Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures polymorphiques adoptées in vitro par les séquences d’ADN et d’ARN riches en guanines. L’utilisation d’anticorps et de ligands spécifiques des structures G4 a permis leur détection au niveau cellulaire. Des études computationnelles ont prédit des séquences possédant une signature G4 au niveau de régions génomiques capitales comme les télomères ou les promoteurs de certains oncogènes. De plus, de nombreuses protéines impliquées dans des processus cellulaires comme la réplication, la transcription ou encore la réparation, peuvent interagir directement avec des G4, en facilitant leur formation ou au contraire leur dénaturation. C’est notamment le cas d’hélicases impliquées dans des pathologies humaines, comme BLM, WRN, FANC J ou PIF1. Ce sont des enzymes capables de dénaturer des G4 et dont l'inactivation induit une instabilité génomique, en particulier au niveau de régions susceptibles de former un G4. Dans ce travail, nous présentons la mise au point d’un test de criblage à moyen débit pour le suivi des interactions G4/hélicases en temps réel. Ce test nous a permis de définir les conditions favorisant ou inhibant l’interaction d’une hélicase vis-à-vis de son substrat G4. Nous avons démontré que ces conditions pouvaient différer d’une hélicase à une autre, notamment les conditions salines optimales nécessaires aux activités hélicases de ScPif1 et de RHAU. Nous avons également prouvé, à travers ce test, que l’utilisation de ligands capables de stabiliser les G4 n’induisait pas forcément d’inhibition de l’activité hélicase de ScPif1. Enfin, nous avons également pu définir la directionnalité de la protéine RPA, ce qui fait de notre test une technique prometteuse pour la caractérisation de nouvelles protéines pouvant dérouler des structures G4. / G-quadruplexes are highly polymorphic non-canonical nucleic acid structures adopted by both DNA and RNA guanine-rich sequences in vitro. They have been detected at the cellular level using structure specific antibodies and small molecule ligands. Computational studies demonstrated that G4-prone sequences are located in key genomic regions such as telomeres and oncogene promoters. Numerous studies showed that G4 sequences can interact with proteins involved in cellular processes, including replication, transcription or reparation. Those interactions include binding, G4 folding promotion or in contrary unwinding. Indeed, WRN, BLM, FANC J or Pif1 are helicases associated with human-diseases. They can unwind G4 forming sequences; mutation of these helicases lead to genomic instability of G4-prone motifs when mutated. Here, we present a medium-throughput technique to monitor G4-helicase interactions in real time. We were able to determine both favourable and deleterious conditions for G4 unwinding by a given helicase. We show that these conditions differ from one helicase to another as exemplified with the optimal salt conditions required for both ScPif1 and RHAU activities. We also reveal that the G4 ligands that stabilize G4 structures do not necessarily induce an inhibition of their unwinding by ScPif1 helicase. Finally, we also prove that our assay is adapted to clear up RPA directionality, making it an attractive technique to screen for new proteins able to unwind G4 structures.

Interactions between DNA and ligands are important in the rational design of drugs and in research into DNA function. In particular, the interaction of DMZ with DNA structures named “G-quadruplexes” was considered. G-quadruplexes are structures present in telomeres and several oncogenes. The main purpose of this project was to provide a computational tool to study DNA ligand interactions using a variety of molecular modeling techniques that include molecular docking, molecular dynamics simulations (MD) and MM/PBSA (Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area). We investigated the binding modes and binding affinities of DMZ with c-MYC G-quadruplexes (G4s). We found that the conformation and structural design of the quadruplex can dramatically influence the binding profiles of the ligand. The binding free energies for each site were estimated by the MM/PBSA method. The binding of small molecules to DNA can result in the disruption of oncogene transcription, making it an effective anticancer strategy.

G-quadruplexes, a type of nucleic acid secondary structure consisting largely of folded quartets of guanines, appear to play a regulatory role in the human genome. Heme has been shown to interact with G-quadruplexes. The ChIP-Seq-like Heme-Seq assay was developed to identify heme binding G-quadruplex loci. Using Heme-Seq, 3 primary heme binding loci and 4 secondary minor heme binding loci were identified on six chromosomes. Two of the primary heme binding loci were found at the centromeric boundaries of the long arms of metacentric chromosomes with the majority of reads from the primary heme binding loci consisting primarly of Human Satellite II (HSATII) nucleotide repeat sequences. Numerous putative G-quadruplex forming sequences were found in the heme-binding locus on Chromosome 2. Comparison of Heme-Seq results with available data from a G-quadruplex ChIP-Seq study in live cells, revealed that the regions which exhibited binding at the three peaks from the Heme-Seq data also showed binding coverage in the CHIP-Seq data. In addition to the known association with G-quadruplexes, heme also appears to bind to HSATII repeats,. The biological role and importance of this binding is not known. / Biomedical Sciences

Les télomères sont des structures spécifiques nucléoprotéiques localisées aux extrémités des chromosomes. Ils protègent les chromosomes contre la dégradation, les recombinaisons et les fusions et permettent qu’ils ne soient pas reconnus comme des cassures à l’ADN. Ils sont composés d'ADN télomérique, constitué de répétitions de la séquence TTAGGG, qui se prolonge par une extrémité 3’ simple brin, et de six protéines télomériques dont la protéine TRF2 qui sont indispensables au maintien de l’intégrité des télomères. Le brin riche en guanines est capable, en présence de cations monovalents, de se replier sur lui- même en une structure à quatre brins, la structure G-quadruplexe. Sa stabilisation par des ligands est une stratégie anti-tumorale car elle provoque des perturbations télomériques conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Comme les télomères sont des séquences riches en guanines, ils peuvent aussi constituer une cible potentielle des complexes de platine. Notre objectif consiste à augmenter le ciblage des télomères en associant au sein de la même molécule, un ligand de structure G-quadruplexes qui reconnaitrait ces structures avec un atome de platine qui les bloquerait ensuite irréversiblement. La tolyl-terpyridine-Pt(II), (Pt-ttpy) a été conçue dans ce but. Elle stabilise et se fixe irréversiblement sur les structures G-quadruplexe in vitro. Nous avons analysé les perturbations télomériques induites par ce ligand de G-quadruplexes (Pt-ttpy) en comparaison avec des complexes qui ne stabilisent pas ces structures (terpyridine-Pt(II) ou Pt-tpy, et le cis-platine drogue anti-tumorale utilisée en chimiothérapie) et quantifié le nombre de complexes fixés au niveau des télomères. Nous avons travaillé sur deux lignées cancéreuses d’ovaire sensibles et résistantes au cis-platine (A2780 A2780-cis) et une lignée non-cancéreuse BJ-hTERT. Les complexes Pt-ttpy et Pt-tpy inhibent la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses à des doses de l’ordre du µM et ne montrent aucune résistance croisée avec le cis-platine. Nos résultats obtenus par ChIP et immunofluorescence montrent sans ambiguïté que Pt-ttpy délocalise 50% de protéine TRF2 des télomères uniquement des cellules cancéreuses et augmente les dommages au niveau de l’ADN télomérique par rapport aux complexes qui ne sont pas des ligands de G-quadruplexes, sans pour autant induire un raccourcissement des télomères. Donc l’association d’un ligand de G-quadruplexes avec un atome de platine au sein d’une même molécule permet de cibler préférentiellement les télomères des cellules cancéreuses par rapport au complexe de platine seul. Cependant, les perturbations télomériques induites par Pt-ttpy n’ont pas été augmentées par rapport aux meilleurs ligands de G-quadruplexes connus. De façon intéressante, et pour la première fois dans la littérature, nous avons montré que nos deux complexes Pt-ttpy, Pt-tpy ciblent directement les télomères des cellules cancéreuses puisqu’ils s’y fixent. Ils augmentent la préférence de fixation à l’ADN télomérique/l’ADN génomique d’un facteur 15 par rapport au cis-platine. Cette préférence de fixation semble indépendante de la reconnaissance de structures G-quadruplexes mais semble plutôt dépendre de la nature des complexes de platine. D’autre part, à cause de la faible quantité de complexes retrouvée au niveau des télomères, leur fixation aux télomères ne peut être responsable, à elle seule, la délocalisation de TRF2, suggérant que le déplacement de TRF2 des télomères n’est pas dû un empêchement physique mais plutôt à une réponse biologique. Ainsi, nos travaux montrent que les molécules hybrides ligands de structure G-quadruplexes-Pt(II) sont une stratégie intéressante pour ciblage des télomères des cellules cancéreuses. Ceci ouvre la voie au développement de nouveaux complexes dont le facteur de préférence pour l’ADN télomérique et également la quantité de complexe fixée au niveau de l’ADN télomérique seraient augmentés par rapport à Pt-ttpy / Telomeres are specialized nucleoprotein complexes located at the end of chromosomes. They protect chromosomes from degradation, recombination and telomeric fusions and avoid them to be recognized as DNA breaks. They are composed of telomeric DNA consisting of repetitions of the sequence TTAGGG, which is extended by a 3 'single-stranded DNA, and of six telomeric proteins which TRF2 protein, that are essential to the maintenance of the integrity of telomeres. The guanine-rich strand is able to fold, in the presence of monovalent cations, in a four stranded structure, the G-quadruplexes. The stabilization of these structures is a promising anticancer strategy because it induces telomeric perturbations leading to cancer cell death. As telomeres are rich in guanines, they are potential targets for platinum complexes. Our aim is to increase the targeting of telomeres by associating within the same molecule, a ligand of G-quadruplex which stabilizes these structures with a platinum atom which then, will irreversibly block these structures. The tolyl-terpyridin-Pt(II) (Pt-ttpy) has been designed in this aim. It stabilizes and binds irreversibly to the G-quadruplex structures in vitro. We anlysed the telomeric perturbations induced by this G-quadruplex ligand (Pt-ttpy) in comparison with complexes which do not stabilize these structures (terpyridin-Pt(II) or Pt-tpy and cisplatin, an anti-tumor widely drug used in chemotherapy) and quantified the number of complexes bound to telomeres. We used two ovarian cancer cells lines, sensitive and resistant to cisplatin (A2780 and A2780-cis), and a non-cancer cell line (BJ-hTERT). Pt-ttpy and Pt-tpy inhibit cancer cell proliferation in doses at the µM range and show no cross-resistance with cisplatin. Our results, obtained by ChIP and immunofluorescence experiments, show that Pt-ttpy delocalize 50% of protein TRF2 from telomeres of cancer cells and increases the damage to telomeric DNA compared to the complexes that are not ligands of G quadruplexes, without inducing telomere shortening. Therefore, the association of a G-quadruplex ligand to a platinum atom within the same molecule allows to preferentially targeting telomeres of cancer cells compared to the platinum complex alone. However, telomeric perturbations induced by Pt-ttpy were not increased compared to the best known G-quadruplex ligands. Interestingly, and for the first time in the literature, we have shown that Pt-ttpy, Pt-tpy complexes directly target cancer cells since they bind irreversibly to them. They increase the preference of binding to telomeric DNA versus genomic DNA by a factor of 15 compared to cisplatin. This preference seems independent of the recognition of G-quadruplex structures but seems to depend on the nature of platinum complexes. On the other hand, because of the small amount of complexes bound to telomeres, their binding to telomeres cannot be at the origin, alone, of the delocalization of TRF2 from telomeres, suggesting that delocalization of telomeric TRF2 is not due to a physical impediment but rather to a biological response. Our work shows that the hybrid molecules G-quadruplex ligands-Pt (II) are an interesting strategy for targeting telomere of cancer cells. Therefore, it will be interesting to develop new complexes which would increase the preference for telomeric DNA and also the amount of platinum bound to telomeric DNA compared to Pt-ttpy

Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures d’ADN non-canoniques qui résultent de l’empilement hydrophobe de tétrades de guanines, stabilisé par des cations métalliques (tels que Na+ et K+). Il existe aujourd’hui un nombre croissant de preuves expérimentales qui attestent de l’implication des G4 dans d’importantes fonctions cellulaires corrélées à leur mécanisme de repliement/dépliement. Toutefois, très peu d’études ont abordé les aspects dynamiques de leur formation. Aussi, nous avons entrepris l’étude de plusieurs G4 mono-moléculaires à l’aide d’une nouvelle extension d’expériences de saut de température, capable de mesurer la dynamique de dénaturation thermique et de renaturation consécutive de l’ADN, sur une fenêtre temporelle allant de quelques millisecondes aux secondes. Les changements conformationnels ont été sondés par dichroïsme circulaire (CD) résolu en temps, connu pour être très sensible à l’arrangement des guanines dans les G4. Au préalable des études résolues en temps, en collaboration avec DISCO/SOLEIL, nous avons mesuré les spectres CD statiques de différentes séquences G4 présentant des topologies distinctes, comme celles des télomères humains, de l’aptamère de la thrombine ou des promoteurs de c-MYC. Nous avons observé des cinétiques de dénaturation et renaturation biphasiques avec des constantes de temps de quelques centaines de millisecondes et quelques secondes. Ces cinétiques dépendent fortement de l’amplitude du saut de température et de la concentration de cations métalliques. L’ensemble de ces observations suggère l’existence de plusieurs voies de repliement/dépliement des G4 sur des surfaces de potentiel très rugueuses. / Guanine-quadruplexes (G4) are non-canonical DNA structures that result from the hydrophobic stacking of guanine quartets stabilized by metal cations (typically Na+ and K+). There is now an increasing body of experimental evidence of their occurrence in important cell functions correlated to their folding/unfolding mechanisms. However, only few studies have addressed the dynamical aspect of their formation. In this context, we have undertaken the study of several intramolecular G4 with a novel extension of temperature-jump experiments capable to measure the thermal denaturation and the consecutive renaturation of DNA over a time window spanning a few ten milliseconds to seconds. Conformational changes have been monitored by time-resolved circular dichroism (CD), which is known to be sensitive to the chiral arrangement of guanines in the G4 scaffolds.Prior to time-resolved measurements, within the frame of a collaboration with DISCO/SOLEIL, we have performed static synchrotron radiation CD measurements on several short G4-forming sequences, such as human telomere, thrombin-binding aptamer and c-MYC promoter sequences, displaying distinct topologies. Denaturation and renaturation kinetics are found to exhibit biphasic decays with time constants of a few hundred milliseconds and a few seconds, respectively. Those kinetics depend strongly on the amplitude of the temperature jump and the concentration of cations. Taken together these observations suggest the existence of multiple folding pathways on extremely rugged landscapes.

The chemical bonds that hold molecules together are composed of electrons, and in order to study these microscopic systems, electronic structure calculations are often employed. This thesis describes the results from several studies that use computational techniques to investigate a variety of bonding interactions. The systems presented range from small water clusters to large DNA quadruplexes. High-level computational techniques, such as ab initio and density functional theory methods, were applied as well as the quantum theory of atoms in molecules (AIM). AIM uses the gradient to analyze the electron density, partitioning the molecule into atomic fragments. Once the system is partitioned, individual atomic contributions to molecular properties can be determined. Furthermore, bonding interactions can be identified by the presence of a specific type of critical point within the topology. These two facets of AIM are exploited throughout this thesis. The first project presented is a theoretical investigation of the exact electronic structure of hydrated electrons. Whether the excess electron resides within a central cavity or is smeared out over the surface of the cluster remains a contentious issue. In an attempt to investigate this dilemma from a novel viewpoint, AIM was used to analyze the electron density of small anionic water clusters up to ten water molecules. The results suggest that the preferred site of binding is dictated by the relative orientation of the non-hydrogen-bonded hydrogen atoms. At the other end of the spectrum, the largest systems investigated were several guanine quadruplexes that can form in telomeric regions of DNA. In light of the attention these structures have received as potential therapeutic agents, a clear understanding of their formation is mandatory. The study presented here is a detailed investigation of the electronic energy changes associated with the folding of the quadruplex from the single-stranded telomere. After devising a novel method to display the atomic energy data, several interesting trends in the energy changes were identified. Ultimately, the data presented could help to guide future drug development endeavours, highlighting one of the many practical applications of computational methods.

G-quadruplexes (G4s) are four-stranded, non-canonical secondary DNA structures which have been shown to readily form in G-rich sequences in vitro. G4 formation can affect chromatin architecture and has been implicated in promoting genomic instability, and linked to biological processes such as transcription, replication and telomere maintenance. In this project, ChIP-seq data derived with G4-specific antibodies from mouse embryonic stem cells (mESC) are analysed and integrated with different histone 3 (H3) modification data sets.The analysis method follows a standard ChIP-seq data analysis workflow, which includes steps such as calculation of quality metrics, peak calling and downstream analyses. The results show enrichment of G-rich motifs and prevalence of G4s in functional regions such as promoter-TSSs and 5'UTRs. In addition, there is some evidence of a potential association with oncogene promoter regions and location of G4s, which would support previous findings. Furthermore, the results indicate a possible correlation between loss of histone modifications H3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3) and H3 lysine 27 acetylation (H3K27ac), and G4 occurence. G4s have become increasingly popular to study in recent times and may harbour potential to be targeted for cancer therapy.

Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canoniques d'acides nucléiques formées par des séquences d'ADN ou d'ARN contenant des blocs de guanines. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus cellulaires, en particulier au niveau des télomères. Dans ce dernier cas, la formation de G4 aux télomères au moyen de ligands favorisant ces structures pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé une méthode de criblage à moyen débit permettant de tester l'effet de diverses molécules sur la stabilisation du G4 télomérique humain. Cette méthode, basée sur la dénaturation thermique de G4 suivie en fluorescence, en présence d'autres structures compétitrices d'ADN, a permis d'identifier plusieurs familles de ligands présentant des affinités et des sélectivités intéressantes, tels que des dérivés macrocycliques de néomycine et des N-méthylbisquinolinium phénanthrolines. Nous avons ensuite caractérisé plus précisément les mécanismes moléculaires expliquant la stabilisation des G4 par divers ligands. L'étude cinétique sur un modèle de G4 tétramoléculaire a permis de mettre en évidence la possibilité d'une accélération importante de la vitesse d'association des G4 par certaines familles de composés. Nous avons également analysé l'inhibition de la télomérase en présence de ces ligands. En utilisant un test d'extension d'amorce par la télomérase, nous avons montré que seuls certains ligands étaient capables d'enrayer l'élongation par la télomérase sur un substrat ne formant pas initialement de G4 intramoléculaire. Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle les effets cellulaires de ces ligands ne sont pas uniquement corrélés à leur effet sur la télomérase, mais aussi à des effets connexes impliquant d'autres protéines télomériques, essentielles au maintien de télomères fonctionnels. Enfin, nous avons transposé cette stratégie de ciblage du télomère pour limiter la prolifération cellulaire, à l'agent pathogène responsable de la Malaria : Plasmodium falciparum. Nous avons montré l'existence d'une extrémité télomérique 3' sortante chez le parasite et son potentiel repliement en G4 dans des conditions physiologiques. Plusieurs molécules stabilisant les G4 télomériques du parasite avec une bonne sélectivité ont été identifiées, et leur impact sur sa prolifération a été testé.

Il est connu depuis presque 50 ans que, dans certaines conditions, les dérivés de guanosine peuvent former des tétrades. Ces tétrades résultent de l'arrangement coplanaire de quatre guanines reliées par des liaisons hydrogène de type Hoogsteen. Ces motifs particuliers représentent un modèle pertinent pour l'étude des phénomènes d'auto-assemblage et de synthèses non covalentes via la formation de liaisons hydrogène. Dans la première partie de ce manuscrit nous décrirons comment l'utilisation d'un gabarit peptidique peut contraindre la formation d'une telle organisation. L'introduction de contraintes conformationnelles permet de contrôler la formation de tétrades de guanines synthétiques dans l'eau sans la présence de cation normalement nécessaire pour stabiliser de tels édifices. Deux architectures ont été développées et caractérisées et les études effectuées permettent de comprendre les phénomènes intervenant dans la structuration de ces tétrades synthétiques. Il est également connu que les acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires particulières, connues sous le nom de quadruplexes d'acides nucléiques, formées par l'empilement de tétrades de guanines. Ces motifs particuliers interviennent dans de nombreux phénomènes biologiques (maintenance des régions télomériques, activation des oncogènes, ...) et représentent des cibles intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses. Néanmoins l'étude des phénomènes de reconnaissance de ces motifs par de petites molécules organiques est perturbée par des phénomènes de polymorphisme inhérent aux motifs quadruplexes. Nous proposons dans un deuxième chapitre, le développement de mime de quadruplexe basé sur l'utilisation d'un gabarit peptidique pour le contrôle de la présentation de courtes séquences nucléotidiques et le développement d'architectures présentant une topologie contrôlée. Un intérêt tout particulier a été apporté à l'étude de l'interaction de petites molécules organiques avec de tels motifs par SPR. Les expériences réalisées confirment que l'approche employée peut être utilisée pour comprendre les interactions mises en jeu et sélectionner des ligands de quadruplexes performants.

Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canonique d’acides nucléiques à quatre brins formées à partir de séquences ADN ou ARN riches en guanines. Ces structures reposant sur la formation et l’empilement de quartets de guanines sont très polymorphes, leur formation pourrait être envisagé dans de nombreux domaines d’application, aussi bien pour les biotechnologies que les nanotechnologies. L’étude de G4 tétramoléculaires modifiés présentée dans ce manuscrit a participé à la compréhension du mécanisme d’association de ces complexes. En particulier, nous avons montré que l’insertion de 8-méthyle-2’-déoxyguanosine à l’extrémité 5’ de la séquence favorise l’association et la stabilité du G4. Par ailleurs, l’étude de l’ADN en série L (image de l’ADN naturel dans un miroir) a montré la formation d’un G4 tétramoléculaire avec les mêmes propriétés que son énantiomère, à l’exception de sa chiralité, qui est inversée. L’étude a révélé également une auto-exclusion de deux énantiomères (forme D et forme L) démontrant un assemblage contrôlé des brins parallèles. Ce travail de thèse a aussi permis d’introduire un système simple et stable de visualisation de G4 tétramoléculaire antiparallèle, appelé “ADN synaptique”, sur une nanostructure d’ADN origami. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus biologiques, en particulier au niveau des télomères. Nous avons réalisé, au cours de cette thèse, une étude comparative de la structure et de la stabilité des séquences télomériques connues de différents organismes. Cette étude a permis d’enrichir les données nécessaires au développement d’un algorithme prédisant la stabilité de G4. Enfin, nous avons développé une méthode facile et peu coûteuse de criblage (G4-FID) sur plaques 96 puits permettant d’identifier l’interaction de ligands avec différentes séquences biologiques pertinentes. La stabilisation du G4 dans certaines régions du génome via des ligands spécifiques pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales et est donc intéressante pour les thérapies anticancéreuses. / Guanine quadruplexes (G4) are non-canonical four-stranded nucleic acid structures formed by guanine-rich DNA and RNA sequences. Theses polymorphic structures are built from the stacking of several G-quartets and could be involved in many fields, in biotechnology as well as in nanotechnology. The study of modified tetramolecular G4 presented in this manuscript participated to the understanding of tetramolecular G4 formation. Especially, we showed that the insertion of 8-methyl-2’-deoxyguanosine at the 5’-end of the sequence accelerate G4 formation and increase its stability. Besides, we demonstrate here that short guanine rich L-DNA strands (mirror image of natural DNA) form a tetramolecular G4 with the same properties than their enantiomer, but with opposite chirality. The study revealed also self-exclusion between two enantiomers (D- and L- form), showing the controlled parallel self-assembly of different G-rich strands. This work introduced also a simple and stable system to observe tetramolecular antiparallel G4 formation, called “synaptic DNA”, into a DNA origami nanostructure. In vivo, such structures appear to be implicated in genome dynamics, and especially at telomeres. During this thesis, we dedicated a study to the comparison of G4 folding and stability of known telomeric sequences from different organisms. The present study allowed enriching the dataset necessary to build and refine algorithms predicting G4 stability. Last but not least, we developed a G4 ligand screening method onto 96-well plates allowing the comparison of different biological relevant sequences. The G4 stabilisation by specific ligands in some genome regions may prevent cancer cell proliferation, making it an attractive target for anticancer therapy.