La memòria que es presenta està composta per dos treballs d'investigació que tot i estar relacionats, formen cadascun un capítol independent. En la primera part del treball s'ha realitzat l'estudi del proteoma de Mycoplasma penetrans mitjançant electroforesis bidimensional i espectrometria de masses. S'ha generat un mapa de referència del proteoma d'aquest patogen humà, que compren els rangs de pH de 4 a 11 en tres finestres, de 4 a 7, de 6 a 9 i de 7 a 11NL (No lineal). Mitjançant tinció especifica s'ha obtingut el fosfoproteoma d'aquest organisme en el rang de pH de 4 a 7, i també s'han determinat els llocs específics de fosforilació de dos proteïnes, un transportador ABC i el Factor de elongació Tu. En la segona part del treball s'ha realitzat l'anàlisi del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliant la informació ja existent sobre el proteoma d'aquest patogen humà. S'ha analitzat el proteoma d'aquest organisme en fase de creixement estacionaria final utilitzant gradients estrets de pH. Per aquest micoplasma també s'ha generat una imatge del fosfoproteoma en el rang de pH de 4 a7, i s'ha pogut, també, determinar el lloc específic de fosforilació d'una proteïna implicada en l'adhesió d'aquest micoplasma, la proteïna P110. / La memoria que se presenta está formada por dos trabajos de investigación que todo y estar relacionados entre si, forman cada uno un capítulo independiente. En la primera parte del trabajo se ha realizado un estudio del proteoma de Mycoplasma penetrans mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Se ha generado un mapa de referencia del proteoma de este patógeno humano, que comprende el rango de pH de 4 a 11 en tres ventanas, de 4 a 7 de 6 a 9 y de 7 a 11NL (no lineal). Mediante tinción específica se ha obtenido el fosfoproteoma de este organismo en el rango de pH de 4 a 7, y también se han determinado los sitios específicos de fosforilación de dos proteínas, un transportador ABC y el Factor de elongación Tu. En la segunda parte del trabajo se ha realizado un análisis del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliando la información ya existente sobre el proteoma de este patógeno humano. Se ha analizado el proteoma de este organismo en la fase de crecimiento estacionaria final utilizando gradientes estrechos de pH. Para este micoplasma también se ha generado una imagen del fosfoproteoma en el rango de pH de 4 a 7, y se ha podido determinar también, el sitio específico de fosforilación de una proteína implicada en la adhesión de este micoplasma, la proteína P110. / The report herein presented is composed of two research works that although they are related, they form an independent chapter. In the first part of this research the proteome of Mycoplasma penetrans has been analyzed using the combination of two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. A proteome reference map of this human pathogen has been constructed including the pH ranges of 4 to 11 in three windows, from 4 to 7, from 6 to 9 and from 7 to 11NL (Non lineal). With a specific phosphoprotein staining method, the phosphoproteome of this microorganism has been obtained in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation sites have been characterized for two proteins, an ABC transporter and the Elongation Factor Tu. In the second part of this research, the proteome of Mycoplasma genitalium has been analyzed, extending the previous information of the proteome of this human pathogen. The proteome of this microorganism has been analyzed in the final stationary growth phase using narrow pH gradients. The phosphoproteome has been also analyzed for this microorganism using the specific phosphoprotein staining in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation site has been characterized in a protein involved in adhesion, the protein P110.

Orientador: Fabio Cesar Gozzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueiredo_AlanadosReis_M.pdf: 3529338 bytes, checksum: 3761ab750ec289d682a00aae3d02ea4b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) desempenha um papel fundamental na proteômica, pois permite a identificação de proteínas, seqüenciamento de peptídeos, determinação de modificações pós-traducionais e análise quantitativa de expressão. Além das análises envolvendo a estrutura primária, há um grande interesse em se aplicar MS para análise de estruturas superiores (terciárias e quaternárias) de proteínas e uma das abordagens promissoras nesta área é a MS acoplada à ligação cruzada. Nesta abordagem, um reagente bifuncional liga covalentemente resíduos de aminoácidos espacialmente próximos e a distância máxima entre esses resíduos é dado pelo tamanho do agente de ligação cruzada (ALC). Nesse trabalho avaliou-se a extensão e exatidão das distâncias interresíduos tanto por simulações de dinâmica molecular quanto por experimentos de MS. As faixas de distâncias calculadas mostram que há sempre uma distância mínima entre resíduos ao qual o ALC pode se ligar, além de determinar o valor máximo para cada um dos ALC estudados (DSG, DSS e DSSeb). Os dados experimentais com proteínas modelo (Ubiquitina, Citocromo C e Mioglobina) mostraram ainda que todos dos peptídeos que apresentavam ligações cruzadas estavam dentro da faixa de alcance determinadas pelas simulações de dinâmica molecular, confirmando a exatidão do método. Os novos valores de tamanho das moléculas de ALC estudados podem agora ser utilizados para a determinação de estruturas superiores de proteínas através da técnica de MS acoplada a ligação cruzada / Abstract: Mass spectrometry (MS) plays a key role in proteomics because it allows the identification of proteins, peptide sequencing, determination of post-translational modifications and quantitative expression analysis. There is a great interest in using MS to perform analysis beyond the primary structure, i. e. tertiary and quaternary structures, and one of the most promising approaches in this filed is MS coupled to cross-linking technique. In this approach, a bifunctional reagent covalently binds amino acid residues that are close in space and the maximum distance between these residues is given by the arm length of the cross-linking agent. In this study we evaluated the extent and accuracy of the inter-residues distances by both molecular dynamics simulations and MS experiments. Simulated distance ranges showed that there is a minimum distance between residues to which the reagent can bind and a maximum value for each of the studied reagents (DSG, DSS and DSSeb). The experimental data from model proteins (Ubiquitin, Cytochrome C and Myoglobin) also showed that all the detected modified peptides were within the ranges determined by the molecular dynamics simulations, confirming the accuracy of the method. The new space arm length values of the reagent molecules can now be used for the determination of proteins higher structures by the MS coupled to cross-linking technique / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

En aquest treball s'han desenvolupat dos mètodes simples i ràpids pel cultiu de les cèl·lules epitelials de les tres regions de l'epidídim de Sus domesticus. Un es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari intactes durant 8 dies. L'altre mètode es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari digerits amb col·lagenasa que, després de 7 dies, donen lloc a la formació d'una monocapa de cèl·lules epitelials epididimàries que adquireixen el 90-100% de confluència després de 12-16 dies en cultiu. Aquestes cèl·lules es mantenen viables durant més de 60 dies en cultiu i no s'observa proliferació de cèl·lules no epitelials. Per determinar el nivell de conservació de les característiques epididimàries en els cultius s'ha analitzat l'estructura cel·lular, l'activitat de síntesi i secreció proteica, i el manteniment i maduració dels espermatozoides en cocultiu. / In this work, we have developed two simple and quick methods for the culture of boar epididymal epithelial cells. The first one involves the culture of intact epididymal tubule fragments during 8 days. The second one involves the culture of epididymal tubule fragments digested with collagenase that, after 7 days in culture, allows the formation of an epididymal epithelial cell monolayer that reached 90-100% confluence after 12-16 days. These epididymal epithelial cells monolayers were maintained in vitro for more than 60 days and overgrowth of non-epithelial cells was not observed. To estimate the level of preservation of epididymal characteristics in these cultures we have focused on cell morphology, protein secretion activity, and sperm preservation and maturation.