Objetivos: Avaliar o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos maturados in vitro obtidos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) e fatores masculino e/ou tubário de infertilidade. Métodos: Vinte e seis pacientes inférteis com SOP e 48 pacientes com fator tubário e/ou masculino de infertilidade, submetidas a ciclos estimulados para captação oocitária para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, foram selecionadas prospectiva e consecutivamente e divididas em grupos de estudo e controle, respectivamente. Oócitos imaturos (34 e 56 oócitos) foram obtidos de 13 e 27 pacientes, respectivamente, dos grupos SOP e controle, sendo submetidos à maturação in vitro (MIV), respectivamente, por 19 horas ± 1 hora (VG) e 4 horas ± 30 minutos (MI), conforme curva de MIV previamente realizada no presente serviço. Oócitos em metáfase II (MII) após MIV, foram fixados, submetidos a imunocoloração e microscopia de fluorescência para avaliação morfológica do fuso e da distribuição cromossômica. Resultados: Não observamos diferença significativa nas taxas de MIV entre os dois grupos avaliados (50% e 42,8%, respectivamente, para os grupos SOP e controle). Na análise por microscopia de imunofluorescência, detectaram-se 3 e 2 oócitos, respectivamente, no grupo de estudo e no grupo controle, em estágio de Telófase I e 3 oócitos ativados partenogeneticamente no grupo controle. Ocorreu a impossibilidade de análise de 4 oócitos do grupo controle em virtude de dificuldades técnicas durante o processo de imunocoloração. Não houve diferença significativa nas proporções de anomalias meióticas entre os grupos SOP e controle (57,1 e 46,7%, respectivamente). Conclusões: Os dados preliminares do presente estudo, apesar de não demonstrarem aumento significativo na incidência de anomalias meióticas nas portadoras de SOP, sugerem uma tendência a maior ocorrência de anomalias meióticas nos oócitos deste grupo de pacientes, quando comparados aos de portadoras de fator masculino e/ou tubário de infertilidade, o que deverá ser mais bem avaliado em estudos com maiores casuísticas. Estes achados têm potencial clínico para apontar uma possível explicação para as controversas menores taxas de fertilização observadas em pacientes com SOP submetidas às Técnicas de Reprodução Assistida. / Objectives: To evaluate the meiotic spindle and the chromosome distribution of in vitro matured oocytes obtained during stimulated cycles from infertile women with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) and with male factor and/or tubal infertility. Methods: Twenty six infertile patients with PCOS and 48 patients with infertility due to tubal and/or male factor, submitted to stimulated cycles for oocyte retrieval for intracytoplasmic sperm injection, were selected prospectively and consecutively and respectively assigned to the study group and the control group. Imature oocytes (34 and 56 oocytes) were obtained from 13 and 27 patients, respectively, of PCOS and control groups, and submitted to in vitro maturation (IVM) for 19 hours ± 1 hour (GV) and 4 hours ± 30 minutes (MI) according to the IVM curve previously constructed in the present service. After IVM, oocytes in metaphase II (MII) were fixed and submitted to immunostaining and fluorescence microscopy for morphological evaluation of the spindle and of chromosome distribution. Results: IVM rates were similar between the two analyzed groups (50% e 42.8%, respectively, in PCOS e control groups). By immunofluorescence analysis, there were 3 and 2 oocytes, respectively, in PCOS e control groups, in telophase I stage, and 3 parthenogenetic activated oocytes in control group. Because of technical difficulties during the execution of the immunofluorescence protocol, 4 oocytes from the control group could not be analyzed. The difference in the proportions of meiotic anomalies between the two groups was not statistically significant (57.1 e 46.7%, respectively, in PCOS e control groups). Conclusions: The present preliminary data, although not showing a significant increase in the incidence of meiotic anomalies in women with PCOS, suggest a tendency to a higher occurrence of meiotic anomalies in the oocytes of this group of patients compared to women with male and/or tubal infertility, a fact to be better evaluated in studies on larger patient series. The present findings have the clinical potential to provide a possible explanation for the controversial lower fertilization rates observed in patients with PCOS submitted to Assisted Reproduction Techniques

Os mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à endometriose não estão bem elucidados, especialmente em mulheres com estágios iniciais da doença (mínima e leve), em que não são observadas alterações anatômicas expressivas na cavidade pélvica. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente peritoneal de mulheres inférteis com endometriose que poderiam afetar a aquisição da competência oocitária e dessa forma, comprometer a fertilidade natural dessas mulheres. Para ser competente, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso meiótico morfologicamente normal e funcional, garantindo a fidelidade da segregação cromossômica durante as divisões da meiose. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi comparar o potencial impacto de diferentes concentrações (1% e 10%) de fluido peritoneal (FP) de mulheres férteis sem endometriose e mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II) sobre a integridade do fuso celular e alinhamento cromossômico de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de FP foram obtidas de 12 mulheres (6 mulheres férteis sem endometriose e 6 mulheres inférteis com endometriose mínima e leve) submetidas a videolaparoscopia, respectivamente, para realização de laqueadura tubária e investigação de infertilidade. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos a maturação in vitro (MIV) na ausência de FP, na presença de 1% e 10% de FP de mulheres férteis sem endometriose e na presença de 1% e 10% de FP de mulheres inférteis com EI/II. Foram realizados 6 experimentos de MIV e cada amostra de FP foi utilizada em apenas um experimento. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência e então analisados por microscopia confocal. A porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na ausência de FP (88.46%) e na presença de 1% (78.57%) e 10% (84.62%) de FP de mulheres férteis sem endometriose do que aqueles oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) e 10% (56.25%) de FP de mulheres inférteis com EI/II. Além disso, no grupo endometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) do que na presença de 10% (56.25%) de FP, sugerindo um efeito dose-dependente do FP de mulheres com endometriose na ocorrência de danos meióticos oocitários. Demonstrou-se que o FP de mulheres inférteis com EI/II comprometeu a maturação nuclear oocitária durante a MIV, de modo dosedependente, promovendo anormalidades meióticas em oócitos em metáfase II. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à EI/II e abrem perspectivas para o estudo de novas abordagens terapêuticas visando melhorar a fertilidade natural destas pacientes. / The etiopathogenic mechanisms of endometriosis-related infertility are not well elucidated, especially in women with early stages of the disease (minimal and mild endometriosis), where significant anatomical abnormalities in the pelvic cavity are not observed. We question if alterations in the peritoneal microenvironment of infertile women with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and in this way, compromise the natural fertility in these women. To be competent, the oocyte must be mature and have a morphologically normal and functional meiotic spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during the divisions of meiosis. Thus, the aim of the present study was to compare the potencial impact of different concentrations (1% and 10%) of peritoneal fluid (PF) from fertile women without endometriosis and infertile women with minimal and mild endometriosis (EI/II) on spindle integrity and chromosomes alignment of bovine oocytes in vitro matured (IVM). We performed an experimental study, where PF samples were obtained from 12 women (six fertile women without endometriosis and six infertile women with minimal and mild endometriosis) submitted to laparoscopy, respectively for tubal ligation and investigation of infertility. Immature bovine oocytes were submitted to IVM in the absence of PF, in the presence of 1% and 10% PF from fertile women without endometriosis and in the presence of 1% and 10% PF from infertile women with EI/II. We performed 6 experiments of IVM and each PF sample was used in only one experiment. The oocytes were fixed, immunofluorescence staining and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the absence of PF (88.46%) and in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF from fertile women without endometriosis than for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) and 10% (56.25%) PF from infertile women with EI/II. Furthermore, in the endometriosis group, the percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) than in the presence of 10% (56.25%) PF, suggesting a dose-dependent effect of PF from women with endometriosis on the occurrence of meiotic oocyte damage. The study have demonstrated that PF from infertile women with EI/II compromised the oocyte nuclear maturation during the IVM, in a dosedependent manner, promoting meiotic abnormalities in metaphase II oocytes. Our results contribute to a better understanding of the etiopathogenic mechanisms of infertility related to EI/II and open perspectives in the design of new therapeutic approaches to improve the natural fertility of these infertile women

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

Objetivos: Avaliar o fuso meiótico e a distribuição cromossômica de oócitos maturados in vitro obtidos de ciclos estimulados de mulheres inférteis com Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) e fatores masculino e/ou tubário de infertilidade. Métodos: Vinte e seis pacientes inférteis com SOP e 48 pacientes com fator tubário e/ou masculino de infertilidade, submetidas a ciclos estimulados para captação oocitária para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, foram selecionadas prospectiva e consecutivamente e divididas em grupos de estudo e controle, respectivamente. Oócitos imaturos (34 e 56 oócitos) foram obtidos de 13 e 27 pacientes, respectivamente, dos grupos SOP e controle, sendo submetidos à maturação in vitro (MIV), respectivamente, por 19 horas ± 1 hora (VG) e 4 horas ± 30 minutos (MI), conforme curva de MIV previamente realizada no presente serviço. Oócitos em metáfase II (MII) após MIV, foram fixados, submetidos a imunocoloração e microscopia de fluorescência para avaliação morfológica do fuso e da distribuição cromossômica. Resultados: Não observamos diferença significativa nas taxas de MIV entre os dois grupos avaliados (50% e 42,8%, respectivamente, para os grupos SOP e controle). Na análise por microscopia de imunofluorescência, detectaram-se 3 e 2 oócitos, respectivamente, no grupo de estudo e no grupo controle, em estágio de Telófase I e 3 oócitos ativados partenogeneticamente no grupo controle. Ocorreu a impossibilidade de análise de 4 oócitos do grupo controle em virtude de dificuldades técnicas durante o processo de imunocoloração. Não houve diferença significativa nas proporções de anomalias meióticas entre os grupos SOP e controle (57,1 e 46,7%, respectivamente). Conclusões: Os dados preliminares do presente estudo, apesar de não demonstrarem aumento significativo na incidência de anomalias meióticas nas portadoras de SOP, sugerem uma tendência a maior ocorrência de anomalias meióticas nos oócitos deste grupo de pacientes, quando comparados aos de portadoras de fator masculino e/ou tubário de infertilidade, o que deverá ser mais bem avaliado em estudos com maiores casuísticas. Estes achados têm potencial clínico para apontar uma possível explicação para as controversas menores taxas de fertilização observadas em pacientes com SOP submetidas às Técnicas de Reprodução Assistida. / Objectives: To evaluate the meiotic spindle and the chromosome distribution of in vitro matured oocytes obtained during stimulated cycles from infertile women with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) and with male factor and/or tubal infertility. Methods: Twenty six infertile patients with PCOS and 48 patients with infertility due to tubal and/or male factor, submitted to stimulated cycles for oocyte retrieval for intracytoplasmic sperm injection, were selected prospectively and consecutively and respectively assigned to the study group and the control group. Imature oocytes (34 and 56 oocytes) were obtained from 13 and 27 patients, respectively, of PCOS and control groups, and submitted to in vitro maturation (IVM) for 19 hours ± 1 hour (GV) and 4 hours ± 30 minutes (MI) according to the IVM curve previously constructed in the present service. After IVM, oocytes in metaphase II (MII) were fixed and submitted to immunostaining and fluorescence microscopy for morphological evaluation of the spindle and of chromosome distribution. Results: IVM rates were similar between the two analyzed groups (50% e 42.8%, respectively, in PCOS e control groups). By immunofluorescence analysis, there were 3 and 2 oocytes, respectively, in PCOS e control groups, in telophase I stage, and 3 parthenogenetic activated oocytes in control group. Because of technical difficulties during the execution of the immunofluorescence protocol, 4 oocytes from the control group could not be analyzed. The difference in the proportions of meiotic anomalies between the two groups was not statistically significant (57.1 e 46.7%, respectively, in PCOS e control groups). Conclusions: The present preliminary data, although not showing a significant increase in the incidence of meiotic anomalies in women with PCOS, suggest a tendency to a higher occurrence of meiotic anomalies in the oocytes of this group of patients compared to women with male and/or tubal infertility, a fact to be better evaluated in studies on larger patient series. The present findings have the clinical potential to provide a possible explanation for the controversial lower fertilization rates observed in patients with PCOS submitted to Assisted Reproduction Techniques

Os mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à endometriose não estão bem elucidados, especialmente em mulheres com estágios iniciais da doença (mínima e leve), em que não são observadas alterações anatômicas expressivas na cavidade pélvica. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente peritoneal de mulheres inférteis com endometriose que poderiam afetar a aquisição da competência oocitária e dessa forma, comprometer a fertilidade natural dessas mulheres. Para ser competente, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso meiótico morfologicamente normal e funcional, garantindo a fidelidade da segregação cromossômica durante as divisões da meiose. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi comparar o potencial impacto de diferentes concentrações (1% e 10%) de fluido peritoneal (FP) de mulheres férteis sem endometriose e mulheres inférteis com endometriose mínima e leve (EI/II) sobre a integridade do fuso celular e alinhamento cromossômico de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de FP foram obtidas de 12 mulheres (6 mulheres férteis sem endometriose e 6 mulheres inférteis com endometriose mínima e leve) submetidas a videolaparoscopia, respectivamente, para realização de laqueadura tubária e investigação de infertilidade. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos a maturação in vitro (MIV) na ausência de FP, na presença de 1% e 10% de FP de mulheres férteis sem endometriose e na presença de 1% e 10% de FP de mulheres inférteis com EI/II. Foram realizados 6 experimentos de MIV e cada amostra de FP foi utilizada em apenas um experimento. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência e então analisados por microscopia confocal. A porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na ausência de FP (88.46%) e na presença de 1% (78.57%) e 10% (84.62%) de FP de mulheres férteis sem endometriose do que aqueles oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) e 10% (56.25%) de FP de mulheres inférteis com EI/II. Além disso, no grupo endometriose, a porcentagem de oócitos meioticamente normais foi significantemente maior nos oócitos submetidos a MIV na presença de 1% (62.50%) do que na presença de 10% (56.25%) de FP, sugerindo um efeito dose-dependente do FP de mulheres com endometriose na ocorrência de danos meióticos oocitários. Demonstrou-se que o FP de mulheres inférteis com EI/II comprometeu a maturação nuclear oocitária durante a MIV, de modo dosedependente, promovendo anormalidades meióticas em oócitos em metáfase II. Nossos resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos etiopatogênicos da infertilidade relacionada à EI/II e abrem perspectivas para o estudo de novas abordagens terapêuticas visando melhorar a fertilidade natural destas pacientes. / The etiopathogenic mechanisms of endometriosis-related infertility are not well elucidated, especially in women with early stages of the disease (minimal and mild endometriosis), where significant anatomical abnormalities in the pelvic cavity are not observed. We question if alterations in the peritoneal microenvironment of infertile women with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and in this way, compromise the natural fertility in these women. To be competent, the oocyte must be mature and have a morphologically normal and functional meiotic spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during the divisions of meiosis. Thus, the aim of the present study was to compare the potencial impact of different concentrations (1% and 10%) of peritoneal fluid (PF) from fertile women without endometriosis and infertile women with minimal and mild endometriosis (EI/II) on spindle integrity and chromosomes alignment of bovine oocytes in vitro matured (IVM). We performed an experimental study, where PF samples were obtained from 12 women (six fertile women without endometriosis and six infertile women with minimal and mild endometriosis) submitted to laparoscopy, respectively for tubal ligation and investigation of infertility. Immature bovine oocytes were submitted to IVM in the absence of PF, in the presence of 1% and 10% PF from fertile women without endometriosis and in the presence of 1% and 10% PF from infertile women with EI/II. We performed 6 experiments of IVM and each PF sample was used in only one experiment. The oocytes were fixed, immunofluorescence staining and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the absence of PF (88.46%) and in the presence of 1% (78.57%) and 10% (84.62%) PF from fertile women without endometriosis than for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) and 10% (56.25%) PF from infertile women with EI/II. Furthermore, in the endometriosis group, the percentage of meiotically normal oocytes was significantly higher for oocytes that underwent IVM in the presence of 1% (62.50%) than in the presence of 10% (56.25%) PF, suggesting a dose-dependent effect of PF from women with endometriosis on the occurrence of meiotic oocyte damage. The study have demonstrated that PF from infertile women with EI/II compromised the oocyte nuclear maturation during the IVM, in a dosedependent manner, promoting meiotic abnormalities in metaphase II oocytes. Our results contribute to a better understanding of the etiopathogenic mechanisms of infertility related to EI/II and open perspectives in the design of new therapeutic approaches to improve the natural fertility of these infertile women

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage

Introdução: Apesar de controverso, questiona-se um papel deletério da endometriose nos resultados de procedimentos de reprodução assistida, o que pode estar relacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. Para que o oócito maduro esteja preparado para a fertilização, é necessário que o fuso meiótico mantenha a sua integridade e funcionabilidade. Objetivos: Comparar a presença e localização do fuso meiótico e o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis sem e com endometriose. Comparar os resultados de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre os oócitos em telófase I e metáfase II, e entre aqueles com e sem fuso celular visível, nos grupos analisados. Metodologia: Estudo prospectivo e controlado com pacientes inférteis, submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI, selecionadas consecutivamente e divididas em dois grupos: Controle (fator tubário e/ou masculino) e Endometriose (subdividido em endometriose mínima e leve I/II versus moderada e severa III/IV). Os oócitos com extrusão do primeiro CP foram avaliados pela microscopia de polarização imediatamente antes da realização da ICSI e caracterizados quanto à presença/localização do fuso celular em relação ao primeiro CP e ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Foram analisados as taxas de fertilização, clivagem, número de embriões de boa qualidade no segundo (D2) e terceiro (D3) dia de desenvolvimento oriundos dos oócitos em telófase I versus metáfase II, e metáfase II com fuso visível versus sem fuso visível, nos grupos controle, endometriose, endometriose I/II e endometriose III/IV. Resultados: Foram analisados 441 oócitos, sendo 254 do grupo controle e 187 do grupo endometriose (115 do grupo endometriose I/II e 72 do grupo endometriose III/IV). Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível e não visível (88,6%, 91,3%, 88,2%, respectivamente, nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV) e entre a percentagem de oócitos com fuso celular nas diferentes localizações nos grupos avaliados. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I no grupo endometriose III/IV (5,6%) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Observamos uma tendência a menores taxas de fertilização dos oócitos injetados em telófase I quando comparados aos em metáfase II, nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/IV (p=0,09). Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não observamos diferença significativa nos resultados de ICSI entre os grupos analisados. Conclusão: Não observamos diferença significativa entre os grupos analisados quanto à visualização e localização do fuso celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP visível. Todavia, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I nas portadoras de endometriose moderada e severa, sugerindo um retardo ou comprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em telófase I apresentam piores taxas de fertilização do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose moderada e severa, além de ser utilizado com ferramenta prognóstica pós-ICSI. / Introduction: Although it has been a controversial issue for decades, a deleterious role of endometriosis on assisted reproductive techniques (ART) outcomes is questioned, which may be related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that the meiotic spindle keeps its integrity and its function. Objectives: To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte nuclear maturation with the visible first polar body of infertile patients with and without endometriosis. To compare ICSI outcomes between oocytes on telophase I and metaphase II, and the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups. Methodology: A prospective and controlled study with infertile patients who underwent ovarian stimulation for purposes of ICSI, selected consecutively and divided into two groups: control (tubal and/or male factor) and endometriosis (subdivided in minimum and mild stage I/II versus moderate and severe stage III/IV). The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately before ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle and its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II). We have analyzed the fertilization rates, clivage, number of good quality embryos on the second (D2) and third (D3) day of development from oocytes on telophase I versus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, on the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV. Results: A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 from the endometriosis one (115 from endometriosis stage I/II and 72 from endometriosis stage III/IV). No significant differences between the percentage of metaphase II with visible and non-visible meiotic spindle were found (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups, respectively). Among the apparently matured oocytes, we have observed a significant increase of oocytes on telophase I on the endometriosis III/IV group (5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). We have observed a tendency to fewer fertilization rates from the injected oocytes on telophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), endometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes with and without visible meiotic spindle, we found no significant difference on ICSI outcomes among the studied groups. Conclusions: We have found no significant difference among the studied groups regarding the visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a visible first polar body. However, we have observed a significant increase on the number of oocytes on telophase I from patients with moderate and severe endometriosis, suggesting a delay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase I present a worse fertilization rates than the ones injected on metaphase II, this finding could explain the impairment on the outcomes of ART in infertile women with moderate and severe endometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

No presente estudo avaliamos o impacto da adição de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis sem e com endometriose em estágios iniciais (I/II) e avançados [(III/IV) sem e com endometrioma] ao meio de maturação in vitro (MIV) sobre as taxas de normalidade meiótica de oócitos bovinos. Avaliamos se a L-carnitina (LC) e os ácidos graxos ômega-3 [n3, ácidos docosahexaenóico (DHA) e eicosapentaenoico (EPA)] são capazes de prevenir os danos meióticos em oócitos bovinos induzidos por FF de mulheres inférteis com endometriose I/II e III/IV durante a MIV. Para isso, realizamos um estudo experimental utilizando modelo bovino. Trinta e duas amostras de FF foram colhidas de 24 mulheres inférteis com endometriose (8 com I/II, 8 com III/IV sem endometrioma e 8 III/IV com endometrioma no ciclo) e 8 sem endometriose (controle) que foram submetidas à estimulação ovariana controlada para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Complexos cumulus-oócitos (CCOs) imaturos de bovinos foram submetidos à MIV divididos em 9 grupos: sem FF (sem-FF), com 1% de FF de mulheres inférteis sem endometriose (FFControle) e com endometriose (FFEI/II, FFEIII/IV e FFEendometrioma) suplementados ou não com LC (0,6mg/mL) e ácidos graxos ômega-3 (0,4 nM de DHA e 0,6 nM de EPA) (FFControle+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 e FFEendometrioma+LC+n3). Após 22-24h de MIV, os oócitos foram denudados, fixados e armazenados para realização de imunofluorescência para visualização do fuso meiótico e cromossomos por microscopia confocal. As taxas de metáfase II (MII) e de MII normais foram comparadas entre os 9 grupos utilizando o teste do qui-quadrado (p<0,05). Um total de 1686 CCOs imaturos foram submetidos à MIV, e 1401 oócitos foram visualizados por microscopia confocal. A adição de FF de mulheres com endometriose ao meio de MIV reduziu a taxa de MII normais (FFEI/II: 62,2%, FFEIII/IV: 70,2% e FFEendometrioma: 72,7%) comparado aos grupos sem-FF (87,2%) e FFControle (87,2%). O grupo FFEendometrioma (69,3%) apresentou a menor taxa de MII comparado a todos os demais grupos (sem-FF: 91,9%, FFControle: 89,2%, FFControle+LC+n3: 89,2%, FFEI/II: 85,4%, FFEI/II+LC+n3: 85,3%, FFEIII/IV: 80,7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90,8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86,4%). O grupo FFEIII/IV apresentou menor taxa de MII comparado ao grupo sem-FF. No grupo com FFControle, a adição de LC+n3 não alterou as taxas de MII (89,2% vs 89,2) e de MII normais (87,2% vs 82,5%). No grupo FFEI/II, a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (84,5% vs. 62,2%). No grupo FFEIII/IV a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (70,2% vs 84,1%) e de MII (90,8%), que passou a ser semelhante a dos grupos sem-FF e FFControle. No grupo FFEendometrioma a adição de LC+n3 aumentou a taxa de MII normais (86,4%), comparado ao grupo FFEendometrioma (69,3%), a qual foi similar a dos grupos sem-FF e FFControle. Portanto, o FF de mulheres com endometriose prejudica o fuso meiótico e o alinhamento cromossômico de oócitos bovinos, independentemente, do estágio da doença. Entretanto, o avanço da endometriose e a presença de endometrioma parecem ter um impacto ainda mais negativo na qualidade oocitária, prejudicando também a maturação nuclear. A adição de LC+n3 previne os danos meióticos oocitários provocados pelo FF de mulheres com endometriose em estágios iniciais e avançados. Dessa forma, sugerimos que inflamação, o estresse oxidativo e a desregulação da ?-oxidação são fatores envolvidos na alteração da qualidade oocitária e, consequente, piora da fertilidade natural de mulheres com endometriose. / In the present study, we evaluated the impact of the addition of follicular fluid (FF) from infertile women without and with endometriosis in the early (I/II) and advanced stages [(III/IV) with and without endometrioma] to the in vitro maturation (IVM) medium on the meiotic normality rates of bovine oocytes. We evaluated whether L-carnitine (LC) and omega-3 fatty acids [n3, docosahexaenoic (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA)] were able to prevent bovine meiotic oocyte damage induced by FF from infertile women with endometriosis in stages I/II and III/IV during IVM. For this, we performed an experimental study using bovine model. Thirty-two FF samples were collected from 24 infertile women with endometriosis (8 with I/II, 8 with III/IV without endometrioma and 8 III/IV with endometrioma in the cycle) and 8 without endometriosis (control) who underwent to controlled ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature cumulus oocytes complexes(COCs) of bovines were submitted to IVM divided into 9 groups: without FF (No-FF), with 1% FF of infertile women without endometriosis (FFControl) and with endometriosis (FFEI/II, FFEIII/IV and FFEendometrioma) supplemented or not with LC (0.6 mg/mL) and omega-3 fatty acids (0.4 nM DHA and 0.6 nM EPA) (FFControl+LC+n3, FFEI/II+LC+n3, FFEIII/IV+LC+n3 and FFEendometrioma+LC+n3). After 22-24h of IVM, the oocytes were denuded, fixed and stored for subsequent immunofluorescence to visualize the meiotic spindle and chromosomes by confocal microscopy. The metaphase II (MII) and normal MII rates were compared between the 9 groups using the chi-square test (p <0.05). A total of 1686 immature COCs were submitted to IVM, and 1401 oocytes were visualized by confocal microscopy. Addition of FF from women with endometriosis to the IVM medium decreased the rate of normal MII (FFEI/II: 62.2%, FFEIII/IV: 70.2% and FFEendometrioma: 72.7%) compared to the No-FF (87.2%) and FFControl (87.2%) groups. The FFEendometrioma group (69.3%) presented the lowest rate of MII compared to all other groups (No-FF: 91.9%, FFControl: 89.2%, FFControl+LC+n3: 89.2%, FFEI/II: 85.4%, FFEI/II+LC+n3: 85.3%, FFEIII/IV: 80.7%, FFEIII/IV+LC+n3: 90.8%, FFEndometrioma+LC+n3: 86.4%). The FFEIII/IV group had a lower MII rate compared to the No-FF group. In the group with FFControl, the addition of LC+n3 did not change the rates of MII (89.2% vs 89.2%) and normal MII (87.2% vs 82.5%). In the FFEI/II group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (84.5% vs 62.2%). In the FFEIII/IV group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (70.2% vs 84.1%) and MII (90.8%), which was similar to that of the No-FF and FFControl. In the FFEendometrioma group, the addition of LC+n3 increased the normal MII rate (69.3% vs 86.4%) which was similar to No-FF and FFControl groups. Therefore, the FF of women with endometriosis impairs the meiotic spindle and the chromosomal alignment of bovine oocytes, regardless of the stage of the disease. However, the progression of endometriosis and the presence of endometrioma appear to have an even more negative impact on oocyte quality, and also impairs nuclear maturation. The addition of LC+n3 prevents meiotic oocyte damages induced by FF from women with endometriosis in the early and advanced stages. Thus, we suggest that inflammation, oxidative stress and deregulation of ?-oxidation are factors involved in the alteration of oocyte quality and, consequently, worsening of the natural fertility of women with endometriosis.