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Durante a gestação, em varias espécies de mamíferos, os fibroblastos endometriais são alvos de profundas modificações morfofuncionais que levam a aquisição de um fenótipo epitelial e à expressão de novas moléculas, formando uma nova estrutura no útero denominada decídua. Em camundongos, a reação decidual pode ser estimulada artificialmente (na ausência de embrião), resultando na formação do deciduoma, um modelo de grande relevância para a identificação de fatores oriundos ou não do embrião necessários para a promoção da decidualização. A decidualização também promove uma profunda remodelação da matriz extracelular (MEC) do endométrio, e ambos os processo são fundamentais para o sucesso da gestação. Existem evidencias, muitas das quais são oriundas dos estudos do Laboratório de Biologia da Reprodução e Matriz extracelular (LBR-MEC), mostrando que a remodelação da MEC do útero não grávido é modulada pelos hormônios ovarianos estrógeno (E2) e progesterona (P4). Faltam, entretanto, na literatura, estudos consistentes sobre a regulação da MEC endometrial na ausência de sinais parácrinos provenientes do embrião. Além disso, não se conhece detalhes sobre a ação dos hormônios ovarianos sobre a produção de componentes da MEC por células deciduais. Nesse contexto, o presente estudo teve dois objetivos centrais: (i) caracterizar por imuno-histoquímica a composição e organização da MEC durante o desenvolvimento do deciduoma, (ii) estudar por qPCR, Western blot, e imunolocalização o efeito dos hormônios E2 e Medroxiprogesterona (MPA) na dinâmica da expressão de RNAm, síntese e secreção de moléculas da MEC em culturas primárias de células obtidas de deciduoma. Observamos que, a distribuição do colágeno tipo I, III, IV, V e dos proteoglicanos decorim, biglicam e versicam no deciduoma, foi semelhante ao já observado na decídua. As análises in vitro, mostram que o hormônio E2 aumenta a expressão gênica, a síntese e a deposição de decorim enquanto o MPA tem como alvo o biglicam. Ambos hormônios modulam a expressão de desmina, um marcador de decidualização. O presente estudo também mostra que o padrão de remodelação das moléculas alvo do presente estudo, é similar ao observado durante a decidualização da gestação normal, Conclui-se, portanto, que a remodelação da MEC é um evento intrínseco do processo de decidualização quer na gestação quer na pseudogestação. Ou seja, não foram identificadas diferenças que indicassem a existência de controle pelo embrião. Mostramos ainda que, in vitro, os hormônios E2 e MPA regulam de modo específico a expressão gênica e a secreção do proteoglicanos decorim e biglicam. / During pregnancy in several species of mammals, including humans and mice, endometrial fibroblasts undergo extensive morphofunctional changes acquiring an epithelial phenotype. Those new cells form a new structure in the uterus called decidua. In mice, the decidual reaction can be artificially induced in pseudopregnant females resulting in the formation of a structure morphologically similar to the decidua called deciduoma, a relevant model to study the putative role of the embryo upon decidualization. Endometrial decidualization is an essential event for the success of pregnancy. A notable remodeling of the extracellular matrix (ECM) organization and molecular composition occurs during this process. There are evidences, many of them coming from studies of the Laboratory of Reproductive and Extracellular Matrix Biology (LBR-MEC), that estrogen (E2) and progesterone (P4) modulate the remodeling of the uterine ECM. Nevertheless, there is no consistent information about the role, if it exists, of the embryo on the regulation of the endometrial ECM. Furthermore, it was not yet clarified how the ovarian hormones act on the production of ECM components by decidual cells. Thus, the objective of present study was to identify the composition and organization of the ECM during the development of the mouse deciduoma; and to study by qPCR, Western blot and immunolocalization methods, the effect of hormones E2 and medroxiprogesterone (MPA) on synthesis and secretion of ECM molecules by primary cultures of mouse decidual cells obtained from deciduoma. We found that the distribution of collagen types I, III, IV, V and proteoglycans decorin, biglycan and versican in deciduoma, was similar to that previously observed in the decidua. The in vitro assays showed E2 increases the gene expression for the core protein of Decorin, while MPA increases the expression of the core protein of Biglycan. In addition, was observed that both hormones increase the expression of desmin a marker of decidualization. These results showed that in the endometrium of both pregnant and pseudopregnant animals ECM molecules such as collagens and proteoglycans are similarly modulated by ovarian hormones. At from the present study we may conclude that ECM remodeling is an intrinsic event that happens during decidualization modulated by E2 and MPA and this modualation independ of the presence of the embryo in the uterus. In adition we showed that in decidual cells in vitro the gene expression and the secretion of proteoglycans decorin and biglycan are differentially regulated by hormones E2 and MPA.

Orientador: Áureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T23:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianco_JuaresEdnaldoRomero_D.pdf: 17105644 bytes, checksum: 64a116dab9ebcd72e51d45d800243157 (MD5) Previous issue date: 2018-08-16T20:37:19Z / Resumo: As células Natural Killer uterinas (uNK) participam da interação materno fetal atuando ativamente como elemento imuno-modulador do micro-ambiente uterino na gestação bem sucedida. Apesar das uNK possuírem um potencial lítico, relacionado com a sua resposta imune inata, este não se manifesta em uma gestação normal. Por outro lado, diversos relatos sugerem o envolvimento destas células em abortos e interrupções da gestação. No presente trabalho, foi avaliado o possível envolvimento das células uNK em atividade citotóxica sob a influência "in loco" do líquido amniótico no útero pseudogestante de camundongos. Para tanto, camundongos fêmeas foram acasaladas com machos vasectomizados, e os cornos uterinos injetados com óleo mineral para indução do útero pseudogestante. O líquido aminótico coletado em condições assépticas dos sítios de desenvolvimento embrionário normal no 10° dia de gestação (dg), foi inoculado no volume constante de 3uL através de micro-injeção na parede uterina da região antímesometrial nosnódulos de decidualização dos animais no 9o dia de pseudogestação (dpg). Amostras dos sítios inoculados com líquido amniótico foram coletadas nos intervalos de 30 minutos, 1, 2 e 6 horas para análises morfológicas, citoquímicas, imunocitoquímicas, imunoquímica e expressões gênicas. Como controles, foram utilizados úteros gestantes normais no 8o dg e úteros pseudogestantes submetidos à introdução de agulha hipodérmica na parede do corno uterino e/ou inoculados com 3uL de solução fisiológica estéril.Pelas análises morfológicas realizadas em cortes histológicos avaliados pela coloração de hematoxilina-eosina, o endométrio decidualizado da região mesometrial e antímesometrial do útero pseudogestante inoculado com salina ou simples introdução da agulha hipodérmica não apresentaram variações. Igualmente, a morfologia das células uNK através da citoquímica com lectina DBA, não apresentou diferenças entre os grupos controles. Ainoculação de LA no útero pseudogestante promoveuhiperemia local após 30 minutos que, em cortes histológicos, foi constatada como estagnação do sangue e dilatação dos vasos venosos no endométrio. Nestes locais foram constatadas alterações degenerativas nas células uNK com perda de reatividade da superfície celular e no conteúdo dos grânulos através da lectina DBA. A análise immunocitoquímica, RT-PCR e ELISA para as citocinas IFN-y e TNF-a e, das proteínas perforina e granzima-A revelaram que, o líquido amniótico acentuava a expressão destas moléculas ou dos seus genes relacionados à resposta pró-inflamatória, enquanto não alteravam a expressão de moléculas anti-inflamatórias como a IL-10. A geração do óxido nítrico (NO), através da quantificação de nitrato e nitrito, demonstrou um aumento nas concentrações, principalmente do nitrito após a inoculação do líquido amniótico. O teste de TÚNEL e a imunocitoquímica para anti-caspase-3 revelaram aumento de marcações positivas nas células uNK e deciduais sob o efeito do líquido amniótico em relação aos grupo controles, enquanto se verificava uma relação inversa para a imunocitoquímica com o anti-PCNA aos 2 a 6 horas após líquido amniótico. O conjunto dos resultados obtidos comprovam que as células uNK são sensíveis à ação local do líquido amniótico, com padrão de resposta compatível à ativação da sua capacidade citotóxica e pró-inflamatória relacionada com a resposta imune inata. / Abstract: Uterine Natural Killer (uNK) cells participate on the maternal fetus interaction actively playing as a immunomodulator element of the uterine micro-enviroment during a well successful gestation. Despite uNK having a lytic potencial that is related to its innate immune responsive, this does not manifest in a normal gestation. Moreover, several reports suggest the involvement of these cells in abortions and interruptions of gestation. In this study, we investigated the possible involvement of uNK cells in cytotoxic activity under the influence "in loco" of amniotic fluid in the uterus of mice pseudopregnant. For this, female mice were mated with vasectomized males and the uterine horns injected with mineral oil for induction of the pseudopregnant uterus. The amniotic fluid collected aseptically from sites of normal embryonic development in the 10 th day of gestation (dg) was inoculated on the constant volume of 3ul_ through microinjection on the uterine wall in the antimesometrial region into uterine nodules from animals on the 9th day of pseudopregnancy (dpg). Samples of inoculated sites with amniotic fluid were collected at intervals of 30 minutes, 1, 2 and 6 hours for morphological, cytochemical, immunocytochemical, immunochemical and relative gene expressions analyses. As controls, normal pregnant uteri on the 8th dg, and uterus on 9th dpg were submitted to the introduction of a hypodermic needle into the wall of the uterus and/or inoculated with 3uL of sterile saline.For the morphological analysis performed on histological sections evaluated by hematoxylin-eosin, the decidualized endometrium of the mesometrial and antimesometrial regions of the pseudopregnant uterus were inoculated with saline or simple introduction of the hypodermic needle showed no variations. Also, the morphology of uNK cells by DBA lectin cytochemistry, evidenced no differences among control groups.The amniotic fluid inoculation on the pseudopregnant uterus promote Hyperaemia after 30 min, in histological slides that was observed as blood interruption flow and dilatation of the vessels on the endometrium. On these areas it was observed degenerative modifications on uNK cells with loss in the positive reaction to DBA lectin in the cellular membranes and in the granules.The immunocytochemical analysis, RT-PCR and ELISA for the cytokines IFN-y and TNF-a, and the perforin and granzyme-A protein revealed that the amniotic fluid enhanced the expression of these molecules or their genes related to pro-inflammatory response, while not altering the expression of anti-inflammatory molecules such as IL-10.The generation of nitric oxide (NO), was observed through the quantification of nitrate and nitrite that demonstrated an increase in concentrations, primarily of nitrite after inoculation of amniotic fluid.The TUNEL assay and immunocytochemistry for anti-caspase-3 revealed an increase on positive uNK and decidual cells under the effect of amniotic fluid in relation to the control group, while there was an inverse relationship to immunocytochemistry with anti-PCNA at 2 and 6 hours after the amniotic fluid. The overall results show that uNK cells are sensitive to local action of amniotic fluid, compatible with standard response to the activation of their cytotoxic and proinflammatory that are related to the innate immune response. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:18:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianco_JuaresEdnaldoRomero_M.pdf: 23225852 bytes, checksum: 523781fa325c40e61fa0fe33c59406a1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante o período peri-implantacional na gestação de humanos e roedores, ocorre no estroma da mucosa uterina um conjunto de fenômenos que envolvem modificações dos componentes celulares e da matriz extracelular. Este conjunto de modificações é conhecido como decidualização ou reação decidual. Concomitante a este processo ocorre a migração de leucócitos provenientes de órgão hematopoéticos para este estroma. Dentre estes leucócitos predominam as subpopulações de linfócitos denominados de células ¿uterine Natural Killer¿ (uNK), que atuam na gestação reconhecendo o embrião alogeneico, modulando a reação decidual e o crescimento placentário. Porém, a sua participação nos casos de aborto e o possível desencadeamento do potencial lítico e citotóxico relacionado com a resposta imune inata, não foi ainda totalmente elucidado. O presente trabalho buscou desenvolver estratégias para o estudo in situ das células uNK, sem a influência de fatores oriundos do embrião, empregando o modelo da pseudogestação em camundongos. Foram utilizados fêmeas pseudogestantes obtidos através do acasalamento com machos vasectomizados e inoculação intraluminal do óleo vegetal (arachis) ou mineral (nujol) no útero de 4° dia de pseudogestação (dpg). Estes animais pseudogestantes foram subdivididos em grupos submetidos ou não a ovarectomia e com suplementação hormonal de estrógeno e/ou progesterona ou hormônio gonadotrófico coriônico (hCG). Foram coletados o útero e ovário e processados para análise em microscopia de luz e eletrônica de transmissão no 9°, 12° e 14° dpg. Fêmeas em gestação normal foram utilizados como grupo controle. As análises histológicas, citoquímicas e ultra-estruturais efetuadas demonstraram que a indução da pseudogestação com emprego tanto de óleo vegetal (arachis) quanto de óleo mineral resultam na reação decidual e presença de células uNK lectina DBA (Dolichos biflorus) positivas. A reação decidual resultante e mais exuberante com o óleo de arachis, porém, o período de manutenção do deciduoma é menor, mesmo com a suplementação hormonal de progesterona, se comparado ao grupo de animais induzidos com o óleo mineral e suplementada com HCG. As características morfológicas das células uNK foram melhor preservadas nos animais pseudogestantes induzidos com o óleo mineral, não ovarectomizados e suplementados com o HCG.Nestes, as células uNK foram encontradas aém do 12° dpg em meio ao endométrio que mantinha o deciduoma, enquanto nos demais grupos o deciduoma era destituído antes do 12º dpg. Porém, , à semelhança dos demais grupos experimentais, houve predominância de formas menos diferenciadas de células uNK (subtipos I e II), sendo raras as formas plenamente diferenciadas (subtipo III). Em nenhum dos grupos foi encontrado o subtipo IV, correspondentes à forma de degeneração destas células. Estes resultados demonstram que as características do endométrio e o comportamento das células uNK na pseudogestação, apresentam diferenças influenciadas pelos meios de indução utilizados e regimes hormonais adotados.Além disso, a ausência do concepto parece ser o fator limitante na continuidade da manutenção do utero seudogestante. Por conseguinte, a pseudogestação induzida com óleo mineral e mantida sob a regência ovariana supra-controlado pelo HCG poderia ser adotada como modelo experimental para estudo das células uNK sem a interferência do embrião. Este modelo deverá permitir novas estratégias para investigação dos diversos fatores de origem embrionário/fetal que possam afetar as atividades destas e/ou outras células de forma controlada in situ no ambiente uterino que simule a gestação / Abstract: During the period of pre-implantation in humans and rodents gestations, a set of phenomenon, involving, modifications of cellular components and extracellular matrix occur in the stroma of the uterus. These modifications, are known as decidualization or decidual reaction. During this processes a migration of leukocytes that came from the heamatopoetic organs occur into the uterine stroma. Among these leukocytes, there is a predominance of a subpopulation of leukocytes known as uterine Natural Killers (uNK) that play important roles during gestation by recognizing the allogeneic embryos and modulating the decidual reaction and the placental growth. However, the uNK participations in miss carriage and triggering of lytic and citotoxic potential related to innate immune response during pregnancy have not elucidated yet. The present work aimed to develop a strategy for uNK study without the influence of embryonaryfactors by using the pseudopregnancy model in mice. It was used the pseudopregnant females mice obtained by matting with vasectomized males and intra-luminal injection of arachis or mineral oil in the uterus on 4th day of pseudopregnancy (dpp). These animals were grouped according to treatment submitted of ovarectomy or not and with exogenous supplement of progesterone and/or estradiol or chorionic gonadotrophin hormone (HCG). The uteri and ovary were collected and processes for light and electron microscope on the 9th, 12thand 14thdpp. Normal pregnant females were used as controls. Histological analysis, cytochemistry and ultrastructure demonstrated that the induction of pseudopregnancy by using both arachis oil and mineral oil resulted in decidual reaction and presence of the DBA (Dolichos biflorus) lectin positive uNK cells. The decidual reactions induced by arachis oil were more intensive and exuberant, but the deciduomas were not sustained longer even under progesterone treatment, if compared to those, in the uterus induced with mineral oil, and supplemented with HCG. The morphological characteristics of the uNK cells were better preserved in the pseudopregnant animals induced with mineral oils, not ovarectomized and supplement with HCG. In these animals, the uNK cells were found over the 12th dpp in the endometrium preserving the deciduoma while it failed before 12th dpp in the other groups However, similarly to other experimental groups, there was predominance immature forms of uNK cells (subtypes I and II), being rare the fully differentiated forms (subtype III). No groups did not show the uNK sub type IV, corresponding to the degeneration form of this cell / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Durante a gestação, em varias espécies de mamíferos, os fibroblastos endometriais são alvos de profundas modificações morfofuncionais que levam a aquisição de um fenótipo epitelial e à expressão de novas moléculas, formando uma nova estrutura no útero denominada decídua. Em camundongos, a reação decidual pode ser estimulada artificialmente (na ausência de embrião), resultando na formação do deciduoma, um modelo de grande relevância para a identificação de fatores oriundos ou não do embrião necessários para a promoção da decidualização. A decidualização também promove uma profunda remodelação da matriz extracelular (MEC) do endométrio, e ambos os processo são fundamentais para o sucesso da gestação. Existem evidencias, muitas das quais são oriundas dos estudos do Laboratório de Biologia da Reprodução e Matriz extracelular (LBR-MEC), mostrando que a remodelação da MEC do útero não grávido é modulada pelos hormônios ovarianos estrógeno (E2) e progesterona (P4). Faltam, entretanto, na literatura, estudos consistentes sobre a regulação da MEC endometrial na ausência de sinais parácrinos provenientes do embrião. Além disso, não se conhece detalhes sobre a ação dos hormônios ovarianos sobre a produção de componentes da MEC por células deciduais. Nesse contexto, o presente estudo teve dois objetivos centrais: (i) caracterizar por imuno-histoquímica a composição e organização da MEC durante o desenvolvimento do deciduoma, (ii) estudar por qPCR, Western blot, e imunolocalização o efeito dos hormônios E2 e Medroxiprogesterona (MPA) na dinâmica da expressão de RNAm, síntese e secreção de moléculas da MEC em culturas primárias de células obtidas de deciduoma. Observamos que, a distribuição do colágeno tipo I, III, IV, V e dos proteoglicanos decorim, biglicam e versicam no deciduoma, foi semelhante ao já observado na decídua. As análises in vitro, mostram que o hormônio E2 aumenta a expressão gênica, a síntese e a deposição de decorim enquanto o MPA tem como alvo o biglicam. Ambos hormônios modulam a expressão de desmina, um marcador de decidualização. O presente estudo também mostra que o padrão de remodelação das moléculas alvo do presente estudo, é similar ao observado durante a decidualização da gestação normal, Conclui-se, portanto, que a remodelação da MEC é um evento intrínseco do processo de decidualização quer na gestação quer na pseudogestação. Ou seja, não foram identificadas diferenças que indicassem a existência de controle pelo embrião. Mostramos ainda que, in vitro, os hormônios E2 e MPA regulam de modo específico a expressão gênica e a secreção do proteoglicanos decorim e biglicam. / During pregnancy in several species of mammals, including humans and mice, endometrial fibroblasts undergo extensive morphofunctional changes acquiring an epithelial phenotype. Those new cells form a new structure in the uterus called decidua. In mice, the decidual reaction can be artificially induced in pseudopregnant females resulting in the formation of a structure morphologically similar to the decidua called deciduoma, a relevant model to study the putative role of the embryo upon decidualization. Endometrial decidualization is an essential event for the success of pregnancy. A notable remodeling of the extracellular matrix (ECM) organization and molecular composition occurs during this process. There are evidences, many of them coming from studies of the Laboratory of Reproductive and Extracellular Matrix Biology (LBR-MEC), that estrogen (E2) and progesterone (P4) modulate the remodeling of the uterine ECM. Nevertheless, there is no consistent information about the role, if it exists, of the embryo on the regulation of the endometrial ECM. Furthermore, it was not yet clarified how the ovarian hormones act on the production of ECM components by decidual cells. Thus, the objective of present study was to identify the composition and organization of the ECM during the development of the mouse deciduoma; and to study by qPCR, Western blot and immunolocalization methods, the effect of hormones E2 and medroxiprogesterone (MPA) on synthesis and secretion of ECM molecules by primary cultures of mouse decidual cells obtained from deciduoma. We found that the distribution of collagen types I, III, IV, V and proteoglycans decorin, biglycan and versican in deciduoma, was similar to that previously observed in the decidua. The in vitro assays showed E2 increases the gene expression for the core protein of Decorin, while MPA increases the expression of the core protein of Biglycan. In addition, was observed that both hormones increase the expression of desmin a marker of decidualization. These results showed that in the endometrium of both pregnant and pseudopregnant animals ECM molecules such as collagens and proteoglycans are similarly modulated by ovarian hormones. At from the present study we may conclude that ECM remodeling is an intrinsic event that happens during decidualization modulated by E2 and MPA and this modualation independ of the presence of the embryo in the uterus. In adition we showed that in decidual cells in vitro the gene expression and the secretion of proteoglycans decorin and biglycan are differentially regulated by hormones E2 and MPA.

The American black bear (ABB) (Ursus americanus) exhibits physiological strategies highly synchronized with the environment. Such strategies enable bears to exploit food resources when available and survive the winter months by hibernating without ingesting food or water. However, there are multiple aspects of ABB hibernation physiology that remain unknown. For instance, there is conflicting evidence on the occurrence of ABB pseudopregnancy (a physiological state in which a non-pregnant bear exhibits progesterone levels similar to gravid bears in the absence of an actual pregnancy). Also, there is little known about postnatal development of cubs or the influence of maternal traits on embryonic implantation and cub growth. Finally, the role of satellite cells (SCs – stem cells able to regenerate muscle fibers) play in maintaining muscle functionality during hibernating remains understudied. Therefore, I aimed to assess these four aforementioned aspects using wild ABBs held temporarily captive at Virginia Tech's Black Bear Research Center (VT-BBRC). The major findings of this dissertation are: 1) I suggest that wild ABBs do not experience pseudopregnancy as a reproductive strategy; 2) interactions between litter size and cub age best described postnatal cub weight dynamics and organ development. Twin cubs were heavier than single and triplet cubs, yet cubs from all litter sizes reached similar weights after mothers began consuming food post hibernation. Single cubs experienced delayed timing in ear, eye, and teeth development compared to other litter sizes; 3) maternal traits such as higher body weight and higher ability to gain weight in the fall are closely associated with earlier timing of embryonic implantation than in leaner females, which gained less weight per day in the fall; and 4) SC ability to generate muscle fibers is increased during ABB hibernation. I propose that maintaining the SCs are an important potential pathway for limiting muscle atrophy during bear hibernation. Understanding pre and postnatal development of ABBs is important for exploring factors related to climate, maternal characteristics, which possibly affect birthing phenology, and fitness of bears experiencing rapid anthropogenic environmental change. Functional aspects of bear muscle conservation are interesting for potentially for elucidating avenues to improve treatments for human metabolic disorders such as muscular dystrophy, sarcopenia, and disuse atrophy. / Ph. D.