Este trabalho de mestrado teve como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia analítica focada no preparo de amostra protéica. O objeto de estudo foram os fragmentos solúveis das isoformas da proteína precursora do amilóide (APPs) presentes no plasma rico em plaquetas. As APPs têm sido amplamente estudadas em diversos grupos de pesquisa no Brasil e em outros no mundo como possíveis biomarcadores para a doença de Alzheimer. O preparo de amostra é a etapa fundamental que influencia significativamente nos resultados seguintes, especialmente quando se trata de amostras protéicas que exigem maiores cuidados. Para a avaliação dos melhores preparos de amostra para as APPs, foi utilizado SDS-PAGE e eletrotransferências de proteínas por Western Blotting. A eficiência dos preparos foi avaliada baseando-se nos resultados de revelação com anticorpos específicos para APP e medidas de densitometria de bandas. Após a escolha do melhor preparo de amostra utilizando SDS-PAGE e Western Blotting, as isoformas da APP foram separadas por eletroforese bidimensional (2DE). Durante a etapa de preparo de amostra, os resultados inesperados de massa molecular, o que indicou possível biodegradação das APPs. A identificação da fonte de interferência foi realizada estudando as variáveis dos preparos de amostra. Com isso foi possível determinar a fonte de interferência, mas uma avaliação mais detalhada das isoformas (como utilização de espectrometria de massas) não foi possível. / The goal of this Master\'s work was to develop an analytical methodology focused on protein sample preparation. The analyte studied were soluble amyloid precursor protein isoforms (APPs) which has been studied in many groups in Brazil and around the world as a possible biomarker for Alzheimer\'s disease. Sample preparation is a crucial step that influence significantly on next results, especially about biological samples which require more attention. For the best sample preparation for APPs, was used SDS-PAGE and protein electrotransference by Western Blotting techniques. The efficiency of the sample preparations was evaluated based on specific antibody reactions and densitometry measures of these interactions. After that, the APP isoforms were analyzed by two dimensional electrophoresis (2DE). During the sample preparation, were obtained unexpected molecular mass results, which indicated some APPs biodegradation. For the determination of the interference source, the variants steps of the sample preparation were analyzed. The sample preparation interference source was identified, but a more detailed study of the isoforms (by mass spectrometry) was not possible as well as the analysis of the identity of the possible fragmented isoforms.

Neste experimento foi avaliado a resposta de frangos machos da linhagem Cobb x Cobb 500 e Ross x Ross 308, alimentados com dois níveis de proteína bruta e relações graduais de metionina + cisteína, dos 14 aos 35 dias de idade. A dieta foi formulada a base de milho, farelo de soja e farinha de carne, com 3060 kcal/kg e 26 % de proteína bruta, contendo 1,46 % de lisina digestível verdadeira. A concentração de metionina + cisteína digestível (58:42%) foi 0,73 % (50 %em relação à lisina), os outros nutrientes seguiram as recomendações do NRC (1994). Nesta ração foi suplementado níveis graduais de metionina + cisteina (58:42%) para alcançar 62, 69 e 77% de metionina + cisteína em relação a lisina. A diluição desta dieta de 3060 kcal/kg constituiu principalmente na inclusão de amido de milho, produzindo uma dieta com 20,5% de proteína bruta, contendo todos os aminoácidos numa razão idêntica para com lisina (1 ,12% de lisina digestível verdadeira). Cada tratamento teve 5 repetições com 36 aves (9 aves por m2 ) . Aos 35 dias de idade, 6 aves de cada repetição foram selecionadas ao acaso para avaliação de carcaça. As indinações das curvas de regressão da linhagem Ross foram similares, enquanto que a linhagem Cobb não mostrou a mesma consistência. Na conversão alimentar as linhagens não foram diferentes, mas se observa uma inclinação para a dieta de 20,5% de proteína bruta mostrando uma tendência suave na curva quando comparada com a dieta de 26% de proteína bruta. Uma relação similar foi observada para rendimento de carne de peito. O resultado indica falha devido a deficiência de metionina + cisteína quando expressado em % para satisfazer o ideal, sendo mais pronunciado nas dietas com 20,5% de proteína bruta. / Dose-response relationships of graded methionine + cysteine (Met+Cys) at two ideal protein leveis (IP) were investigated with Cobb X Cobb 500 and Ross X Ross 308 male broilers from 14 to 35 days of age. A com-soybean meal-poultry by product diet was formulated to contain 3.060 kcal/kg and 26% ideally balanced protein (IP) with 1.46%true fecal digestible lysine. The concentration of digestible Met+Cys (58:42%) was 0.73% (65% of the ideal levei). but ali other nutrients met NRC (1994) recommendations. Met+Cys in the ratio of 58:52% were supplemented in graded leveis to achieve 80. 90 and 100% of the ideal Met+Cys content. A dilution diet with 3.060 kcal/kg consisting mainly of comstarch was used to derive diets at 20.5% IP containing ali amino acids in the same ratio to lysine (true fecal digestible lysine of 1.15%). Each treatment had 5 replications of 36 birds (9 birds per m\ At 35 days of age. 6 birds from each replication were randomly selected for carcass evaluation. The data were compared on relative scales (asymptote = 1 00% dig, Met+Cys content in % of ideal concentration). The magnitude of the slope of Ross bird's regression curves was similar, whereas those of Cobb birds did not show the same consistency. There was no difference between strains for feed conversion. but the slope observed for the high IP curves tended to be smaller when compared to the low IP. A similar relationship was observed for breast meat yield. The results indicate that impairments due to Met+Cys deficiency when expressed, as a % of the ideal content is more pronounced in low IP diets.

Dois experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar o desempenho de duas linhagens de frangos de corte (Hybro G e Hybro PG) em duas estações climáticas (verão e inverno), alimentados com dietas formuladas pelo conceito Proteína Bruta (PB) ou Proteína Ideal (PI), de 1 a 42 dias de idade em ambos os sexos. Também foram avaliados os dados de abate, composição da carcaça e análise econômica comparativa entre os dois conceitos. O delineamento utilizado foi um fatorial 2 x 2, com 6 repetições de 20 aves cada. Na análise estatística dos resultados, verificou-se que, nas duas estações climáticas os machos PB consumiram mais que os PI; entre as fêmeas não houve diferença significativa para consumo. No verão as fêmeas PI ganharam mais peso corporal que as PB, para machos não houve diferença no ganho de peso; no inverno machos e fêmeas do PI ganharam mais peso que as aves do conceito PB e, quanto às linhagens, a PG foi superior a G. A conversão alimentar foi melhor para machos do que para fêmeas, principalmente no verão. Para o rendimento de peito as aves PI, a linhagem PG e as fêmeas mostraram-se superiores ao grupo PB, linhagem G e aos machos. A percentagem de gordura abdominal foi maior para fêmeas e para as aves PB. O aminograma evidenciou uma maior quantidade de Met, Lis, M+C e Tre no verão e M+C no inverno, nas carcaças dos machos PI. Na análise econômica dos dois experimentos foi observado que é mais viável a formulação de dietas pelo conceito proteína ideal, e formuladas segundo o respectivo sexo.

Leitões neonatos têm sido criados artificialmente com dietas líquidas apresentando desempenho semelhante ou superior ao obtido em criações naturais. Entretanto, o alto custo de dietas à base de derivados lácteos pode inviabilizar a utilização comercial desta tecnologia. Dois experimentos foram realizados para avaliar a substituição de proteínas do leite por proteínas vegetais em dietas líquidas para leitões. No primeiro experimento, foram testadas quatro dietas: SORO) à base de proteína de soro de leite; PVM1 e PVM2), soro substituído em 31 e 62 % por proteína vegetal modificada e PIS) soro substituído em 62 % por proteína isolada de soja. Foram utilizados 66 leitões, com dois dias de idade. Aos 19 dias de idade, os leitões pesaram entre 6,8 e 8,5 kg, sendo que aqueles dos tratamentos PIS e PVM2 apresentaram maior ganho diário de peso (GDP) (391 g/dia) que os leitões do tratamento SORO (291 g/dia). O consumo diário de matéria seca (CDR) e a eficiência alimentar (EA) também foram maiores para PIS e PVM2 do que para SORO. No geral, SORO apresentou maior digestibilidade ileal aparente de aminoácidos, entretanto PVM2 e PIS consumiram mais aminoácidos essenciais digestíveis, especialmente arginina (Arg) e apresentaram carcaças com menos gordura e maior deposição diária de proteína. No segundo experimento foram utilizados 65 leitões de três dias de idade. Destes, 35 leitões permaneceram com a porca e 30 leitões foram criados artificialmente, recebendo uma das cinco dietas experimentais que variaram na fonte de proteína e no nível de Arg: T1) 70 % PIS, 30% soro e 1,80 % Arg; T2) 40 % PIS, 60 % soro e 1,34 Arg; T3) 53% Soro, 47 % Caseína e 0,84% Arg; T4) idem T3 com 1,34 % Arg; T5) idem T3, com 1,84 % Arg. Aos 21 dias de idade, os leitões que consumiram dietas artificiais pesaram 8,8 kg, 2,6 kg a mais do que os leitões permaneceram mamando na porca. Entre os grupos que consumiram dietas artificiais, o T2 apresentou menor GDP e CDR (329 e 282 g/dia) que os demais (402 e 325 g/dia). As digestibilidades da matéria seca, proteína, gordura e energia foram menores nas dietas com inclusão de proteínas vegetais, e esta diferença foi maior quando calculada pelo método do indicador do que no método de coleta total de fezes. Não foi observada diferença na retenção diária de nitrogênio. Na criação artificial de leitões, o GDP foi muito superior ao observado na criação natural. Tanto a PIS quanto PVM demonstraram ser boas alternativas às proteínas lácteas em dietas para leitões neonatos. Em função do alto consumo de dieta, não foi possível testar o efeito dos níveis de arginina. / Neonatal piglets have been raised artificially using liquid diets with similar or better performance than naturally raised piglets. However, the expensive cost of diets based on milk by-products can make this technology cost prohibitive. Two experiments were executed to evaluate the replacement of milk proteins for vegetable proteins in liquid diets for piglets. In the first experiment, four diets were tested: WHEY) based on whey protein; MVP1 e MVP2), whey replaced in 31 and 62 % by a modified vegetable protein and ISP) whey replaced in 62 % by isolated soy protein. 48 2-day-old piglets were placed in cages individually and fed ad libitum. At 19 days of age, piglets weighted between 6.8 e 8.5 kg and the treatment ISP and MVP2 presented higher average daily gain (ADG, 391 g/day) than treatment WHEY (291 g/day). Daily dry matter intake (DFI) and feed efficiency (FE) were also higher for ISP and MVP2 than for WHEY diet. In general, WHEY diet showed higher ieal apparent digestibility of amino acids but MVP2 and ISP had higher intake of digestible essential amino acids, especially arginine (Arg) and presented less fat carcasses and higher daily protein deposition. In the second experiment, 30 3-day-old piglets were placed individually and received five diets witch changed in protein source and Arg levels: T1) 70 % ISP, 30% whey and 1,80 % Arg; T2) 40 % ISP, 60 % whey and 1,34 Arg; T3) 53% whey, 47 % casein and 0,84% Arg; T4) idem T3 but 1,34 % Arg; T5) idem T3, but 1,84 % Arg. At 21 days of age, piglets fed artificial diets weighted 8.8 kg, 2.6 kg more than sow fed piglets. Among artificially fed groups, T2 presented lower DWG and DFI (329 and 282 g/day) than other groups (402 e 325 g/day). FE was not affected by treatments. Dry matter, protein, fat and energy digestibilities were lower in vegetable protein based diets and this difference was higher using calculation from marker method than total feces collection method. There was no detected difference in daily nitrogen retention. The DWG achieved with artificial rearing system is much superior than DWG achieved with natural rearing system. Both ISP and MVP showed to be good alternatives to replace milk proteins in artificial liquid diets for neonatal piglets. Becouse of the high feed intake our experiment failed in testing the effect of arginine level in the diet.

No Brasil, e em outros paises de clima tropical, os carrapatos se tornaram um enorme problema economico de^$de que a industria do gado se desenvolveu. O carrapato Boophilus microplus, um dos artropodes mais importantes na veterinaria, causa efeitos direto, como suc,cao de sangue, e indireto, como a transmissao de uma grande variedade de patogenos que normalmente resulta em infec,c~es letais. As vacinas genicas contendo o antigeno Bm86, uma proteina ligada a membrana do intestino do carrapato B. microplus, representam uma alternativa atrativa aos acaricidas para controlar as infesta~oes por carrapatos em contrapartida aos inconvenientes produtos quimicos. Devido sua administra,cao ser feita em 4 doses no primeiro ano, seguida de refor,cos a cada seis meses, estas formula,coes vacinais nao s3c adequadas para paises com cria,cao extensiva de gado, como no Brasil. Visando uma libera~ao sustentada do antigeno Bm86, neste trabalho desenvolveuse uma vacina de dose unica baseada em microesferas polimericas. Para obter o padrao de liberac,ao desejavel, diferentes formula,coes e parametros de processo foram variados, como a composi,cao do polimero, a taxa entre os monomeros ^Uacido latico:acido glicolico\" e o tamanho das microparticulas. As formula,coes foram preparadas pelo metodo de emulsao multipla e evapora,cao do solvente. A formula~ao que melhor se enquadrou nos objetivos da vacina de dose unica foi preparada com PLGA 75:25, solu,cao 3% de PVA como estabilizante, agita,cao de 11000 rpm para forma,cao da emulsao primaria e de 800 rpm para forma,cao da emulsao multipla e evapora,cao do solvente. As particulas assim obtidas apresentaram um tamanho medio de 25 ,um, uma taxa de encapsula,cao maior que 90% e aproximadamente 50% da proteina foi liberada in vitro em 60 dias. Analises por SDS-PAGE e Westem Bloning revelaram que a proteina se manteve integra apos encapsula,cao. Os resultados da avalia,cao da imunogenicidade em bovinos mostraram que a formula,cao baseada em microesferas polimericas biodegradaveis e habil a conseguir, com uma unica dose, uma resposta imune similar aquela conseguida com tres doses das formula,coes convencionais da vacina de Bm86. / In Brazil, and in others tropical countries, the ticks have become a huge economic problem since the industry of livestock has developed. Ticks and tick-borne diseases affect animal and human health and are the cause of significant economic losses. The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important arthropods in veterinary. This tick species causes both direct effects, such as blood sucking, and indirect effects, such as transmission of a wide variety of pathogens, which usually result in lethal infections. The gene vaccines based on Bm86 antigen, a midgut membrane-bound protein of the cattle tick B. microplus, represent a good alternative to control tick infestations, compared to chemicals. However, due to these vaccine formulations need 4 doses over the first year with booster at each 6 months to be effective, they are not suitable for countries with extensive cattle raising, like Brazil. Aiming a sustained release of Bm86 antigen, in this work we developed a single shot vaccine based on Bm86 loaded polymeric microspheres. In order to obtain desired release patterns, different formulations and processing parameters were varied, for example, the composition of the polymer, the monomer ratio lactic acid:glycolic acid and the size of the microparticles. The formulations were prepared by solvent evaporation method based on double emulsion. The formulation that presented better result as single shot vaccine was prepared with PLGA 75:25, solution 3% of PVA as stabilizer, agitation of 11000 rpm to form the primary emulsion and 800 rpm to obtain the double emulsion and solvent evaporation. The particles thus obtained presented an average size of 25 m, encapsulation ratio greater than 90% and approximately 50% of the protein was released in vitro in 60 days. Analysis by SDSPAGE and Western Blot showed that the integrity of the protein remained after encapsulation. The immunogenic studies showed that the formulation based onbiodegradable polymeric microspheres is able to elicit, with a single dose, an immune response and protection similar to that attained with 3 doses of conventional Bm86 vaccine formulations.

Leitões neonatos têm sido criados artificialmente com dietas líquidas apresentando desempenho semelhante ou superior ao obtido em criações naturais. Entretanto, o alto custo de dietas à base de derivados lácteos pode inviabilizar a utilização comercial desta tecnologia. Dois experimentos foram realizados para avaliar a substituição de proteínas do leite por proteínas vegetais em dietas líquidas para leitões. No primeiro experimento, foram testadas quatro dietas: SORO) à base de proteína de soro de leite; PVM1 e PVM2), soro substituído em 31 e 62 % por proteína vegetal modificada e PIS) soro substituído em 62 % por proteína isolada de soja. Foram utilizados 66 leitões, com dois dias de idade. Aos 19 dias de idade, os leitões pesaram entre 6,8 e 8,5 kg, sendo que aqueles dos tratamentos PIS e PVM2 apresentaram maior ganho diário de peso (GDP) (391 g/dia) que os leitões do tratamento SORO (291 g/dia). O consumo diário de matéria seca (CDR) e a eficiência alimentar (EA) também foram maiores para PIS e PVM2 do que para SORO. No geral, SORO apresentou maior digestibilidade ileal aparente de aminoácidos, entretanto PVM2 e PIS consumiram mais aminoácidos essenciais digestíveis, especialmente arginina (Arg) e apresentaram carcaças com menos gordura e maior deposição diária de proteína. No segundo experimento foram utilizados 65 leitões de três dias de idade. Destes, 35 leitões permaneceram com a porca e 30 leitões foram criados artificialmente, recebendo uma das cinco dietas experimentais que variaram na fonte de proteína e no nível de Arg: T1) 70 % PIS, 30% soro e 1,80 % Arg; T2) 40 % PIS, 60 % soro e 1,34 Arg; T3) 53% Soro, 47 % Caseína e 0,84% Arg; T4) idem T3 com 1,34 % Arg; T5) idem T3, com 1,84 % Arg. Aos 21 dias de idade, os leitões que consumiram dietas artificiais pesaram 8,8 kg, 2,6 kg a mais do que os leitões permaneceram mamando na porca. Entre os grupos que consumiram dietas artificiais, o T2 apresentou menor GDP e CDR (329 e 282 g/dia) que os demais (402 e 325 g/dia). As digestibilidades da matéria seca, proteína, gordura e energia foram menores nas dietas com inclusão de proteínas vegetais, e esta diferença foi maior quando calculada pelo método do indicador do que no método de coleta total de fezes. Não foi observada diferença na retenção diária de nitrogênio. Na criação artificial de leitões, o GDP foi muito superior ao observado na criação natural. Tanto a PIS quanto PVM demonstraram ser boas alternativas às proteínas lácteas em dietas para leitões neonatos. Em função do alto consumo de dieta, não foi possível testar o efeito dos níveis de arginina. / Neonatal piglets have been raised artificially using liquid diets with similar or better performance than naturally raised piglets. However, the expensive cost of diets based on milk by-products can make this technology cost prohibitive. Two experiments were executed to evaluate the replacement of milk proteins for vegetable proteins in liquid diets for piglets. In the first experiment, four diets were tested: WHEY) based on whey protein; MVP1 e MVP2), whey replaced in 31 and 62 % by a modified vegetable protein and ISP) whey replaced in 62 % by isolated soy protein. 48 2-day-old piglets were placed in cages individually and fed ad libitum. At 19 days of age, piglets weighted between 6.8 e 8.5 kg and the treatment ISP and MVP2 presented higher average daily gain (ADG, 391 g/day) than treatment WHEY (291 g/day). Daily dry matter intake (DFI) and feed efficiency (FE) were also higher for ISP and MVP2 than for WHEY diet. In general, WHEY diet showed higher ieal apparent digestibility of amino acids but MVP2 and ISP had higher intake of digestible essential amino acids, especially arginine (Arg) and presented less fat carcasses and higher daily protein deposition. In the second experiment, 30 3-day-old piglets were placed individually and received five diets witch changed in protein source and Arg levels: T1) 70 % ISP, 30% whey and 1,80 % Arg; T2) 40 % ISP, 60 % whey and 1,34 Arg; T3) 53% whey, 47 % casein and 0,84% Arg; T4) idem T3 but 1,34 % Arg; T5) idem T3, but 1,84 % Arg. At 21 days of age, piglets fed artificial diets weighted 8.8 kg, 2.6 kg more than sow fed piglets. Among artificially fed groups, T2 presented lower DWG and DFI (329 and 282 g/day) than other groups (402 e 325 g/day). FE was not affected by treatments. Dry matter, protein, fat and energy digestibilities were lower in vegetable protein based diets and this difference was higher using calculation from marker method than total feces collection method. There was no detected difference in daily nitrogen retention. The DWG achieved with artificial rearing system is much superior than DWG achieved with natural rearing system. Both ISP and MVP showed to be good alternatives to replace milk proteins in artificial liquid diets for neonatal piglets. Becouse of the high feed intake our experiment failed in testing the effect of arginine level in the diet.

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

Resumo não disponível

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Dois experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar o desempenho de duas linhagens de frangos de corte (Hybro G e Hybro PG) em duas estações climáticas (verão e inverno), alimentados com dietas formuladas pelo conceito Proteína Bruta (PB) ou Proteína Ideal (PI), de 1 a 42 dias de idade em ambos os sexos. Também foram avaliados os dados de abate, composição da carcaça e análise econômica comparativa entre os dois conceitos. O delineamento utilizado foi um fatorial 2 x 2, com 6 repetições de 20 aves cada. Na análise estatística dos resultados, verificou-se que, nas duas estações climáticas os machos PB consumiram mais que os PI; entre as fêmeas não houve diferença significativa para consumo. No verão as fêmeas PI ganharam mais peso corporal que as PB, para machos não houve diferença no ganho de peso; no inverno machos e fêmeas do PI ganharam mais peso que as aves do conceito PB e, quanto às linhagens, a PG foi superior a G. A conversão alimentar foi melhor para machos do que para fêmeas, principalmente no verão. Para o rendimento de peito as aves PI, a linhagem PG e as fêmeas mostraram-se superiores ao grupo PB, linhagem G e aos machos. A percentagem de gordura abdominal foi maior para fêmeas e para as aves PB. O aminograma evidenciou uma maior quantidade de Met, Lis, M+C e Tre no verão e M+C no inverno, nas carcaças dos machos PI. Na análise econômica dos dois experimentos foi observado que é mais viável a formulação de dietas pelo conceito proteína ideal, e formuladas segundo o respectivo sexo.