Rationnel : L'implication établie des progéniteurs endothéliaux circulants dans les phénomènes de néovascularisation chez l'adulte a stimulé la recherche de thérapeutiques angiogènes basées sur la greffe de ces cellules. Deux types cellulaires au phénotype endothélial sont actuellement définis entre autres par leur cinétique d'apparition en culture : les progéniteurs précoces (CFU-EC ou CAC) et tardifs (ECFC). Notre équipe a montré que l'injection thérapeutique de cellules mononucléées de moelle osseuse (BM-MNC) permettait la néovascularisation du site ischémié chez des patients atteints d'artériopathie des membres inférieurs, et que les néovaisseaux formés avaient le phénotype d'ECFC. Nous avons dans un premier temps mesuré les concentrations de différentes protéines modulant l'angiogenèse, chez des patients atteints de pathologies ischémiques et cardiovasculaires, ou impliquant des anomalies vasculaires associées à la fibrose. Ainsi, le transforming growth factor - β1 (TGF-β1) dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la thrombospondine-1 (TSP-1) dans l'artériopathie des membres inférieurs (AMI), et le placental growth factor (PlGF) chez les patients atteints de pathologies cardiovasculaires [syndrome coronarien aigu (SCA), ou patients devant subir une chirurgie de la valve ou un pontage coronarien], se sont distingués comme potentiel biomarqueur plasmatique dans ces pathologies, et ont été étudiés dans la biologie des ECFC humaines.Résultats : Le taux plasmatique de TGF-β1 est augmenté chez les patients atteints de FPI par rapport à la population contrôle ; il a un effet pro-angiogène in vivo (vascularisation des implants de Matrigel®) et in vitro (prolifération et migration des ECFC) via les récepteurs ALK-1, ALK-5 et TGF-βRII. Le taux plasmatique de TSP-1 est augmenté chez les patients artéritiques par rapport à la population contrôle. Par ailleurs les néovaisseaux formés de patients artéritiques ayant été traités par injection locale de BM-MNC expriment la TSP-1. Dans les modèles murins de Matrigel®-plugs et d'ischémie du membre inférieur (IMI), la TSP-1 induit une diminution de la vascularisation des implants ainsi qu'une diminution de la revascularisation du membre ischémié. In vitro, la TSP-1 augmente l'adhésion via un mécanisme N-Terminal dépendant, et diminue le potentiel angiogène (prolifération et migration) des ECFC via sa liaison au récepteur CD47, ce qui active la voie de signalisation SDF-1/CXCR4. Le taux plasmatique de PlGF est augmenté chez les patients atteints de SCA par rapport à 2 populations contrôles ; il est également augmenté chez les patients ayant subit une chirurgie cardiaque. Les PlGF-1 et -2 potentialisent la tubulogenèse des ECFC in vitro via la phosphorylation du récepteur VEGFR1. Cet effet est aboli lorsque le VEGFR1 est inhibé par ARN interférence ou par le composé chimique " 4321 ". De plus ce composé " 4321 " inhibe la vascularisation des implants de Matrigel®, ainsi que la revascularisation du membre ischémié dans le modèle d'IMI.Conclusions : Le TGF-β1 joue un rôle dans le remodelage vasculaire de la FPI via les ECFC ; la TSP-1 est un potentiel biomarqueur de l'angiogenèse induite par les ECFC dans l'AMI ; l'inhibition de la voie PlGF/VEGFR1 module la tubulogenèse induite par les ECFC, cellules impliquées dans la formation de nouveaux vaisseaux. Nous avons ainsi mis en évidence 3 protéines modulant l'angiogenèse dans 3 contextes pathologiques différents, caractérisés par un remodelage vasculaire et où les ECFC sont impliquées dans leurs mécanismes physiopathologiques. Ces 3 protéines se présentent donc comme de potentiels biomarqueurs plasmatiques, modulant les propriétés angiogènes des ECFC et pouvant influencer leur efficacité en tant que produit de thérapie cellulaire. Ces protéines jouent un rôle probable dans l'équilibre homéostatique au décours des pathologies concernées.

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Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (SDRA) est une maladie inflammatoire courante en service de réanimation qui touche environ 10% des patients. Une augmentation pathologique de la rigidité et/ou de l'adhésion des leucocytes des patients atteints du SDRA semble être un des facteurs déclenchants majeurs de la maladie. Nous avons utilisé la microfluidique pour mimer le passage des cellules dans les capillaires pulmonaires. L'observation du passage de cellules modèles (lignée monocytaire humaine THP-1) dans des constrictions microfluidiques (H=12µm et W=6µm) a permis de mesurer leur temps d'entrée. Ensuite nous avons incubé des cellules dans des sérums issus de malades et étudié leurs caractéristiques de passage dans des constrictions microfluidiques en fonction du temps d'incubation et de la concentration en sérum. Ces résultats sont ensuite comparés à la composition des sérums en cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, TNF-α, TGF-β et INF-γ). Des corrélations entre l'IL-8, IL-1β, le TNF-α et le temps d'entrée ont été trouvés. Ces deux cytokines peuvent jouer un rôle dans la rigidité cellulaire lors de cette maladie. En incubant ainsi nos cellules avec les recombinants humains (IL-8, IL-1β et Tnf-α), nous avons constaté une augmentation de la rigidité des cellules. D'un point de vue médical nous avons montré que l'utilisation d'anticorps bloquants anti IL-8, anti IL-1β et anti TNF-α permet de protéger les cellules. / The project consists in using microfluidic devices to test human leukocyte behavior in microcirculation. Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is a disease that affects numerous patients in intense care services with a rate of death 50%. It is triggered to the sequestration of neutrophils within the lung microvasculature. There is neither diagnostic nor efficient treatment now. We study the properties of the passage of THP-1, and real neutrophils in micro-channels of width 6µm. In order to improve the understanding of SDRA, we also incubate models cells in patient's serums who are suffering from ARDS and diagnostic tools are being developed in collaboration with the hospitals of Marseille.

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Introduction: La stratégie diagnostique de l’EP au cours de la grossesse est incertaine du fait du manque d’études solides d’un point de vue méthodologique, et du risque lié à l’irradiation des examens diagnostiques (angioscanner thoracique et scintigraphie pulmonaire). L’enjeu est donc de valider des stratégies performantes d’une part, et d’identifier des marqueurs cliniques permettant de réduire le recours aux examens irradiants d’autre part. Notre premier objectif a été d’identifier les pièges au cours de la stratégie diagnostique de l’EP (baisse de la performance du dosage des D‐dimères, des scores de probabilité clinique et de l’imagerie) au cours de la grossesse. Le deuxième objectif a été de comparer les performances diagnostiques et les risques des deux examens d’imagerie de référence que constituent la scintigraphie pulmonaire et l’angioscanner thoracique. Le troisième objectif a été de valider une stratégie diagnostique permettant une réduction du recours aux examens irradiants (ajustement du taux de D-dimères sur la probabilité clinique). Le dernier objectif a été de mettre en place un programme de recherche centré sur le poids des antécédents familiaux de MVTE, paramètre lui aussi susceptible de réduire le recours aux examens paracliniques. Conclusion : Au terme de ces analyses, nous avons développé un programme de validation d’une stratégie diagnostique de l’EP chez la femme enceinte ; en outre, l’identification d’un ajustement du taux de D‐dimères sur la probabilité clinique ainsi que, en termes de perspective, sur les antécédents familiaux de MVTE a le potentiel de conduire à des stratégies diagnostiques moins irradiantes et plus performantes chez les femmes enceintes ayant une suspicion d’EP. / Introduction : The diagnostic strategy for PE during pregnancy is uncertain due to the lack of high quality studies and the risk of radiation exposure with computed tomography pulmonary angiography (CTPA) and ventilationperfusion (V-Q) lung scan. The challenge is to validate diagnostic strategies, and to identify predictive factors to reduce the number of additional imaging tests with radiation exposure.First, we aim to identify pitfalls during the diagnostic strategy of PE (the D-dimer assay threshold, clinical probability scores, imaging) during pregnancy. Second, our objective was to compare the diagnostic efficiency of CTPA and (V-Q) lung scan during pregnancy.Third, our objective was to validate a diagnostic strategy wich reduces the number of imaging tests (adjustment of the D-dimer level on the clinical probability). Finally, the last objective was to set up a research program focused on the weight of the family history of MVTE, that may also reduce the need of additional tests. Conclusion : We identified an ongoing validation protocol with a new diagnostic algorithm in pregnant patients withPE suspicion ; Furthermore, identifying a D-dimer level adjustement as well as a family history of VTE can lead tomore effective diagnostic stragegies with less radiation exposure for pregnant women with suspected PE.

Les fluorocarbures ont un fort potentiel en médecine. Cependant, et en dépit du fait que certaines formulations employant des fluorocarbures sont utilisées en clinique, il n’existe que relativement peu d’études visant à déterminer les interactions entre un fluorocarbure et une membrane de phospholipides. Notre étude concentre à l’interface fluorocarbure/phospholipide, qui représente d’une part un modèle simplifié du surfactant pulmonaire natif dont le composant majoritaire est la dipalmitoylphosphatiylcholine (DPPC), et d’autre part la paroi de microbulles développées comme nouveaux agents théranostiques.Tout d’abord, nous montrons que les fluorocarbures abaissent considérablement la tension interfaciale d’équilibre d’une série de phospholipides et accélèrent fortement leur adsorption. Nous montrons que des oscillations périodiques appliquées à la bulle induisent une transition du film de DPPC vers un état d’organisation plus dense. L’application d’oscillations périodiques permet aussi à la DPPC d’expulser du film interfacial une protéine, l’albumine, dont la présence est souvent liée aux troubles dus au mauvais fonctionnement du surfactant pulmonaire. L’effet des fluorocarbures, qui accélère considérablement l’expulsion de l’albumine par la DPPC, est également étudié. D’autre part, nous avons obtenu des microbulles exceptionnellement stables grâce à une série homologue de phosphates perfluoroalkylés. Nous avons également réussi à former des microbulles couvertes par des nanoparticules magnétiques, tout en gardant les propriétés échogènes des bulles. De telles microbulles offrent un potentiel comme des agents de contraste bimodaux pour l’IRM et l’échosonographie. / Fluorocarbons have a great potential in medicine. However, and despite the fact that some formulations using fluorocarbons are used clinically, only a few studies are reported that aim to determining the interactions between a fluorocarbon and a membrane of phospholipids. Our work concentrated on the fluorocarbon/phospholipid interface, which represents, on one hand, a simplified model of the lung surfactant, the major component of which is dipalmitoylphosphatiylcholine (DPPC), and on the other hand, the shell of microbubbles developed as new theranostic agents. In a first part, we show that fluorocarbons significantly reduce the equilibrium interfacial tension of a series of phospholipids and greatly accelerate their adsorption rate. We also show that periodical oscillations applied to the bubble induce a transition of DPPC film to state with a denser organization. The application of periodical oscillations also allows DPPC to expel from the interfacial film a protein, albumin, whose presence is often associated with disorders caused by dysfunction of the lung surfactant. The impact of fluorocarbons, which considerably accelerate the expulsion from the interfacial film of albumin, is also studied. In a second part, we have obtained exceptionally stable microbubbles with a homologous series of perfluoroalkylated phosphates. We were also able to form microbubbles covered by magnetic nanoparticles, while preserving the echogenicity of the bubbles. Such microbubbles offer a potential as bimodal contrast agents for MRI and echography.

La pathologie pulmonaire et la pathologie cardiaque interagissent et le bloc “Cœur- poumon” est à considérer comme une seule et même entité en imagerie: la lecture du cœur, des vaisseaux, des poumons et du médiastin doit être globale et intégrée, quelle que soit la modalité d’imagerie. Nous avons pu ainsi illustrer la contribution de la TDM dans l’évaluation de la prévalence de la pathologie coronarienne asymptomatique au cours de la fibrose pulmonaire idiopathique, l’analyse du volume de l’oreillette gauche au cours des BPCO, la corrélation entre volume pulmonaire hypoperfusé et le rapport VD/VG, et l’évaluation de l’envahissement cardiaque au cours des néoplasies pulmonaires. Les avancées techniques en scannographie nous permettent désormais d’approcher outre la morphologie le versant fonctionnel, notamment par l’évaluation de la fonction cardiaque, de la perfusion pulmonaire, en attendant le développement en routine clinique de l’approche par TDM de la fonction de ventilation. Notre thèse avait pour ambition de contribuer modestement à la promotion d’une approche morphologique et fonctionnelle intégrée de l’imagerie du cœur, des vaisseaux thoraciques et du poumon, dont les bénéfices cliniques nous apparaissent quotidiens et dont l’enseignement nous apparait indissociable. / Pulmonary and cardiac pathology interact and the « heart-lung » bloc is to consider as one and same entity in imaging: heart, vessels, lungs and mediastinum analysis must be global and integrated, whatever imaging modality.In this work, we have illustrated computed tomography contribution in: evaluating asymptomatic coronary disease in cystic fibrosis pathology, left atrial volume in COPD patients, correlation of hypo perfused lung volume and RV/LV ratio, and cardiac invasion evaluation in broncho-pulmonary neoplasm.Computed tomography technological advances allow us to evaluate morphology and functional side, in evaluating cardiac function, pulmonary perfusion, waiting for the development of pulmonary ventilation in routine. Our work contributes to the development of a morphological and functional approach in heart, great vessels and lung imaging.

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) présente un taux de mortalité élevé, près de 40%, dans des unités de soins intensifs. Il est défini comme un ensemble de manifestations cliniques, radiologiques et physiologiques qui traduisent une intense inflammation pulmonaire et une hyperperméabilité pulmonaire, correspondant aux différentes agressions aiguës du poumon. Le prise en charge des patients atteints du SDRA nécessite une ventilation assistée qui, en cas de mauvaise adaptation des paramètres de ventilation, notamment, pression et volume, peut aggraver l'état du patient. Le réglage de ces paramètres est basé sur l'analyse de l'aération pulmonaire en réponse à la ventilation assistée. Cette analyse peut être faite sur des images tomodensitométriques (CT en anglais) après y avoir segmenté le parenchyme pulmonaire. Néanmoins, cette segmentation est entravée par l'augmentation de la densité du parenchyme, qui réduit le contraste entre le poumon et les structures voisines. Cette thèse cherche à fournir des outils de traitement d'images qui permettent aux experts l'analyse de l'aération pulmonaire dans des images CT acquises dans le cadre d'un projet sur le SDRA utilisant un modèle animal / Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is a life threatening disease presenting a high mortality of about 40% in intensive care units. It is the consequence of different pulmonary aggressions generating hypoxemia and pulmonary edema, which are radiologically expressed as infiltrations observable as opaque regions in the lung. The treatment of ARDS requires mechanical ventilation, which may deteriorate the state of the patient if the ventilation parameters, namely volume and pressure, are not correctly adjusted. To adjust the parameter settings to each individual case, lung aeration - in response to ventilation - needs to be assessed. This assessment can be done using computed tomography (CT) images. However, it requires the segmentation of the lung-parenchymal tissue, which is a challenging task in ARDS images due the opacities that hinder the image contrast. In this thesis we aim to provide the required tools for the experts to analyze the aeration in the images acquired within an ARDS project using an animal model

Résumé Responsable de près de 7 millions de décès prématurés par an à travers le monde, la pollution atmosphérique représente un problème sanitaire mondial majeur. L’exposition humaine à la pollution particulaire dont les émissions de diesel représentent la principale source, est responsable d’une élévation de la mortalité et de l’incidence d’événements cardiovasculaires. Les mécanismes physiopathologiques sous-tendant cette toxicité aigue restent à ce jour largement méconnus. A l’aide d’une méthodologie d’exposition standardisée aux émissions de diesel, nous avons exploré les effets vasculaires périphériques et pulmonaires ainsi que les effets hémostatiques et plaquettaires secondaires à l’inhalation particulaire chez des sujets sains. L’étude dynamique de la microcirculation périphérique par Laser Doppler Imager nous a permis de démontrer une altération de la vasomotricité endothélium-dépendante induite par l’exposition aux émissions de diesel. La dysfonction observée est associée à une diminution de la biodisponibilité locale du NO ainsi qu’à une production radicalaire accrue au sein de la cellule endothéliale. Au cours d’une épreuve dynamique d’élévation du débit cardiaque par infusion de dobutamine, l’exposition aiguë aux émissions de diesel entraîne une élévation de la résistance vasculaire pulmonaire et une diminution de la distensibilité vasculaire pulmonaire mesurées par échocardiographie. Enfin, l’expression de surface des marqueurs d’activation plaquettaire CD62p (P-selectine) et CD63 est augmentée après exposition aux émissions de diesel, en corrélation avec la quantité de particules inhalées et constitue ainsi un état d’activation plaquettaire accru sans toutefois de modification de l’agrégation plaquettaire. A travers ces effets vasculaires systémiques et pulmonaires ainsi que ces effets hémostatiques, l’exposition aux émissions de diesel entraîne une toxicité cardiovasculaire aiguë, agissant en synergie, capable de déclencher la survenue d’événements cardiovasculaires.Abstract Responsible for up to 7 million deaths/year, air pollution is a major worldwide health burden. Particulate human exposure mainly originates from diesel exhaust and is associated with an increased cardiovascular mortality and an increased onset of cardiovascular events. Physiopathologic mechanisms underlying this acute toxicity remain largely unknown. We used a standardized diesel exhaust exposure protocol to explore not only the peripheral and pulmonary vascular effects, but also the hemostatic and platelet modifications in healthy subjects after particulate inhalation. Diesel exhaust exposure impairs the endothelium-dependant vasodilation during a dynamic evaluation of the peripheral microcirculation assessed by Laser Doppler Imager, whilst the endothelial independent vasodilatation remains unaffected. Vascular dysfunction is associated to a decreased local NO bioavailability and an increased endothelial reactive oxygen species production. During a dynamic cardiac stress test using continuous dobutamine infusion, acute diesel exhaust exposure induces an increased pulmonary vascular resistance associated to a decreased pulmonary vascular distensibility, both evaluated by echocardiography. Finally, platelet activation is modified after diesel exhaust exposure with an increased CD62p (P-selectin) and CD63 platelet surface expression, correlated with the total amount of inhaled particles. We observed a state of platelet activation without change in platelet aggregation. Through these multiples effects, combining systemic and pulmonary vascular impairment with platelet prothrombotic modifications, diesel exhaust exposure induces an acute cardiovascular toxicity, which can synergistically trigger acute events. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les canaux chlore volume-sensibles (VRACs) régulent les activités différenciatives, migratoires et prolifératives des fibroblastes et pourraient donc être impliqués dans la pathobiologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et la fibrose pulmonaire interstitielle (FPI). Diverses études antérieures ont montré que l’endothéline-1 (ET1) a des propriétés pro-fibrosantes, en plus cette molécule participe au remodelage des artérioles pulmonaires dans l’HTAP. D’autre part, ces pathologies d’HTAP et de fibrose pulmonaire peuvent être antagonisées par la mélatonine et par l’interaction entre protéines de morphogenèse (BMPs: bone morphogenetic proteins) et leur récepteur 2 (BMPR2). <p>La première partie de mon travail s’est intéressée aux effets de la BMP2 et de l’endothéline1 sur les canaux chlore volume-sensibles de fibroblastes pulmonaires. <p>La stimulation hypotonique du courant a été inhibée par la BMP2 en dépendance de la dose appliquée et de la durée d’exposition à la molécule. Un maximum d’effet de la BMP2 a été observé avec une concentration de 10ng/ml pendant 45min de prétraitement. En plus, les courants chlore volume-sensibles, inhibés par la BMP2, se sont restaurés en présence de l’inhibiteur spécifique de la voie de la protéine kinase C (PKC), le GFX. D’autre part, le prétraitement des fibroblastes avec l’ET1 à 100μM pendant 2heures a induit l’apparition d’un courant activable par l’acide lysophosphatidique (ICl-LPA) (marqueur de la différenciation des fibroblastes) et l’expression de l’α-sma (alpha smooth muscle actin, marqueur classique des myofibroblastes). La migration des fibroblastes a été aussi induite en présence de l’ET1, alors que l’inhibition des canaux chlore par le DIDS (Diisothiocyanatostilbene-disulfonic acid) a bloqué cet effet. La BMP2 s’est opposée à l'effet de l’ET1 sur la différenciation des fibroblastes par l’inhibition de l’induction du courant ICl-LPA et de l’expression génique de l’α-sma. En plus, la migration des fibroblastes, induite par l’ET1, a été inhibée par la BMP2. Nous avons aussi montré que l’expression de gène du canal anoctamine6 a été stimulée par l’ET1, alors la BMP2 s’est opposée à cet effet, ce qui suggère que l’anoctamine6 est le canal responsable de la différenciation des fibroblastes marquée par l’apparition du courant ICl-LPA. Il apparaît donc que l’ET1 et la BMP2 ont des effets opposés sur la différenciation et la migration des fibroblastes pulmonaires via leurs effets sur l’activité et l’expression des canaux chlore volume-sensibles. <p>La deuxième partie du travail s’est intéressée à l’effet de la mélatonine sur les canaux chlore volume-sensibles de fibroblastes L929 et aux conséquences de cet effet sur la migration et la prolifération de ces cellules. Le prétraitement des fibroblastes avec 100μM de mélatonine pendant 30min a inhibé significativement l’activation des canaux chlore volume-sensibles. En plus, une concentration de 100 nM pendant une nuit a donné le même effet observé avec la mélatonine à 100μM pendant 30 min. Nous avons aussi constaté que l’inhibition des VRACs par la mélatonine a été dose-dépendante. L’effet de la mélatonine sur les VRACs a été inhibé en présence de l’antagoniste non sélectif des récepteurs de la mélatonine (Luzindole) et l’antagoniste sélectif pour le récepteur 2 (MT2) de la mélatonine (K185). En plus, l’inhibiteur de la voie de la PKC (GFX) a empêché la mélatonine d’agir sur les canaux chlore volume-sensibles. Ces résultats suggèrent que la mélatonine agit sur les VRACs en se fixant sur MT2 et en activant la voie de la PKC. L’inhibition des VRACs par la mélatonine a eu pour conséquence l’inhibition du phénomène de RVD (regulatory volume decrease), qui suit le gonflement hypotonique. Nous avons aussi montré que la migration des fibroblastes L929 a été inhibée par la mélatonine à 100μM et cela via l’inhibition des VRACs, puisque la mélatonine s’est montrée incapable d’induire une inhibition supplémentaire de la migration en présence de l’inhibiteur des canaux chlore volume-sensibles (DIDS). En plus, l’antagoniste non sélectif des récepteurs de la mélatonine (luzindole), l’antagoniste sélectif pour MT2 (K185) et l’inhibiteur de la voie de PKC (GFX) ont provoqué la disparition de l’effet de la mélatonine sur la migration. Cela suggère que la mélatonine agit sur la migration via les voies empruntées pour l’inhibition des VRACs. L’inhibition des VRACs, par la mélatonine et le DIDS, n'a pas induit d'inhibition significative sur la prolifération des fibroblastes L929, ce qui veut dire que l’inhibition des VRACs est insuffisante pour induire une inhibition significative de la prolifération. Donc, la mélatonine inhibe les canaux chlore volume-sensibles via sa fixation sur MT2 et l’activation de la voie de la PKC. Cela a pour conséquence l’inhibition du RVD et de la migration des fibroblastes L929, mais cette inhibition des VRACs est insuffisante pour inhiber la prolifération de ces cellules. <p>En conclusion, j’ai pu montrer l’importance des canaux chlore volume-sensibles dans la régulation de la physiologie des fibroblastes et leurs interactions avec des médiateurs d’affections pulmonaires à composante fibrosante, telles que l’HTAP et la FPI./<p>Volume-regulated anion channels (VRACs) regulate fibroblast differentiation, migration and proliferation. Fibroblasts have been shown to be involved in several pathologic states including pulmonary arterial hypertension (PAH) and interstitial pulmonary fibrosis (IPF). A number of previous studies have shown that endothelin-1 (ET1) has pro-fibrotic properties and participates in the remodeling of pulmonary arterioles in PAH. On the other hand, PAH and IPF may be controlled by melatonin and bone morphogenetic protein receptor 2 (BMPR2) signaling. <p>The first part of my work described the effects of BMP2 and ET1 on the VRAC in the pulmonary fibroblasts and the consequences of these effects on differentiation and migration of these cells. Pretreatment of fibroblasts with BMP2 inhibited hypotonic current stimulation and this effect was dependent on the BMP2 concentration and on the time of exposition to the molecule. The maximum effect of BMP2 was observed at a concentration of 10ng/ml for 45 min of pretreatment. In addition, volume-sensitive chloride current, inhibited by BMP2, was restored in presence of PKC (protein kinase C) pathway inhibitor (GFX). On the other hand, the pretreatment of fibroblasts with100μM of ET1 for 2 hours, induced the appearance of a lysophosphatidic acid-activable chloride current (ICl-LPA) (a marker of fibroblast differentiation) and stimulated the expression of the smooth muscle actin alpha (α-sma) (the classical marker of myofibroblasts). ET1 also stimulated fibroblast migration, while the inhibition of chloride channels by (DIDS) (Diisothiocyanatostilbene disulfonic acid) bloked this effect. The BMP2 opposed the effect of ET1 on fibroblast differentiation by preventing the induction of ICl-LPA current and α-sma gene expression. In addition, BMP2 inhibited the fibroblast migration induced by ET1. We have also shown that ET1 stimulated anoctamin6 channel gene expression and that BMP2 opposed this effect, which suggests the implication of anoctamin6 on fibroblast differentiation marked by the appearance of ICl-LPA current. Thus, ET1 and BMP2 have opposite effects on pulmonary fibroblast differentiation and migration via their effects on the activity and expression of volume-regulated anion channels. <p>The second part of the work focused on the effect of melatonin, which is a vasorelaxant and antifibrotic agent, on the volume-sensitive chloride channels in L929 fibroblasts and primary rat fibroblasts and on the consequences of this effect on migration and proliferation of these cells. Fibroblast pretreatment with 100μM of melatonin for 30 min significantly inhibited the activation of volume-sensitive chloride channels. In addition, a concentration of 100 nM of melatonin overnight produced the same effect observed with melatonin at 100μM for 30 min. The effect of melatonin on VRAC current was dose-dependent. Inhibition of VRACs by melatonin resulted the inhibition of the RVD phenomenon (Regulatory Volume Decrease) following the hypotonic swelling. The effect of melatonin on VRACs was inhibited in the presence of the non-selective antagonist of melatonin receptors (Luzindole) and the selective antagonist of the melatonin receptor 2 (MT2), the K185. In addition, the PKC pathway inhibitor (GFX) inhibited the effect of melatonin on the volume-sensitive chloride channels. These results suggest that, melatonin acts on the VRACs by binding to MT2 and by activating the PKC pathway. We have also shown that the L929 fibroblast migration was inhibited by melatonin (100μM) via inhibition of VRAC channels, since melatonin was unable to induce further inhibition of migration in the presence of the volume-sensitive chloride channels inhibitor (DIDS). In addition, the non-selective melatonin receptors antagonist (luzindole), the selective antagonist for MT2 (K185) and the PKC pathway inhibitor (GFX), blocked the effect of melatonin on migration, which suggests that melatonin acts on migration via the same pathways that inhibit VRAC channels. Inhibition of VRACs by melatonin and DIDS have not shown any significant inhibition of L929 fibroblast proliferation, which means that the VRAC inhibition is not sufficient to induce a significant inhibition of proliferation. Thus, melatonin inhibits volume-sensitive chloride channels via its binding to MT2 and activation of the PKC pathway. This has as consequences the inhibition of RVD and migration of L929 fibroblasts but insufficient to inhibit the proliferation of these cells. <p>In conclusion, I have shown the importance of volume-sensitive chloride channels in the regulation of fibroblast physiology and its interactions with ET-1, BMP and melatonin signaling. These results are compatible with the notion that the participation of fibroblasts in the pathobiology of PAH or IPF is mediated by VRAC channels, which can be activated by ET-1 and inhibited by BMP’s or melatonin. The translational relevance of these findings will have to be investigated on fibroblasts from patients with PAH or IPF, or from animal models of pulmonary hypertension or lung fibrosis.<p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished