Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No Hospital São Paulo, um hospital terciario de 600 leitos, a presenca de P. aeruginosa produtora de metalo-β-lactamase tem sido encontrada desde 2000 (a primeira, SPM-1, foi isolada em 1997). Durante a periodo entre 2000 e 2001, 25 das 128 amostras avaliadas produziam SPM au IMP (88 por cento e 12 por cento das P. aeruginosa resistentes a imipenem, respectivamente). Durante o ano de 2004, as 10 primeiras amostras consecutivas de P. aeruginosa isoladas par mes foram selecionadas para a producao de MβL. Um total de 120 isolados foram submetidas ao teste de hidro1ise contra imipenem, PCR para a identificacao do gene de MβL seguido de sequenciamento de DNA. Todos as isolados produtores de IMP foram avaliados para a presenca de integrons de c1asse 1. A similaridade genetica dos isolados produtores de MβL foram avaliados pelo PFGE. Entre os 120 isolados de P. aeruginosa, 46 (38,1 por cento) foram capazes de hidrolizar imipenem. 0 sequenciamento dos amplicons demonstrou que 20 por cento dos 80 por cento dos isolados de P. aeruginosa carreavam blaIMP-1 e blaSPM-1, respectivamente. Todos os isolados produtores de IMP-1 pertenciam ao mesmo clone, enquanto os isolados produtores de SPM-1 apresentaram uma grande diversidade genetica. A analise dos dados c1inicos dos pacientes que apresentaram infeccao por P. aeruginosa mostrou que a urina parece ter um papel importante na aquisicao de P. aeruginosa resistentes a carbapenemicos no Hospital São Paulo e que o uso previa de carbapenemicos e um fator de risco importante na aquisicao de amostras produtoras de MI3L. Os dados sugerem que as medidas de prevencao de disseminacao de P. aeruginosa carreadoras de MβL no Hospital São Paulo no ano de 2004 foram ineficazes / At Hospital São Paulo, a 600-bed tertiary care university hospital, the presence of metallo-β-lactamase producing P. aeruginosa has been detected since 2000 (the first strain, a SPM producer, was isolated in 1997). During the 2000-2001 period, 25 of 183 evaluated strains produced SPM or IMP (88% and 12% of the imipenem-resistant P. aeruginosa, respectively). During 2004, the 10 first consecutive imipenem resistant P. aeruginosa strains isolated monthly were screened for the production of MβL. A total of 120 isolates were submitted to hydrolysis test against imipenem, PCR for described MßL genes, and DNA sequencing. IMP-producing isolates were further evaluated with primers targeting class 1 integrons. The genetic relatedness of MßL-producing isolates was evaluated by PFGE. Among the 120 P. aeruginosa isolates, 46 (38,1%) were able to hydrolyze imipenem. Sequencing of the amplicons showed that 20% and 80% of the P. aeruginosa isolates carried blaIMP-1 and blaSPM-1, respectively. All IMP-1-producingisolates belonged to the same genotype, while the SPM-1-producing isolates showed a great genetic diversity. Analysis of the clinical data of patients with P. aeruginosa infections reveals that the urinary site seems to be important in the acquisition of carbapenem-resistant P. aeruginosa at Hospital São Paulo and that the previous use of carbapenens is an important risk factor for the acquisition of MßL-producing strains. These data show that the nosocomial infection control measures for prevention of dissemination of P. aeruginosa carring MßL in patients hospitalized at Hospital São Paulo in 2004 were not effective. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10895.pdf: 1239975 bytes, checksum: fe176974c14d400d198cabc963cd2f6c (MD5) / Introducao: No Brasil, a disseminacao de um clone endemico de P. aeruginosa produtor de SPM-1, uma metalo-ƒÀ-lactamase (MƒÀL) codificada por um plasmideo, tem sido frequentemente reportada. Recentemente, uma alta variedade genomica foi observada entre os isolados de P. aeruginosa produtores de SPM-1. Assim, os principais objetivos deste trabalho foram realizar a implantacao da metodologia MLST para tipagem molecular destes microrganismos em nosso laboratorio e dessa forma caracterizar a evolucao filogenetica do clone de P. aeruginosa produtor da MƒÀL SPM-1; comparar o poder discriminatorio e a reprodutibilidade desta tecnica com as tecnicas de PFGE e ribotipagem automatizada para tipagem molecular de P. aeruginosa e avaliar a capacidade do MLST de discriminar amostras que foram classificadas sob ribogrupos distintos, mas com padroes de PFGE identicos. Metodos: Um total de 50 amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 foram coletadas de nove centros brasileiros. Tres amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP-1 e duas amostras de P. aeruginosa nao produtoras de MƒÀL foram incluidas no estudo. A tecnica de MLST foi padronizada conforme descrito por Curran et al. As sequencias obtidas foram comparadas com as existentes no banco de dados mundial de MLST para P. aeruginosa (www.pubmlst.org/paeruginosa) para que dessa forma fosse determinado o perfil alelico e, subsequentemente, o tipo de sequencia (ST). Para a analise filogenetica foi utilizado o metodo de Jukes-Cantor e Neighbor-Joining. Um total de cinco STs foram identificadas entre as 55 amostras de P. aeruginosa estudadas. Todos os isolados de P. aeruginosa produtores de SPM-1 apresentaram perfil alelico identico e, dessa forma, receberam a mesma ST (ST277), com excessao dse uma amostra proveniente de Belo Horizonte, a qual recebeu a ST235. As tres amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP-1 foram classificadas sob a mesma ST (ST593), enquanto que as amostras nao produtoras de MƒÀL apresentaram perfis alelico ainda nao existentes no banco de dados, e assim, duas novas STs foram criadas para estas amostras (ST594 e ST595). O clone endemico brasileiro de P. aeruginosa produtor de SPM-1 (ST277) mostrou perfil alelico identico ao de uma cepa isolada na Austria (ID 275), em setembro de 2006. Variacao em um unico locus da ST277 foi encontrada em uma amostra proveniente da Austria (ID279), isolada em janeiro 2007. Similaridade entre cinco dos sete alelos foi encontrada entre as amostras deste estudo pertencentes a ST277 e uma amostra isolada no Canada (ID 148), em 1990. Conclusao: Nossos dados sugerem que as amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 descendem de um ancestral comum e que podem possuir relacao ancestral com os isolados da Austria e mais remotamente com a amostra do Canada / TEDE

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A Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes etiológicos de infecções nosocomiais em todo o mundo. A resistência aos antimicrobianos é um problema crescente na prática clínica, particularmente, com P. aeruginosa, devido a múltiplos mecanismos de resistência intrínseca e extrínseca. Como há uma escassez de novos antibióticos para o tratamento de bacilos Gram-negativos, particularmente com ação anti-Pseudomonas, houve a necessidade de resgatar antigos antibióticos, como as polimixinas. Não existem ensaios clínicos randomizados avaliando a eficácia das polimixinas contra as bactérias multirresistentes. Estes sugerem que as polimixinas tenham eficácia aceitável, porém há limitações que impedem de chegar a uma conclusão definitiva, como a co-administração de outros antibióticos e a falta de um grupo controle. Existem alguns estudos comparativos com colistina (polimixina E) e outros antibióticos. Apenas um estudo comparou ambas polimixinas (B e E) com outros antimicrobianos para o tratamento de diversas infecções causadas por Acinetobacter baumannii. As bacteremias são infecções graves com alta mortalidade e vários estudos já demonstraram que quando são causadas por P. aeruginosa a morbi-mortalidade é bastante importante. Neste estudo comparamos a eficácia da polimixina B endovenosa com outros antibióticos para o tratamento de bacteremia por Pseudomonas aeruginosa. Um total de 255 pacientes tiveram pelo menos um episódio de bacteremia, mas apenas 133 pacientes puderam ser incluídos no estudo. Vários pacientes foram excluídos porque foram ao óbito em menos de 48 horas após a coleta das hemoculturas ou receberam menos que 48 horas de tratamento. Pode-se certamente deduzir daí a gravidade deste tipo de infecção. Este estudo é o primeiro acessando a eficácia da polimixina B contra antibióticos comparadores e o primeiro a acessar apenas infecções bacterêmicas. Os pacientes tratados com polimixina B começaram tratamento apropriado mais tarde que o grupo comparador, mas esta variável não foi estatisticamente significativa. Nós também demonstramos que a terapia com polimixina B foi associada a uma maior incidência de toxicidade renal do que os antibióticos comparados (11/45, 24,4% versus 4/88, 4,5%) assim como foi mostrado num recente estudo de coorte comparativo e sugerido em outros estudos anteriores. Nosso estudo mostrou que o tratamento da bacteremia por P. aeruginosa com polimixina B tem menor eficácia, demonstrado por apresentar maior mortalidade hospitalar, comparado com outros antibióticos, 66,7% (30/45) e 28,4% (25/88), respectivamente. O risco de mortalidade hospitalar foi quase o dobro para os pacientes tratados com polimixina B. Embora não demonstrado no nosso estudo, a optimização da dosagem da polimixina B poderia diminuir este efeito prejudicial.

A Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes etiológicos de infecções nosocomiais em todo o mundo. A resistência aos antimicrobianos é um problema crescente na prática clínica, particularmente, com P. aeruginosa, devido a múltiplos mecanismos de resistência intrínseca e extrínseca. Como há uma escassez de novos antibióticos para o tratamento de bacilos Gram-negativos, particularmente com ação anti-Pseudomonas, houve a necessidade de resgatar antigos antibióticos, como as polimixinas. Não existem ensaios clínicos randomizados avaliando a eficácia das polimixinas contra as bactérias multirresistentes. Estes sugerem que as polimixinas tenham eficácia aceitável, porém há limitações que impedem de chegar a uma conclusão definitiva, como a co-administração de outros antibióticos e a falta de um grupo controle. Existem alguns estudos comparativos com colistina (polimixina E) e outros antibióticos. Apenas um estudo comparou ambas polimixinas (B e E) com outros antimicrobianos para o tratamento de diversas infecções causadas por Acinetobacter baumannii. As bacteremias são infecções graves com alta mortalidade e vários estudos já demonstraram que quando são causadas por P. aeruginosa a morbi-mortalidade é bastante importante. Neste estudo comparamos a eficácia da polimixina B endovenosa com outros antibióticos para o tratamento de bacteremia por Pseudomonas aeruginosa. Um total de 255 pacientes tiveram pelo menos um episódio de bacteremia, mas apenas 133 pacientes puderam ser incluídos no estudo. Vários pacientes foram excluídos porque foram ao óbito em menos de 48 horas após a coleta das hemoculturas ou receberam menos que 48 horas de tratamento. Pode-se certamente deduzir daí a gravidade deste tipo de infecção. Este estudo é o primeiro acessando a eficácia da polimixina B contra antibióticos comparadores e o primeiro a acessar apenas infecções bacterêmicas. Os pacientes tratados com polimixina B começaram tratamento apropriado mais tarde que o grupo comparador, mas esta variável não foi estatisticamente significativa. Nós também demonstramos que a terapia com polimixina B foi associada a uma maior incidência de toxicidade renal do que os antibióticos comparados (11/45, 24,4% versus 4/88, 4,5%) assim como foi mostrado num recente estudo de coorte comparativo e sugerido em outros estudos anteriores. Nosso estudo mostrou que o tratamento da bacteremia por P. aeruginosa com polimixina B tem menor eficácia, demonstrado por apresentar maior mortalidade hospitalar, comparado com outros antibióticos, 66,7% (30/45) e 28,4% (25/88), respectivamente. O risco de mortalidade hospitalar foi quase o dobro para os pacientes tratados com polimixina B. Embora não demonstrado no nosso estudo, a optimização da dosagem da polimixina B poderia diminuir este efeito prejudicial.

Identifica los tipos de RL contenidos en las bandas de un halo revelado en agar CTAB/MB. Desarrolla una técnica para extraer RL a partir del agar CTAB/MB implementando, además, una metodología de superficie de respuesta Box-Behnken que maximizó las separaciones entre las 4 bandas de un patrón de RL producidos por P. aeruginosa 6K-11. Identifica, mediante UPLC-MS/MS, 9 congéneres de RL en la banda 1 (RC8C10, RC10C8, RC10C10, RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10, RRC10C12:1, RRC12C10 y RRC10C12), 7 en la banda 2 (RC8C10, RC10C8, RC10C10, RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10 y RRC10C12:1), 4 en la banda 3 (RC10C10, RRC8C10, RRC10C8 y RRC10C10) y 3 en la banda 4 (RRC8C10, RRC10C8, RRC10C10). La estructura molecular es probablemente el factor más importante en la migración de los RL puesto que se observa que la relación de la presencia de isómeros se mantiene en las cuatro bandas. Además de existir predominancia de diRL. Concluye que la cantidad y la diversidad de tipos de RL disminuye en la migración de cada banda según su complejidad estructural (cantidad de ramnosas, isomería y masa) lo que comprueba las diferencias en cuanto a composición química y abundancia de los RL que se encuentran dentro de cada banda. / Tesis

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal producidos por microorganismos, principalmente del dominio bacteria. Las bacteriocinas producidas por bacterias Gram positivo o Gram negativo, presentan una actividad tóxica sobre especies bacterianas estrechamente relacionadas con la bacteria productora. Para ejercer su acción antimicrobiana las bacteriocinas utilizan receptores específicos localizados exclusivamente en la bacteria blanco, por lo tanto raramente se observa actividad citotóxica sobre células eucariontes. No obstante, algunas bacteriocinas inhiben específicamente el crecimiento de líneas celulares neoplásicas. Debido a estas propiedades, las bacteriocinas tienen una potencial aplicación biotecnológica por su posible uso como alternativa a los tratamientos con antibióticos tradicionales, o como nuevos antibióticos contra patógenos multirresistentes, como preservantes o desinfectantes en la industria alimenticia, y en el área biomédica como antineoplásicos para combatir algunos tipos de cáncer. En nuestro laboratorio encontramos un nuevo compuesto antimicrobiano del tipo bacteriocina producido por la cepa de Pseudomonas aeruginosa O400, al que hemos denominado gicina A. Este compuesto es capaz de inhibir, selectivamente, el crecimiento de bacterias Gram positivo. Debido a que no existen informes en la literatura de bacteriocinas producidas por bacterias Gram negativo que presenten actividad antimicrobiana solamente sobre bacterias Gram positivo, el estudio del mecanismo de acción y las propiedades bioquímicas de gicina A constituye un valioso aporte en la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas. El objetivo general de esta tesis fue “Purificar, caracterizar bioquímicamente, y evaluar tanto el mecanismo de acción antibacteriano de gicina A, como su toxicidad in vitro sobre líneas celulares eucariontes”. Para lograr este objetivo se realizó la purificación de gicina A mediante cromatografías en columnas hidrofóbicas y HPLC. Mediante electroforesis de proteínas y espectrometría de masas se determinó que esta proteína tiene una masa molecular de 7925 Da. La evaluación de sus propiedades bioquímicas demostró que la actividad de gicina A es estable a un amplio rango de temperaturas, conserva su actividad al ser solubilizada en una amplia gama de solventes y presenta una mayor actividad al ser solubilizada a un pH neutro. Por otra parte empleado gicina A purificada se confirmó que esta posee una actividad antibacteriana selectiva por bacterias Gram positivo. Estudios de alteración de la cinética de crecimiento de la bacteria blanco y ensayos de microscopía de fluorescencia indicaron que gicina A posee un efecto bactericida sobre bacterias Gram positivo y que este efecto es producido por una permeabilización en la membrana celular. La evaluación de la citotoxicidad in vitro de gicina A sobre células eucariontes mostró que esta bacteriocina ejerce una leve toxicidad en las líneas de origen tumoral, sin embargo no se observó efecto citotóxico sobre las líneas celulares no tumorales. / Bacteriocins are antimicrobial peptides ribosomally synthesized produced by microorganisms, mainly from Bacteria domain. Bacteriocins produced by Gram positive or Gram negative bacteria, present a toxic activity on bacterial species closely related to the bacteriocin producing bacteria. To exert its antimicrobial action, bacteriocins use specific receptors exclusively located in the target bacteria, therefore rarely cytotoxic activity on eukaryotic cells can be observed. However, some bacteriocins specifically inhibit growth of neoplastic cell lines. Because of these properties, bacteriocins have a potential for biotechnological application for its possible use as an alternative to the traditional antibiotic treatments, or as new antibiotics against multi-resistant pathogens, also as preservatives or disinfectants in food industry, and in biomedical field as antineoplastics. In our laboratory we have found a new antibacterial compound with bacteriocin properties produced by the Pseudomonas aeruginosa O400 strain, which we called gicin A. This compound is able to selectively inhibit the growth of Gram positive bacteria. Because there are no reports in the literature of bacteriocins produced by Gram negative bacteria that have antimicrobial activity only on Gram-positive bacteria, the study of the mechanism of action and biochemical properties of gicin A is a very valuable contribution to the search of new antimicrobial substances. The overall aim of this thesis was to “Purify, characterize biochemically, and assess both the antibacterial action mechanism of gicin A, and its in vitro toxicity on eukaryotic cell lines”. To achieve this objective the purification of gicin A was performed by a hydrophobic column chromatography and HPLC. Protein electrophoresis and mass spectrometry determined that this protein has a molecular mass of 7925 Da. The evaluation of its biochemical properties showed that the activity of gicin A is stable at a wide temperature range, it retains its activity when is solubilized in a wide range of solvents and has a higher activity when is solubilized at a neutral pH. Moreover, employing purified gicin A was confirmed that it has a selective antibacterial activity against Gram positive bacteria. Alteration studies of the growth kinetics of the target bacteria and fluorescence microscopy indicated that gicin A has a bactericidal effect on Gram positive bacteria and that this effect is produced by cell membrane permeabilization. The evaluation of cytotoxicity in vitro of gicin A on eukaryotic cells shows that this bacteriocin has a mild toxicity on tumoral origin cell lines, however we noticed no cytotoxic effect on non tumoral origin cell lines.

Please read the abstract in the section 00front of this document / Dissertation (MSc(Microbiology))--University of Pretoria, 2005. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

The nature of the reserves of Pseudomonas aeruginosa that are oxidized during endogenous respiration was studied by following the changes in the chemical constituents and in the distribution of radioactivity of starving cells that had been grown on C¹⁴-labeled substrates. The total protein and nucleic acid of cell suspensions decreased during starvation. Deoxyribonucleic acid increased slightly, whereas ribonucleic acid decreased. C¹⁴O₂ was evolved from endogenously respiring cells specifically labeled in the nucleic acid fraction and from cells specifically labeled in the protein fraction. Chemical fractionation of C¹⁴-labeled cells showed a decrease in hot trichloroacetic acid-soluble and insoluble compounds, indicating that the C¹⁴O₂ arose from the degradation of RNA and protein and not from free pool compounds. A decrease in ribosomal RNA and protein was evident from physical fractionations of starved labeled cells. An enzyme responsible for the initiation of ribosomal degradation was found to be associated with the ribosome fraction and was identified as polynucleotide phosphorylase. The enzyme was inactive in high magnesium concentrations but was active under conditions which allowed the dissociation of the large ribosomal units into 50S and 30S components. Polynucleotide phosphorylase was not solubilized by the dissociation of the 70S ribosomes but remained firmly attached to the 50S subunit. The oxidation of exogenous substrates resulted in varying degrees of suppression of the oxidation of endogenous RNA and this suppression was attributed to the relative stabilizing effect that the exogenous substrates exerted on the ribosomes. The oxidation of endogenous protein was depressed during the oxidation of exogenous glucose, aspartic acid and adenosine and was increased during the oxidation of α-ketoglutaric acid. The response of endogenous respiration to the oxidation of exogenous substrates appeared to be related to a requirement for ammonium ions for assimilation of carbon. / Land and Food Systems, Faculty of / Graduate

The non-phosphorylated oxidative pathway of glucose dissimilation has been established in Pseudomonas aeruginosa and evidence for phosphorylated pathways, other than the Embden-Meyerhof scheme, has been obtained. In the present study the non-phosphorylated and phosphorylated pathways of glucose degradation have been investigated with cell-free extracts of this organism. Gluconolactone was shown to be an intermediate in the oxidation of glucose to gluconic acid. The enzymatic hydrolysis of the lactone ring has an absolute magnesium ion, or divalent cation requirement. In the presence of phosphate buffer magnesium was chelated and effectively removed from participation in the enzymatic reaction. As has been reported in the literature, the product of glucose and gluconic acid oxidation was identified as 2-ketogluconate. In the presence of adenosine triphosphate (ATP), glucose and gluconate are phosphorylated and the kinases involved, therefore, link the non-phosphorylated with the phosphorylated pathways. The demonstration of triphosphopyridine nucleotide (TPN) linked dehydrogenases for glucose-6-phosphate and 6-phosphogluconate, as well as the production of glucose-6-phosphate and 3-phosphoglyceraldehyde from cell-free extracts with gluconate or ribose plus ATP, illustrated the presence of a functional pentose phosphate cycle in this organism. An active 6-phosphogluconate dehydrase and a 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase were demonstrated by the production of pyruvic acid from 6-phosphogluconate and indicated the presence of the Entner-Doudoroff pathway. The oxidation of 3-phosphoglyceraldehyde to 3-phosphoglyceric acid initiated by a TPN specific 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase, and the conversion of phospho-enol-pyruvate to pyruvic acid was shown. It is suggested that the trioses are immediately concerned in the observed CO₂ fixation by this organism. Fructose-1,6-diphosphate aldolase, fructose-1,6-diphosphate phosphatase and phosphohexoisomerase may be involved in the formation of glucose-6-phosphate from triose phosphates. A direct link between 2-ketogluconate and the phosphorylated pathways could not be shown but the reduction of the phosphate ester of the compound was demonstrated. The feasibility of 2-ketogluconate undergoing a 3:3 split is presented. No attempt has been made to estimate the relative importance of the various pathways of glucose dissimilation as it is felt that this is determined by the conditions and stages of growth of the organism. / Land and Food Systems, Faculty of / Graduate