 1995). The search for promoter sequences of genes of interest is crucial for the production of transgenic lines, since the use of constitutive promoters in sugarcane has been highly problematic, leading to unsatisfactory results in most cases (Lakshmanan et al., 2005). Another objective was to hybridize sugarcane genotypes with contrasting sugar content in a customized Agilent oligo platform, containing approximately 44k elements, which signifies the best effort so far regarding gene representativeness. Genome walking was the chosen technique to obtain upstream regions of the first in silico predicted exon of three proteins kinases of interest, SASGMS11561, SASGMS16343 and SASGMS09047, all of them selected from previous hybridization experiments with contrasting sucrose content samples. Success was achieved in all three cases, and the obtained fragments were sequenced and aligned to their respective syntenic region on the sorghum genome as well as on contigs from an increasingly larger bank of genomic sugarcane sequences, from our group, which has been acquired using the shotgun sequencing method. The Agilent platform, with its 43803 unique sugarcane assembled sequences (SAS), has proven valuable as a powerful high scale tool for the hybridization of genotypes with contrasting Brix values (high versus low Brix). A total of 569 differentially expressed genes were obtained from at least one of the three experiments accomplished. A group of genes from different categories and modulation profiles was depicted and validated through real time PCR, with an approximate validation rate of 90%. Although the number of differentially expressed genes is high, around 70% of them is still uncategorized, mostly because of their unique identity and therefore lack of reference organisms to compare with and the high complexity and laboriousness of categorizing them manually. In summary, three promoter fragments from three different protein kinases of interest were obtained and sequenced, as a part of a greater effort to create a sugarcane promoter sequence catalogue. From the hybridization assays, a group of genes were analyzed, due to their putative importance in the processes that lead to a higher sucrose content in sugarcane, also corroborated by previous studies from our group as well as from others.

A fosforilação de proteínas é o tipo de modificação pós-traducional mais recorrente nas vias de sinalização, desempenhando papel central numa vasta gama de eventos celulares. Um completo entendimento das circunstâncias que coordenam o evento de fosforilação permanece como um desafio para a ciência, a despeito do crescente número de abordagens e estudos realizados no assunto. Um mecanismo largamente descrito e aceito como essencial para coordenar a fosforilação de proteínas é a existência de sequências de aminoácidos que facilitam a fosforilação, conhecidos como consensos de fosforilação. Nesse modelo, cada proteína quinase reconhece sítios de fosforilação se os mesmos estiverem inseridos em uma sequência específica de resíduos na estrutura primária do substrato. Porém, com o crescente volume de dados sobre fosforilação, é possível notar a existência de sítios que são validados experimentalmente como fosforilados por uma determinada proteína quinase, que não apresentam o consenso de fosforilação. Neste trabalho, foi testada e comprovada a hipótese de que estes sítios de fosforilação sem consenso sequencial apresentam resíduos localizados em regiões da estrutura terciária adjacentes ao sítio de fosforilação, cuja as características estereoquímicas mimetizam um peptídeo substrato contendo o consenso de fosforilação. Para essa avaliação, utilizando substratos da PKA, foi constatado que mais de 90% dos sítios de fosforilação que não apresentam o consenso na estrutura primária, apresentam essa disposição na estrutura terciária. Resíduos distantes na estrutura primária se apresentam próximos espacialmente na estrutura tridimensional, em uma conformação semelhante a de um sítio com o consenso de fosforilação. Com isso nós propomos a existência de sítios conformacionais de fosforilação. Para confirmar que esses sítios conformacionais poderiam ser cruciais no reconhecimento do substrato, foram construídos modelos da interação da proteína quinase com os substratos, visando demonstrar a viabilidade da interação dos resíduos formadores do consenso conformacional com a proteína quinase de maneira análoga a de um substrato com o consenso de fosforilação. Para a comprovação experimental do fenômeno, foi utilizado o modelo de fosforilação da -Tubulina, no qual foi constatada uma fosforilação no resíduo T253 que depende da atuação dos resíduos K163 e K164 para a interação com a proteína quinase, confirmando a coerência do modelo proposto. Diante da novidade da proposta, dos estudos computacionais feitos e da validação conseguida, torna-se clara a relevância de se estudar a estrutura tridimensional dos substratos de fosforilação, não só como uma forma de aprofundar os conhecimentos gerais na área de fosforilação, mas também como uma alternativa com potencial de ser explorada no desenvolvimento de novas tecnologias / Protein phosphorylation is the most frequent type of post-translational modification in signaling pathway, developing a key role in a wide range of cell events. The full understanding of the circumstances that coordinate the phosphorylation event remains a challenge for science, despite the growing number of approaches and studies on the subject. A broadly described and accepted mechanism as essential for the coordination of protein phosphorylation is the existence of amino acids sequences that contribute to phosphorylation occurrence, known as phosphorylation consensus. In this model, each protein kinase is able to recognize phosphorylation sites inserted in a specific sequence on the primary structure. However, as the data about phosphorylation sites increases, it is possible to notice that there are sites that are validated experimentally as phosphorylated by a particular protein kinase, which do not have the consensus phosphorylation. In this work, it was tested and proved that phosphorylation sites without the sequence consensus presents anchors residues, that are close to the phosphorylation site on the tertiary structure, creating a structural conformation that mimics the stereochemical features of a substrate peptide containing the phosphorylation consensus. For this evaluation, using substrates of PKA, it was found that more than 90% of phosphorylation sites that have no consensus on the primary structure, presented this kind of disposition on the tertiary structure. Distant residues in the primary structure are spatially close on the three-dimensional structure, in a conformation similar to a phosphorylation site containing the consensus. Thus we proposed the existence of conformational phosphorylation sites. To confirm that these conformational sites could be crucial in substrate recognition, it was built kinase-substrate models, aiming to demonstrate the feasibility of residues forming the conformational consensus on the substrate to interact with the kinase analogously to a substrate with consensus phosphorylation. For experimental verification of this phenomenon, we used the phosphorylation model of -Tubulin, in which we observed a phosphorylation at residue T253 that depends of residues K163 and K164 to interact with the protein kinase, confirming the consistency of proposed model. Faced with the novelty of the proposal, the computational data and the experimental validation, it becomes clear the importance of studying the three dimensional structure of phosphorylation sites, not only as a way of achieving deeper knowledge on phosphorylation field, but also as a potential prospect to be explored on the development of new technologies

A fosforilação de proteínas é o tipo de modificação pós-traducional mais recorrente nas vias de sinalização, desempenhando papel central numa vasta gama de eventos celulares. Um completo entendimento das circunstâncias que coordenam o evento de fosforilação permanece como um desafio para a ciência, a despeito do crescente número de abordagens e estudos realizados no assunto. Um mecanismo largamente descrito e aceito como essencial para coordenar a fosforilação de proteínas é a existência de sequências de aminoácidos que facilitam a fosforilação, conhecidos como consensos de fosforilação. Nesse modelo, cada proteína quinase reconhece sítios de fosforilação se os mesmos estiverem inseridos em uma sequência específica de resíduos na estrutura primária do substrato. Porém, com o crescente volume de dados sobre fosforilação, é possível notar a existência de sítios que são validados experimentalmente como fosforilados por uma determinada proteína quinase, que não apresentam o consenso de fosforilação. Neste trabalho, foi testada e comprovada a hipótese de que estes sítios de fosforilação sem consenso sequencial apresentam resíduos localizados em regiões da estrutura terciária adjacentes ao sítio de fosforilação, cuja as características estereoquímicas mimetizam um peptídeo substrato contendo o consenso de fosforilação. Para essa avaliação, utilizando substratos da PKA, foi constatado que mais de 90% dos sítios de fosforilação que não apresentam o consenso na estrutura primária, apresentam essa disposição na estrutura terciária. Resíduos distantes na estrutura primária se apresentam próximos espacialmente na estrutura tridimensional, em uma conformação semelhante a de um sítio com o consenso de fosforilação. Com isso nós propomos a existência de sítios conformacionais de fosforilação. Para confirmar que esses sítios conformacionais poderiam ser cruciais no reconhecimento do substrato, foram construídos modelos da interação da proteína quinase com os substratos, visando demonstrar a viabilidade da interação dos resíduos formadores do consenso conformacional com a proteína quinase de maneira análoga a de um substrato com o consenso de fosforilação. Para a comprovação experimental do fenômeno, foi utilizado o modelo de fosforilação da -Tubulina, no qual foi constatada uma fosforilação no resíduo T253 que depende da atuação dos resíduos K163 e K164 para a interação com a proteína quinase, confirmando a coerência do modelo proposto. Diante da novidade da proposta, dos estudos computacionais feitos e da validação conseguida, torna-se clara a relevância de se estudar a estrutura tridimensional dos substratos de fosforilação, não só como uma forma de aprofundar os conhecimentos gerais na área de fosforilação, mas também como uma alternativa com potencial de ser explorada no desenvolvimento de novas tecnologias / Protein phosphorylation is the most frequent type of post-translational modification in signaling pathway, developing a key role in a wide range of cell events. The full understanding of the circumstances that coordinate the phosphorylation event remains a challenge for science, despite the growing number of approaches and studies on the subject. A broadly described and accepted mechanism as essential for the coordination of protein phosphorylation is the existence of amino acids sequences that contribute to phosphorylation occurrence, known as phosphorylation consensus. In this model, each protein kinase is able to recognize phosphorylation sites inserted in a specific sequence on the primary structure. However, as the data about phosphorylation sites increases, it is possible to notice that there are sites that are validated experimentally as phosphorylated by a particular protein kinase, which do not have the consensus phosphorylation. In this work, it was tested and proved that phosphorylation sites without the sequence consensus presents anchors residues, that are close to the phosphorylation site on the tertiary structure, creating a structural conformation that mimics the stereochemical features of a substrate peptide containing the phosphorylation consensus. For this evaluation, using substrates of PKA, it was found that more than 90% of phosphorylation sites that have no consensus on the primary structure, presented this kind of disposition on the tertiary structure. Distant residues in the primary structure are spatially close on the three-dimensional structure, in a conformation similar to a phosphorylation site containing the consensus. Thus we proposed the existence of conformational phosphorylation sites. To confirm that these conformational sites could be crucial in substrate recognition, it was built kinase-substrate models, aiming to demonstrate the feasibility of residues forming the conformational consensus on the substrate to interact with the kinase analogously to a substrate with consensus phosphorylation. For experimental verification of this phenomenon, we used the phosphorylation model of -Tubulin, in which we observed a phosphorylation at residue T253 that depends of residues K163 and K164 to interact with the protein kinase, confirming the consistency of proposed model. Faced with the novelty of the proposal, the computational data and the experimental validation, it becomes clear the importance of studying the three dimensional structure of phosphorylation sites, not only as a way of achieving deeper knowledge on phosphorylation field, but also as a potential prospect to be explored on the development of new technologies