Human telomeric DNA consists of tandem repeats of the sequence 5'-d(TTAGGG)-3' assembled into a nucleoprotein complex that functions to protect the ends of chromosomes. Such guanine-rich DNA is capable of forming a variety of G-quadruplexes, which in turn, can have varying functional consequences on telomere maintenance. G-quadruplex stabilizing ligands have been shown to induce chromosome end-to-end fusions, senescence and apoptosis, effects similar to the expression of a dominant-negative TTAGGG Repeat Factor 2 (TRF2). With this in mind, we analyzed the effect of sequence and length of human telomeric DNA, as well as cation conditions on G-quadruplex formation by native polyacrylamide gel electrophoresis and circular dichroism. We show that K+ and Sr2+ can induce human telomeric DNA to form both inter- and intramolecular structures. Circular dichroism results suggest that the structures in K+ were a mix of parallel and antiparallel G-quadruplexes, while Sr2+ induced only parallel-stranded structures. We also found that TRF2, a protein essential for telomere maintenance, affects G-quadruplex structure. These structures serve as useful models to study the effects of G-quadruplexes on the activities of telomeric proteins, like TRF2, from human cells. The G-strand overhang at the ends of telomeres may periodically adopt at least some of these quadruplex conformations, which could subsequently affect protein binding and telomere function. TRF2, a protein essential for telomere maintenance, is not known to bind single-strand (ss) DNA, work performed in the lab suggested that the type of 3'-overhang in telomeric DNA ss/ds-junctions affects TRF2-binding. Specifically, preventing G-quadruplex formation by changing the overhang sequence from 5'-d(TTAGGG)4-3', to 5'-dTTAGGG(TTAGAG)2TTAGGG-3', reduced TRF2 recruitment to the ss/ds-junction from HeLa cell extracts. Using the same techniques as above, we show that the N-terminal basic domain of TRF2 in K+ induces a switch from the mixed parallel/antiparallel-stranded G-quadruplexes usually stabilized by K+-alone, to parallel-stranded G-quadruplexes. Interestingly, it also promotes intermolecular parallel G-quadruplex formation on non-quadruplex, single-stranded intermediates, but will not induce a switch from an antiparallel to a parallel G-quadruplex in Na+. These results are the first to demonstrate specific TRF2 G-quadruplex interactions, suggesting a novel mechanism for TRF2 recognition of the ds/ss junction of telomeres.

TRF2 is a multifunctional protein implicated in telomere length maintenance, DNA double strand break repair and telomere protection. TRF2 undergoes extensive post-translational modification including phosphorylation. Mass spectrometry analysis has identified two candidate TRF2 phosphorylation sites: T317 and S323. In this study, the roles of these two potential phosphorylation sites were examined for their role in cell growth, telomere length maintenance and DNA damage response. Through retroviral infection, HT1080, HeLaII and GM847 cell lines stably expressing the vector alone, Myc-tagged wild type TRF2, Myc-tagged TRF2 carrying a nonphosphorylatable mutation of either T317A or S323A and Myc-tagged TRF2 carrying a phosphomimic mutation of either T317D or S323D were generated. Overexpression of TRF2 mutant alleles has no effect on cell growth and proliferation as well as TRF2 association with ALT-associated PML bodies. On the other hand, the effect of TRF2 mutant alleles on DNA damage response and telomere length maintenance is inconclusive and requires further investigation. / Thesis / Master of Science (MSc) / TRF2 is a multifunctional protein implicated in telomere length maintenance, DNA damage repair and telomere protection. TRF2 undergoes extensive post-translational modification, which in turn regulates its DNA binding activity, protein stability and cellular localization. TRF2 is found to be phosphorylated at a number of serine/threonine sites, including T317 and S323. In this study, the candidate phosphorylation sites T317 and S323 of TRF2 were analyzed for their potential roles in cell growth, telomere length maintenance and DNA damage response.

Les télomères sont les extrémités des chromosomes linéaires des eucaryotes.Ils sont constitués de répétitions en tandem d'un motif court riche enguanine, et liés par des protéines spécifiques. Chez les vertébrés cesprotéines forment un complexe appelé le shelterin et dont l'intégrité estcritique pour assurer la réplication correcte des extrémités deschromosomes, et pour les protéger contre une prise en charge illicite parles voies de réparation des cassures double-brin de l'ADN. Des dysfonctionsdes télomères engendrent une instabilité du génome qui peut conduire à lasénescence ou au cancer. Les télomères représentent une région subnucléaireoù les protéines du shelterin sont fortement enrichies, ce qui permetl'implication dans les fonctions biologiques d'interactions de basseaffinité. Parmi les protéines du shelterin, la protéine de liaison auxrépétitions télomériques TRF2 et son partenaire constitutif RAP1 sont lesfacteurs majeurs responsables de la protection des extrémités. Nous avonsétudié en détails l'assemblage du complexe TRF2/RAP1 par des approchesintégrées de biologie structurale, de biophysique et de biochimie.Nous avons montré que cet assemblage s'accompagne d'importants ajustementsde conformation des deux protéines, et implique une interaction de basseaffinité qui engage de grandes régions des deux protéines et affecte leurspropriétés d'interactions. / Telomeres are the ends of eukaryotic linear chromosomes. They are made oftandem repeats of a short guanine-rich motif and bound by specific proteins.In vertebrates, these proteins form a complex called shelterin, theintegrity of which is critical to ensure proper replication of chromosomeends and to protect them against illicit targeting by DNA double-strandbreak repair pathways. Telomere dysfunctions lead to genome instability,which can ultimately cause senescence or cancer. Telomeres are a subnuclearregion in which shelterin proteins are highly enriched, enhancing lowaffinity interactions of important biological function. Among shelterinproteins, telomeric repeat-binding protein TRF2 and its constitutive partnerRAP1 are the main factors responsible for end protection. We studied indetails the assembly of TRF2/RAP1 complex by means of integrated structural,biophysical and biochemical approaches. We showed that this assemblydisplays important conformational adjustments of both proteins, and involvesa low affinity interaction engaging large regions in both proteins whichaffects their interaction properties.

Les télomères sont des structures complexes associant des répétitions de séquences nucléotidiques TTAGGG à diverses protéines dont le complexe shelterin. Le TRF2 (Telomeric repeat-binding Factor 2) est un composant majeur de ce complexe, indispensable à la formation de la boucle télomérique T-loop qui permet la protection des extrémités vis-à-vis des exonucléases et systèmes de réparation de l'ADN. Ce facteur est aussi impliqué dans la tumorigenèse de nombreux cancers. Le carcinome épidermoïde oral représente 90% des cancers des Voies Aéro-Digestives Supérieures (VADS) sixième cause de cancer dans le monde avec une incidence de plus de 14000 nouveaux cas en France en 2012. Souvent diagnostiqué par des chirurgiens-dentistes, c'est un cancer de mauvais pronostic traité par chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie et thérapies ciblant le R-EGF. Peu d'études se sont intéressées à l'expression de TRF2 dans le carcinome épidermoïde oral et leurs résultats contradictoires ne permettent pas de comprendre son rôle dans leur agressivité.L'expression de TRF2 a été analysée dans les biopsies de 62 patients atteints d'un carcinome épidermoïde oral, à l'aide d'un score de lecture en immunohistochimie. Une forte expression de TRF2 est associé une survie globale significativement plus faible ce qui en fait un facteur pronostique pertinent. In vitro, une faible expression de TRF2 induit une modification du profil sécrétoire des cellules tumorales qui se traduit in vivo par des modifications de l'architecture tissulaire de tumeurs chez la souris nude. Enfin, TRF2 est un marqueur prédictif de réponse aux thérapies ciblées, leur efficacité étant optimale lorsque TRF2 est faiblement exprimé. / Telomeres are composed of tandmely repeated TTAGGG nucleotidic sequences associated with various proteins including shelterin complex. TRF2 (Telomeric repeat-binding Factor 2) is the major component of this complex, necessary for T-loop formation which protects telomeres from DNA damage response and exonucleases. Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is the most incident subtype of head and neck cancer (90%), sixth most common cancer in the world with an incidence of 14000 cases in France in 2012. Often diagnosed by dental surgeons,this bad prognosis malignancy is treated by surgery, radiotherapy, chemotherapy and targeted therapies against EGFR. Few studies evaluated TRF2 expression in OSCC and their results are discrepant. TRF2 expression has been assessed in immunohistochemistry in 62 tumoral samples of patients with an history of OSCC. TRF2 overexpression is associated with bad prognosis. TRF2 knockdown changes cells' secretome thus modifying tumoral tissue architecture. Our results showed that TRF2 is predictive for treatment response in targeted therapies in OSCC.

La protéine télomérique TRF2 permet de protéger les télomères notamment en régulant leur taille. Dans des cellules humaines, la surexpression de la protéine mutante TRF2ΔB, dont le domaine basique est absent, induit un raccourcissement soudain des télomères. In vitro, ce domaine basique protège des structures d’ADN particulières, appelées Jonctions de Holliday (JH), de la résolution par des endonucléases. Ces JH peuvent être présentes aux télomères d’une part au niveau de la boucle télomérique, une conformation de l’ADN qui ressemble à une structure intermédiaire de la recombinaison homologue (RH), et d’autre part au niveau des fourches de réplication bloquées, fréquentes aux télomères. Nous pensons que le raccourcissement soudain des télomères implique la résolution de JH au cours d’un événement de recombinaison homologue qui doit être étroitement régulé afin d’éviter qu’il ne se réalise de façon inappropriée. Dans le but de mieux caractériser cet événement, j’ai montré que différentes endonucléases capables de résoudre des JH (GEN1, MUS81, SLX1-SLX4) sont impliquées dans le raccourcissement des télomères induit par la surexpression de la protéine TRF2ΔB. Puis j’ai étudié le rôle de la protéine hRAP1 dans la régulation de ce mécanisme et l’implication des protéines de la RH. L’ensemble des résultats obtenus nous ont permis de proposer un nouveau rôle de la protéine TRF2 dans la régulation des événements de recombinaison homologue au cours de la réplication des télomères. / The stability of mammalian telomeres depends upon TRF2 which prevents inappropriate repair and checkpoint activation. In human cells, overexpressing a TRF2 mutant lacking the N-terminal basic domain, TRF2ΔB, induces sudden telomere shortening. In vitro, the basic domain protects particular DNA structures, called Holliday junctions (HJ), of the resolution by endonucleases. These HJ may be present at telomeres in one hand at the t-loop, a DNA conformation looking like a structural intermediate of homologous recombination (HR), and also at the level of stalled replication forks, frequent at telomeres. We believe that the sudden shortening of telomeres involves the resolution of HJ during a HR event that would be tightly regulated to prevent it occurs inappropriately. In order to better characterize this event, I have shown that different proteins harbouring resolving activities (GEN1, MUS81, SLX1-SLX4) are involved in telomere shortening induced by overexpression of TRF2ΔB. Then, I studied the role of hRAP1 in the regulation of this mechanism and involvement of HR proteins. The overall results allowed us to propose a new role of TRF2 in the regulation of HR events during the replication of telomeres.

Les télomères sont des structures spécifiques nucléoprotéiques localisées aux extrémités des chromosomes. Ils protègent les chromosomes contre la dégradation, les recombinaisons et les fusions et permettent qu’ils ne soient pas reconnus comme des cassures à l’ADN. Ils sont composés d'ADN télomérique, constitué de répétitions de la séquence TTAGGG, qui se prolonge par une extrémité 3’ simple brin, et de six protéines télomériques dont la protéine TRF2 qui sont indispensables au maintien de l’intégrité des télomères. Le brin riche en guanines est capable, en présence de cations monovalents, de se replier sur lui- même en une structure à quatre brins, la structure G-quadruplexe. Sa stabilisation par des ligands est une stratégie anti-tumorale car elle provoque des perturbations télomériques conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Comme les télomères sont des séquences riches en guanines, ils peuvent aussi constituer une cible potentielle des complexes de platine. Notre objectif consiste à augmenter le ciblage des télomères en associant au sein de la même molécule, un ligand de structure G-quadruplexes qui reconnaitrait ces structures avec un atome de platine qui les bloquerait ensuite irréversiblement. La tolyl-terpyridine-Pt(II), (Pt-ttpy) a été conçue dans ce but. Elle stabilise et se fixe irréversiblement sur les structures G-quadruplexe in vitro. Nous avons analysé les perturbations télomériques induites par ce ligand de G-quadruplexes (Pt-ttpy) en comparaison avec des complexes qui ne stabilisent pas ces structures (terpyridine-Pt(II) ou Pt-tpy, et le cis-platine drogue anti-tumorale utilisée en chimiothérapie) et quantifié le nombre de complexes fixés au niveau des télomères. Nous avons travaillé sur deux lignées cancéreuses d’ovaire sensibles et résistantes au cis-platine (A2780 A2780-cis) et une lignée non-cancéreuse BJ-hTERT. Les complexes Pt-ttpy et Pt-tpy inhibent la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses à des doses de l’ordre du µM et ne montrent aucune résistance croisée avec le cis-platine. Nos résultats obtenus par ChIP et immunofluorescence montrent sans ambiguïté que Pt-ttpy délocalise 50% de protéine TRF2 des télomères uniquement des cellules cancéreuses et augmente les dommages au niveau de l’ADN télomérique par rapport aux complexes qui ne sont pas des ligands de G-quadruplexes, sans pour autant induire un raccourcissement des télomères. Donc l’association d’un ligand de G-quadruplexes avec un atome de platine au sein d’une même molécule permet de cibler préférentiellement les télomères des cellules cancéreuses par rapport au complexe de platine seul. Cependant, les perturbations télomériques induites par Pt-ttpy n’ont pas été augmentées par rapport aux meilleurs ligands de G-quadruplexes connus. De façon intéressante, et pour la première fois dans la littérature, nous avons montré que nos deux complexes Pt-ttpy, Pt-tpy ciblent directement les télomères des cellules cancéreuses puisqu’ils s’y fixent. Ils augmentent la préférence de fixation à l’ADN télomérique/l’ADN génomique d’un facteur 15 par rapport au cis-platine. Cette préférence de fixation semble indépendante de la reconnaissance de structures G-quadruplexes mais semble plutôt dépendre de la nature des complexes de platine. D’autre part, à cause de la faible quantité de complexes retrouvée au niveau des télomères, leur fixation aux télomères ne peut être responsable, à elle seule, la délocalisation de TRF2, suggérant que le déplacement de TRF2 des télomères n’est pas dû un empêchement physique mais plutôt à une réponse biologique. Ainsi, nos travaux montrent que les molécules hybrides ligands de structure G-quadruplexes-Pt(II) sont une stratégie intéressante pour ciblage des télomères des cellules cancéreuses. Ceci ouvre la voie au développement de nouveaux complexes dont le facteur de préférence pour l’ADN télomérique et également la quantité de complexe fixée au niveau de l’ADN télomérique seraient augmentés par rapport à Pt-ttpy / Telomeres are specialized nucleoprotein complexes located at the end of chromosomes. They protect chromosomes from degradation, recombination and telomeric fusions and avoid them to be recognized as DNA breaks. They are composed of telomeric DNA consisting of repetitions of the sequence TTAGGG, which is extended by a 3 'single-stranded DNA, and of six telomeric proteins which TRF2 protein, that are essential to the maintenance of the integrity of telomeres. The guanine-rich strand is able to fold, in the presence of monovalent cations, in a four stranded structure, the G-quadruplexes. The stabilization of these structures is a promising anticancer strategy because it induces telomeric perturbations leading to cancer cell death. As telomeres are rich in guanines, they are potential targets for platinum complexes. Our aim is to increase the targeting of telomeres by associating within the same molecule, a ligand of G-quadruplex which stabilizes these structures with a platinum atom which then, will irreversibly block these structures. The tolyl-terpyridin-Pt(II) (Pt-ttpy) has been designed in this aim. It stabilizes and binds irreversibly to the G-quadruplex structures in vitro. We anlysed the telomeric perturbations induced by this G-quadruplex ligand (Pt-ttpy) in comparison with complexes which do not stabilize these structures (terpyridin-Pt(II) or Pt-tpy and cisplatin, an anti-tumor widely drug used in chemotherapy) and quantified the number of complexes bound to telomeres. We used two ovarian cancer cells lines, sensitive and resistant to cisplatin (A2780 and A2780-cis), and a non-cancer cell line (BJ-hTERT). Pt-ttpy and Pt-tpy inhibit cancer cell proliferation in doses at the µM range and show no cross-resistance with cisplatin. Our results, obtained by ChIP and immunofluorescence experiments, show that Pt-ttpy delocalize 50% of protein TRF2 from telomeres of cancer cells and increases the damage to telomeric DNA compared to the complexes that are not ligands of G quadruplexes, without inducing telomere shortening. Therefore, the association of a G-quadruplex ligand to a platinum atom within the same molecule allows to preferentially targeting telomeres of cancer cells compared to the platinum complex alone. However, telomeric perturbations induced by Pt-ttpy were not increased compared to the best known G-quadruplex ligands. Interestingly, and for the first time in the literature, we have shown that Pt-ttpy, Pt-tpy complexes directly target cancer cells since they bind irreversibly to them. They increase the preference of binding to telomeric DNA versus genomic DNA by a factor of 15 compared to cisplatin. This preference seems independent of the recognition of G-quadruplex structures but seems to depend on the nature of platinum complexes. On the other hand, because of the small amount of complexes bound to telomeres, their binding to telomeres cannot be at the origin, alone, of the delocalization of TRF2 from telomeres, suggesting that delocalization of telomeric TRF2 is not due to a physical impediment but rather to a biological response. Our work shows that the hybrid molecules G-quadruplex ligands-Pt (II) are an interesting strategy for targeting telomere of cancer cells. Therefore, it will be interesting to develop new complexes which would increase the preference for telomeric DNA and also the amount of platinum bound to telomeric DNA compared to Pt-ttpy

Un lien étroit existe entre l’intégrité du génome et l’architecture nucléaire. Les lamines, composants majeurs de l’enveloppe nucléaire sont impliquées dans de nombreux processus nucléaires, tels que la réplication, la transcription et le maintien de l’architecture nucléaire. Il a notamment été rapporté que les lamines de type A sont impliquées dans la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Toutefois, peu d’études ont été réalisées sur les lamines de type B. Fait intéressant, il a été observé que l’accumulation de la lamine B1 est retrouvée dans différentes tumeurs. Cependant, les conséquences d’une dérégulation de cette lamine sur la stabilité du génome restent peu documentées.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’impact d’une dérégulation de la lamine B1 sur le maintien de la stabilité du génome, notamment sur la réparation des cassures double brin de l’ADN et la stabilité des télomères. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression de lamine B1 conduit à un défaut de réparation par NHEJ, associé à une diminution de recrutement de 53BP1 aux dommages radio-induits. Nous avons également démontré que la lamine B1 interagit directement avec 53BP1, protéine impliquée dans le choix de la voie de réparation, et que cette interaction est régulée en cas de dommages à l’ADN. En effet, la liaison entre ces deux protéines est rompue après dommages en condition endogène, ce qui n’est pas le cas après surexpression de la lamine B1. Ce défaut de recrutement de 53BP1 aux dommages pourrait rendre compte de la diminution de l’efficacité du NHEJ. De plus, j’ai pu identifier les domaines protéiques impliqués dans cette interaction. Il est intéressant de noter que la surexpression du domaine de la lamine B1 impliquée dans l’interaction mime la surexpression de la lamine B1 entière. Au contraire, la lamine B1 délétée de ce domaine n’a aucun impact sur le recrutement de 53BP1 et la persistance des dommages. Ces différentes données confortent notre hypothèse quant à la séquestration de 53BP1 après surexpression de lamine B1.En parallèle, nous avons pu démontrer que la surexpression de la lamine B1 entraine l’apparition de diplochromosomes concomitants à une sénescence accrue. Ce phénomène d’endoréplication peut être induit par des défauts télomériques, tels que des télomères dysfonctionnels ou déprotégés. De façon intéressante, mes données montrent que la surexpression de la lamine B1 entrainent des dommages télomériques. Nous avons également établit que la lamine B1 interagit avec TRF2, protéine du complexe « shelterin » permettant la protection des télomères contre la signalisation des dommages à l’ADN. La rétention putative de TRF2 par la lamine B1 pourrait être à l’origine des défauts télomériques observés après la surexpression de cette dernièreCette étude démontre de nouveaux rôles de la lamine B1 dans le maintien de la stabilité du génome, notamment à travers ses interactions avec deux protéines clefs dans la réparation des cassures double brin et la stabilité des télomères. Cela nous ouvre de nouvelles pistes de recherche qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la tumorigenèse et en particulier sur le lien existant entre l’intégrité de l’architecture nucléaire et la stabilité du génome. / A close link exists between genome stability and nuclear architecture. Lamins, major component of the nuclear envelope, are involved in many nuclear processes, such as replication, transcription and nuclear architecture. It has been reported than lamins A/C are involved in double strand break repair and telomere stability. However, few studies have been conducted on B-type lamins. Interestingly, it was observed that the accumulation of lamin B1 is found in different tumors. Nevertheless, consequences of its deregulation on genome stability remain poorly documented.During my PhD, I analysed the impact of deregulation of lamin B1 on genome maintenance, including double-strand breaks repair and telomere stability. We were able to demonstrate that overexpression of lamin B1 leads to defect of NHEJ, associated with decrease of the 53BP1 recruitment to DNA damage. We have also shown that lamin B1 interacts directly with 53BP1, a protein involved in the choice of the repair pathway, and that this interaction is regulated upon DNA damage. Indeed, the association between these two proteins is disrupted after damage, in endogenous condition, in contrast this dissociation is not observed after lamin B1 overexpression. The defect of 53BP1 recruitment to DNA damage could account for the decrease in the NHEJ efficiency. Moreover, I have identify the protein domains involved in this interaction. It is interesting to note that overexpression of the interaction domain mimics the overexpression of the full lamin B1. Instead, lamin B1 deleted from this domain has no impact on 53BP1 recruitment and on DNA damage persistence. These data support our hypothesis about the sequestration 53BP1 after overexpression of lamin B1.In parallel, we have demonstrated that the lamin B1 overexpression causes the appearance of diplochromosomes concurrent to an increase of senescence. This phenomenon of endoreduplication can be induced by telomere defects such as dysfunctional or deprotected telomeres. Interestingly, I have observed that lamin B1 overexpression leads telomere damages. We also established that lamin B1 interacts with TRF2, a protein of "shelterin" complex involved in the protection against the DNA damage signaling at telomere. The putative retention TRF2 by lamin B1 could cause telomere defects observed after overexpression of the latter.This study identifies new roles of lamin B1 in maintaining genome stability, including through its interactions with two key proteins in the repair of double-strand breaks and stability of telomeres. This opens up new ways of research that will enable a better understanding of the molecular mechanisms involved in tumorigenesis and in particular on the relationship between the integrity of the nuclear architecture and genome stability.

High Mobility Group AT-hook protein 2 (HMGA2) is a non-histone chromatin binding protein expressed in stem cells, cancer cells but not in normal human somatic cells. The presence of HMGA2 in cancer correlates with advanced neoplastic disease and poor prognosis. HMGA2 plays important roles in Base Excision Repair (BER) and at replication forks. HMGA2 is present at mammalian metaphase telomeres and its loss induces chromosomal aberrations. However, the functional role of HMGA2 at telomeres remains elusive. We hypothesized a protective role of HMGA2 that guards telomeres and modulates DNA damage repair signaling pathways. Employing different HMGA2+ human tumor cell models, we investigated the HMGA2-mediated functions that contribute to chemoresistance in glioblastoma (GB). This study presents a novel interaction of HMGA2 with telomeric protein TRF2 (Telomere Repeat-Binding Factor 2). This interaction retains TRF2 at telomeres, thus capping the telomeres and reducing telomere-dysfunction induced foci despite induced telomere stress. Loss of HMGA2 coincides with increased phosphorylation of TRF2, decreased TRF2 retention at telomeres and increased formation of telomeric aggregates, anaphase bridges and micronuclei. These findings provide new evidence for a unique role of HMGA2 at telomeres as a novel contributor of telomeric integrity. We show that upon DNA damage, HMGA2 causes increased and sustained phosphorylation of Ataxia Telangiectasia and Rad3-related kinase (ATR) and checkpoint kinase 1 (CHK1). Prolonged presence of pCHK1Ser296 coincides with prolonged G2/M block and increased tumor cell survival. The relationship between (ATR)-CHK1 DNA damage response pathway and HMGA2 identifies a novel mechanism by which HMGA2 can alter DNA repair function in cancer cells. We identified HMGA2 as a novel factor contributing to temozolomide (TMZ) resistance in GB. HMGA2 knockdown sensitizes the GB cells to TMZ. We propose a specific combination of FDA-approved drugs, TMZ and Dovitinib (DOV), to increase GB cell death. We show that DOV downregulates key BER proteins, attenuates pSTAT3-coordinated Lin28A and HMGA2 expression. Our results suggest that a sequential therapeutic strategy of pretreating GB cells with DOV followed by a sequence of TMZ and DOV diminishes TMZ resistance and enhances the ability of TMZ to induce GB cell death. Overall, we identified HMGA2 as a multifunctional survival factor in human cancer cells and showed that targeting HMGA2 is a valid strategy to combat HMGA2+ cancer cells. / February 2016

Les télomères sont des séquences d’ADN, généralement répétées en tandem, localisées à l’extrémité des chromosomes linéaires. Une des fonctions principales des télomères est de différencier l’extrémité des chromosomes des cassures double-brin, et ainsi de prévenir l’activation des voies de réparation de l’ADN. Chez les mammifères, cette fonction est plus spécifiquement assurée par le complexe shelterin. Il s’agit d’un complexe hétérogène composé de six protéines distinctes : TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 et TIN2, qui interagit spécifiquement avec l’ADN télomérique. Au sein de ce complexe, les protéines RAP1 et TRF2 coopèrent afin d’empêcher l’extrémité des chromosomes d’être perçue comme un dommage de l’ADN, ce qui autrement aboutirait à des fusions inter-chromosomiques suite au processus de réparation. La protéine TRF2 se lie directement à la molécule d’ADN dans laquelle elle s’enroule de façon spécifique. Cette propriété est primordiale pour générer une structure d’ADN en forme de boucle, appelée t-loop, et dont le bon fonctionnement des télomères dépend. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont mis en évidence deux scenarii indépendants dans lesquels la protéine RAP1 assure un rôle critique dans la stabilité des télomères. Premièrement, RAP1 peut prévenir les fusions inter-chromosomiques dans des cellules exprimant une forme altérée de TRF2 incapable de former des t-loops. Deuxièmement, l’inhibition de RAP1 dans des cellules en sénescence réplicative conduit à l’activation des voies de réparation de l’ADN et à la formation de fusions inter-chromosomiques. Ces observations font écho à des résultats précédents obtenus dans des cellules HeLa traitées avec l’inhibiteur de la télomérase BIBR1532, et dont l’expression de la protéine RAP1 était abolie par shRNA. De plus, j’ai montré que les fusions interchromosomiques engendrées par la perte de RAP1 sont dépendantes de la ligase IV, qui est un acteur principal de la voie de réparation de l’ADN par recombinaison non-homologue (NHEJ). Dans l’ensemble, ces travaux démontrent l’importance de la protéine RAP1 dans la stabilité des télomères lorsque la protéine TRF2 est non fonctionnelle, mais aussi dans des situations physiologiques telles que la sénescence réplicative. / In mammals, the shelterin complex is the guardian of telomere stability. It operates through a set of six proteins (TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 and TIN2) that binds telomeric DNA and protects it from being recognized as DNA double-strand breaks and therefore control DNA repair and DNA damage response pathways. Among them, RAP1 and TRF2 cooperate and together protect chromosome extremities from end-to-end fusions. TRF2 is seen as a major factor to control telomere DNA topology by wrapping DNA around itself in a right handed manner. This property of TRF2 is required to promote the formation of t-loops, special DNA structures at telomeres that are considered as protective barriers to DNA damage response and fusion. Here we demonstrate two independent situations where RAP1 dysfunction is critical for telomere protection. First, in cells expressing a wrapping-deficient TRF2 allele that cannot form t-loops, RAP1 appears as a backup anti-fusion mechanism. Second, RAP1 downregulation in replicative senescent cells leads to telomere fusions and DNA damage response activation. This is consistent with similar observations in HeLa cells treated with the telomerase inhibitor BIBR1532, and in which RAP1 expression was abolished by an inducible shRNA system. In addition, we show that fusions triggered by RAP1 loss are dependent upon ligase IV, which is a key player of the classical non-homologous end-joining (c-NHEJ) repair pathway. Altogether, these results indicate that RAP1 takes over telomere protection when TRF2 cannot properly function or in the normal physiological situation, such as replicative senescence.

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques localisés à l'extrémité des chromosomes des cellules<br />eucaryotes. L'ADN télomérique humain contient entre 500 et 3000 repétitions de la séquence d(T2AG3)n (brin-G) et de son brin complémentaire C3TA2 (brin-C). Le brin G est terminé par une extrémité simple brin contenant de 50 à 200 nucléotides. Les télomères jouent des rôles essentiels au niveau cellulaire en permnettant la protection des chromosomes.<br />Un modèle proposé pour expliquer le rôle protecteur des télomères est le modèle de la boucle-T (télomérique) / boucle-D (déplacement). Dans ce modèle, on observe le repliement de I'ADN télomérique double brin et I'insertion de la partie simple brin dans la partie double brin. La formation de ces boucles fait intervenir, directement ou indirectement, denombreuses protéines comme les protéines TRF1 et TRF2. Néanmoins les mécanismes moléculaires et notamment le rôle de la protéine TRF2 dans la formation de ces boucles restent spéculatifs.<br />Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit expose l'étude par Résonance Magnétique Nucléaire du domaine<br />de fixation à I'ADN de la protéine TRF2 (domaine Myb) et de ses interactions avec-l'ADN télomérique ainsi que<br />l'étude de modèles de boucles-D.<br />Après la détermination de la structure tridimensionnelle et l'étude de la dynamique interne du domaine Myb de<br />TRF2, nous avons réalisé l'étude des interactions du domaine Myb avec I'ADN télomérique. Ainsi, deux complexes entre le domaine Myb de TRF2 et I'ADN télomérique ont été étudiés par RMN et ont permis de mieux comprendre le rôle du domaine Myb en montrant sa grande spécificité pour I'ADN télômérique double brin. Ensuite quatre modèles de boucles D différents ont été étudiés par RMN afin d'en déterminer les structures tridimensionnelles.