A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.

O genoma das células eucarióticas é um dos principais alvos para danos induzidos por inúmeros fatores ambientes, sejam estes de origem biótica ou abiótica. Considerando a complexidade da molécula de DNA, não é supreendente que existam diferentes tipos de lesões com os mais variados graus de severidade. Dentre todas as lesões que podem ser induzidas no DNA, as pontes intercadeias (ICLs) estão entre as mais graves. Se não forem reparadas, a presença de apenas um ICL pode ser letal para a célula. Além disso, as lesões do tipo ICLs são quimicamente heterogêneas, podendo modificar a estrutura do DNA de forma permanente ou temporária. Os mecanismos relacionados à reparação de ICLs ainda são pouco conhecidos em eucariotos. Apesar de várias proteínas terem sido descritas como essenciais ao processo, não há um modelo único que explique esta reparação. Contudo, dentre as diferentes proteínas que participam na reparação de ICLs, destacam-se as nucleases Pso2/Snm1. A forma de atuação das proteínas Pso2/Snm1 não é conhecida, mas inúmeros dados obtidos com mutantes de Saccharomyces cerevisiae e, recentemente, com células de mamífero, mostram que a ausência de Pso2p/Snm1p bloqueia a restituição do DNA de alta massa molecular. Por outro lado, tem sido mostrado que o Pso2p/Snm1p provavelmente atua na manutenção da cromatina, mas de uma forma ainda não completamente esclarecida. Uma das proteínas pertencentes à família Pso2p/Snm1p, Ártemis, possui um papel importante no desenvolvimento do sistema imunológico adaptativo de metazoários e parece ser essencial para outros processos relacionados ao metabolismo de DNA eucariótico. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo principal o estudo da família Pso2p/Snm1p por meio da análise filogenética e de seqüências, comparando-a com proteínas homólogas já descritas em outros organismos. Além disso, esta comparação XVII permitiu estabelecer uma correlação funcional entre as proteínas em termos de reparação de DNA e manutenção da cromatina eucariótica. As análises de filogenia e de seqüências claramente demonstraram que as proteínas Pso2/Snm1 podem ser agrupadas em quatro grupos principais ao invés de três, ao contrário do que se conhecia previamente. Três destes grupos, por sua vez, são formados por subgrupos específicos, que possivelmente atuam de forma diferenciada na reparação de DNA, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica. Por outro lado, os estudos das seqüências Pso2/Snm1, baseados principalmente na técnica de análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA), revelaram um alto grau de similaridade de estruturas primárias e secundárias entre os diferentes grupos, um indicativo da importância estrutural para a função destas proteínas no metabolismo de DNA. A técnica de HCA permitiu mapear regiões conservadas (CRs) em todas as seqüências estudadas, compondo o chamado domínio Pso2p/Snm1p. Em alguns casos, o domínio Pso2p/Snm1p encontra-se fusionado a outros domínios catalíticos. Neste caso, destaca-se o estudo de uma nova família de DNA ligases dependentes de ATP que são exclusivas de plantas. Esta nova família, denominada de Lig6p, parece ter funções importantes no metabolismo do DNA de plantas, sendo esta a primeira DNA ligase eucariótica com função nucleásica identificada. Usando os dados obtidos neste trabalho em conjunto com os resultados de outros autores, é sugerido um possível modo de atuação das proteínas Pso2p/Snm1p na reparação de danos do tipo ICL, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6435_1.pdf: 726788 bytes, checksum: 918761ed3eb9195504e04a8f30e0caba (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / O emprego de dois testes sorodiagnósticos para a doença de Chagas é obrigatório para toda triagem sorológica de doadores em Bancos de Sangue, mas os disponíveis atualmente só utilizam extratos totais, frações semipurificadas ou purificadas das formas epimastigotas e possuem uma considerável variação na reprodutibilidade e na confiabilidade, principalmente devido às reações cruzadas ou à padronização dos reagentes. Desta forma, recomenda-se o uso de antígenos recombinantes, que podem contribuir para aumentar a sensibilidade e a especificidade do ensaio, além de reduzir custos. Comparamos os resultados obtidos com as três metodologias usadas na Fundação Hemope: a HAI e o ELISA, empregados na triagem, e a IFI, empregada como teste confirmatório com o ELISA recombinante in-house preparado com o antígeno DH-1D. A comparação foi realizada com 298 soros (positivos, indeterminados ou negativos) obtidos dos doadores após a realização do teste confirmatório. O rec ELISA quando comparado com o conjunto diagnóstico da Organon, apresentou uma sensibilidade ligeiramente maior de 97% enquanto no outro a sensibilidade foi de 95%. Quando comparado com o conjunto diagnóstico da Gull, apresentou uma sensibilidade bem menor de 88% enquanto no outro a sensibilidade foi de 95%. Como nesse estudo, o ELISA rec não apresentou resultados muito superiores aos conjuntos diagnósticos comerciais, que possuem resultados muito discordantes entre si, continuaremos aprimorando o nosso antígeno recombinante isoladamente ou utilizando juntamente com outros que já possuímos. Os dados da HAI não foram utilizados porque apresentaram resultados muito discordantes. E com relação a IFI, podemos dizer que apesar da sensibilidade e da especificidade serem consideradas elevadas, na prática, esse teste não é adequado para ser usado como confirmatório e conseqüentemente não pode ser considerado o teste gold standard

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. / Made available in DSpace on 2012-10-17T20:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Amostras de milho, farelo de soja e hidrolisado ácido de caseína foram submetidas à hidrólise ácida em estufa (110 ± 5 °C, durante 22 horas) com ácido clorídrico 6 N, em ampolas de vidro seladas sob vácuo e microondas. Os hidrolisados foram preparados por quatro métodos: 1) evaporação em evaporador rotativo sob vácuo, 2) evaporação em câmaras a vácuo em presença de pastilhas de NaOH, 3) evaporação em bloco de aquecimento sob fluxo de argônio e 4) neutralização com solução padrão de citrato/NaOH. Os aminoácidos foram separados e quantificados em analisador específico Beckman System 6300 e CLAE Shimadzu LC-10AD, com derivatização pós-coluna por ninidrina e OPA, respectivamente. O método de neutralização dos reagentes da hidrólise apresentou o maior teor para a maioria dos aminoácidos. Permite boa produtividade, atendendo às necessidades de trabalhar com grandes quantidades de amostras. A evaporação em evaporador rotativo apresentou perdas significativas apenas para treonina e serina na amostra farelo de soja, sob fluxo de argônio observou-se baixos teores para treonina, fenilalanina e lisina e em câmaras sob vácuo apresentou perdas significativas para treonina, serina e tirosina. A utilização da solução de redissolução de amostras recomendada para o analisador Beckman apresentou resultados superestimados, quando utilizada em CLAE com detecção por fluorescência. O uso do microondas Pressurized Microwave Decomposition System PAAR não apresentou resultados equivalentes aos obtidos pela hidrólise em estufa.

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Após a evocação as memórias já consolidadas tornam-se novamente vulneráveis à ação de inibidores de síntese protéica. Isto leva a hipótese de que as memórias são reconsolidadas após sua evocação, e que este processo depende de síntese protéica. Muitas evidências indicam que o hipocampo tem um papel chave na consolidação e na reconsolidação de diferentes memórias. A evocação não reforçada pode causar extinção e/ou reconsolidação, dois processos que afetam a retenção da memória em vias opostas. Usando a tarefa do labirinto aquático de Morris nós demonstramos que a anisomicina, um inibidor de síntese protéica, infundida na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente, mas não 3 e 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória espacial associada ao LAM. Além disso, demonstramos que a expressão repetida e não reforçada da memória espacial causa extinção que não é afetada pela inibição de síntese protéica na região CA1. No entanto, se o número de testes de evocação não reforçados é insuficiente para induzir extinção, ocorre o processo de reconsolidação dependente de síntese protéica hipocampal que recupera a memória original. A inibição da síntese protéica hipocampal após o aprendizado reverso prejudica a retenção da preferência espacial reversa e bloqueia a persistência da memória inicial, sugerindo que o aprendizado reverso envolve antes reconsolidação do que extinção do traço original. Além disso, a D-cicloserina, um parcial agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, quando administrada sistemicamente ou na região CA1 após uma sessão de evocação não reforçada, melhora a retenção da memória. Nossos resultados no LAM sugerem a existência de um processo reconsolidatório dependente de síntese protéica hipocampal que opera recuperando e modernizando o traço enfraquecido pela evocação e sugere que, semelhante ao processo de consolidação, o de reconsolidação pode não ser somente bloqueado, mas melhorado por tratamentos farmacológicos apropriados. Até o presente não existem estudos a respeito das conseqüências da inibição da síntese protéica hipocampal no armazenamento e persistência pós-evocação da memória de reconhecimento de objetos. Neste trabalho nós reportamos que a infusão de anisomicina na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente ou 180 min, mas não 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória de reconhecimento de longa duração sem afetar a memória de curta duração, o comportamento exploratório e o estado de ansiedade ou a funcionalidade hipocampal. A anisomicina quando administrada na região CA1 após a reativação da memória na presença de objetos familiares não afeta a posterior retenção do traço mnemônico. No entanto, quando administrada na região CA1 imediatamente após a exposição dos animais a um objeto novo e um familiar, prejudica a retenção da memória de ambos os objetos. O efeito amnésico da anisomicina não ocorreu após a exposição a dois objetos novos ou a exploração ao contexto na ausência de estímulos específicos, sugerindo que é dependente da reativação do traço consolidado na presença de um comportamento relevante e saliente. Os resultados obtidos a partir da tarefa de reconhecimento de objetos indicam que o hipocampo é engajado durante a reconsolidação deste traço, talvez adicionando novas informações à memória original. / Upon retrieval, consolidated memories are rendered again vulnerable to the action of metabolic blockers, notably protein synthesis inhibitors. This has led to the hypothesis that memories are reconsolidated at the time of retrieval, and that this depends on protein synthesis. Ample evidence indicates that the hippocampus plays a key role both in the consolidation and reconsolidation of different memories. Non-reinforced retrieval can cause extinction and/or reconsolidation, two processes that affect subsequent retrieval in opposite ways. Using the Morris water maze task we show that in the rat repeated non-reinforced expression of spatial memory causes extinction which is unaffected by inhibition of protein synthesis within the CA1 region of the dorsal hippocampus. However, if the number of non-reinforced retrieval trials is insufficient to induce long-lasting extinction, then a hippocampal protein synthesis-dependent reconsolidation process recovers the original memory. Inhibition of hippocampal protein synthesis after reversal learning sessions impairs retention of the reversed preference and blocks persistence of the original one suggesting that reversal learning involves reconsolidation rather than extinction of the original memory. In addition, when given systemically or into the CA1 region after non-reinforced retrieval, the partial NMDAr agonist D-cycloserine improves subsequent memory retention. Our results suggest the existence of a hippocampal protein synthesis dependent reconsolidation process that operates to recover or update retrieval-weakened memories from incomplete extinction and suggest that, like consolidation, reconsolidation can be not only blocked but also enhanced by appropriate pharmacological treatments. At present there are no studies about the consequences of hippocampal protein synthesis inhibition in the storage and post-retrieval persistence of object recognition memory. Here we report that infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin in the dorsal CA1 region immediately or 180 min but not 360 min after training impairs consolidation of long-term object recognition memory without affecting short-term memory, exploratory behavior and anxiety state, or hippocampal functionality. When given into CA1 after memory reactivation in the presence of familiar objects ANI did not affect further retention. However, when administered into CA1 immediately after exposing animals to a novel and a familiar object ANI impaired memory of both objects. The amnesic effect of ANI was long-lasting, did not happen either after exposure to two novel objects or following exploration of the context alone or in the absence of specific stimuli suggesting that it was not reversible and contingent on the reactivation of the consolidated trace in the presence of a salient, behavioral relevant novel cue. Our results indicate that hippocampal protein synthesis is required during a limited post training time for consolidation of object recognition memory and show that the hippocampus is engaged during reconsolidation of this type of memory, maybe accruing new information into the original trace.

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. / Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. / Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.

Após a evocação as memórias já consolidadas tornam-se novamente vulneráveis à ação de inibidores de síntese protéica. Isto leva a hipótese de que as memórias são reconsolidadas após sua evocação, e que este processo depende de síntese protéica. Muitas evidências indicam que o hipocampo tem um papel chave na consolidação e na reconsolidação de diferentes memórias. A evocação não reforçada pode causar extinção e/ou reconsolidação, dois processos que afetam a retenção da memória em vias opostas. Usando a tarefa do labirinto aquático de Morris nós demonstramos que a anisomicina, um inibidor de síntese protéica, infundida na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente, mas não 3 e 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória espacial associada ao LAM. Além disso, demonstramos que a expressão repetida e não reforçada da memória espacial causa extinção que não é afetada pela inibição de síntese protéica na região CA1. No entanto, se o número de testes de evocação não reforçados é insuficiente para induzir extinção, ocorre o processo de reconsolidação dependente de síntese protéica hipocampal que recupera a memória original. A inibição da síntese protéica hipocampal após o aprendizado reverso prejudica a retenção da preferência espacial reversa e bloqueia a persistência da memória inicial, sugerindo que o aprendizado reverso envolve antes reconsolidação do que extinção do traço original. Além disso, a D-cicloserina, um parcial agonista do sítio da glicina no receptor NMDA, quando administrada sistemicamente ou na região CA1 após uma sessão de evocação não reforçada, melhora a retenção da memória. Nossos resultados no LAM sugerem a existência de um processo reconsolidatório dependente de síntese protéica hipocampal que opera recuperando e modernizando o traço enfraquecido pela evocação e sugere que, semelhante ao processo de consolidação, o de reconsolidação pode não ser somente bloqueado, mas melhorado por tratamentos farmacológicos apropriados. Até o presente não existem estudos a respeito das conseqüências da inibição da síntese protéica hipocampal no armazenamento e persistência pós-evocação da memória de reconhecimento de objetos. Neste trabalho nós reportamos que a infusão de anisomicina na região CA1 do hipocampo dorsal imediatamente ou 180 min, mas não 6 horas após o treino prejudica a consolidação da memória de reconhecimento de longa duração sem afetar a memória de curta duração, o comportamento exploratório e o estado de ansiedade ou a funcionalidade hipocampal. A anisomicina quando administrada na região CA1 após a reativação da memória na presença de objetos familiares não afeta a posterior retenção do traço mnemônico. No entanto, quando administrada na região CA1 imediatamente após a exposição dos animais a um objeto novo e um familiar, prejudica a retenção da memória de ambos os objetos. O efeito amnésico da anisomicina não ocorreu após a exposição a dois objetos novos ou a exploração ao contexto na ausência de estímulos específicos, sugerindo que é dependente da reativação do traço consolidado na presença de um comportamento relevante e saliente. Os resultados obtidos a partir da tarefa de reconhecimento de objetos indicam que o hipocampo é engajado durante a reconsolidação deste traço, talvez adicionando novas informações à memória original. / Upon retrieval, consolidated memories are rendered again vulnerable to the action of metabolic blockers, notably protein synthesis inhibitors. This has led to the hypothesis that memories are reconsolidated at the time of retrieval, and that this depends on protein synthesis. Ample evidence indicates that the hippocampus plays a key role both in the consolidation and reconsolidation of different memories. Non-reinforced retrieval can cause extinction and/or reconsolidation, two processes that affect subsequent retrieval in opposite ways. Using the Morris water maze task we show that in the rat repeated non-reinforced expression of spatial memory causes extinction which is unaffected by inhibition of protein synthesis within the CA1 region of the dorsal hippocampus. However, if the number of non-reinforced retrieval trials is insufficient to induce long-lasting extinction, then a hippocampal protein synthesis-dependent reconsolidation process recovers the original memory. Inhibition of hippocampal protein synthesis after reversal learning sessions impairs retention of the reversed preference and blocks persistence of the original one suggesting that reversal learning involves reconsolidation rather than extinction of the original memory. In addition, when given systemically or into the CA1 region after non-reinforced retrieval, the partial NMDAr agonist D-cycloserine improves subsequent memory retention. Our results suggest the existence of a hippocampal protein synthesis dependent reconsolidation process that operates to recover or update retrieval-weakened memories from incomplete extinction and suggest that, like consolidation, reconsolidation can be not only blocked but also enhanced by appropriate pharmacological treatments. At present there are no studies about the consequences of hippocampal protein synthesis inhibition in the storage and post-retrieval persistence of object recognition memory. Here we report that infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin in the dorsal CA1 region immediately or 180 min but not 360 min after training impairs consolidation of long-term object recognition memory without affecting short-term memory, exploratory behavior and anxiety state, or hippocampal functionality. When given into CA1 after memory reactivation in the presence of familiar objects ANI did not affect further retention. However, when administered into CA1 immediately after exposing animals to a novel and a familiar object ANI impaired memory of both objects. The amnesic effect of ANI was long-lasting, did not happen either after exposure to two novel objects or following exploration of the context alone or in the absence of specific stimuli suggesting that it was not reversible and contingent on the reactivation of the consolidated trace in the presence of a salient, behavioral relevant novel cue. Our results indicate that hippocampal protein synthesis is required during a limited post training time for consolidation of object recognition memory and show that the hippocampus is engaged during reconsolidation of this type of memory, maybe accruing new information into the original trace.