The paper sheds light upon a specific issue: carbon leakage. Leakage can be understood as an unanticipated net carbon loss or gain, attributable to a climate policy, or reduction activities. Benign leakage effects are harmless. Unsettling are the ones that pose a threat to project’s environmental integrity. The Clean Development Mechanism (CDM) is no exception to such risk. In order to investigate leakage and the corresponding leakage calculation methods addressed in the CDM projects, a qualitative content analysis is conducted on 203 methodologies. Methodology documents serve as ideal textual data for examining CDM related leakage because the development of any new project must be based on methodologies. In relation to the research question, the content analysis synthesizes 11 types of leakage sources. Excluding the case where no leakage is considered, 10 type of leakage sources are then broadly classified as Activity Shift, Market Effects and Life Cycle Leakage. Their corresponding leakage calculation methods are described and reviewed in terms of their geographic reach, and leakage characteristics. A percentage pattern is presented in relation to each sector. The findings are that the vast majority of the CDM leakage calculation methods address primary leakage specific to each individual project at a localized scale, among which, methods addressing Life Cycle Leakage are in the predominant majority. Market Effects as secondary sources are acknowledged as a potential threat to the overall benefit, but the CDM methodologies offer no quantitative method.

国立情報学研究所で電子化したコンテンツを使用している。

L’acide hyaluronique (AH) est un polymère osidique aux propriétés mécaniques et biologiques d’intérêt pour le secteur de la santé et des cosmétiques. L’AH est produit à l’échelle industrielle par mise en oeuvre de souches de streptocoques groupe C et D. A l’issue de la production, une part de l’AH est libre dans le milieu de culture complexe, l’autre est associée à la capsule des cellules. La purification de l’AH est délicate en raison, d’une part, de la complexité des milieux de production et, d’autre part, des exigences de la pharmacopée européenne. L’objectif de cette thèse a été de proposer un enchaînement d’opérations et de conditions opératoires permettant une purification de l’AH à partir d’un milieu de production. Au départ, deux méthodes analytiques originales de quantification et d’évaluation de la taille de l’AH en milieux complexes ont été mises au point afin de pouvoir évaluer les critères de performance des procédés de séparation. Ensuite, quatre opérations permettant, premièrement l’extraction, deuxièmement l’élimination des cellules productrices d’AH, troisièmement la purification, et enfin, le séchage d’AH ont été établies. L’étude de l’extraction de la capsule d’AH assistée par SDS ou au TCA a permis d’établir que l’AH lié aux cellules ne représente que 7 % de l’AH produit. Il en a été déduit que cette étape n’est pas nécessaire. L’étude de la séparation des cellules du milieu de culture a montré que la microfiltration tangentielle n’est pas adaptée en raison, d’une part, d’une rétention trop élevée de l’AH (même avec des diamètres de pores supérieurs à 0,22 µm) et d’autre part, d’un colmatage trop rapide des membranes. Cette étape doit être réalisée par filtration frontale sur adjuvant de filtration (Célite). La purification de l’AH a été envisagée par diafiltration (DF) avec des membranes d’ultrafiltration. L’étude des conditions opératoires (PTM, débit d’alimentation, concentration en AH et seuil de coupure), par plan d’expériences, a permis de sélectionner des conditions qui maximisent le flux de perméat ainsi que la rétention d’AH. Ces conditions ont été appliquées en diafiltration au cours de laquelle les performances de séparation (rendement, pureté, productivité) ont été étudiées. Une méthodologie, basée sur les équations classiques de bilans de matière et de flux de perméat en DF, a alors été proposée. Cette démarche avait tout d’abord pour but de prédire lesdites performances en prenant en compte la composition complexe du milieu, de culture bactérienne mais aussi de faciliter l’agencement des étapes du procédé de purification. La diafiltration permet de satisfaire les exigences de pureté de la pharmacopée, mais pas les niveaux de certaines molécules (protéines et acides nucléiques). L’étude de l’adsorption de ces molécules sur charbon actif, en fonction de la température, de la force ionique, du pH et du type de charbon actif, a permis d’établir les conditions les plus favorables de l’élimination de ces molécules. Les équations classiques de modélisation des isothermes correspondant le mieux aux résultats expérimentaux ont été sélectionnées et utilisées avec les équations de performance en DF, afin d’associer au mieux ces deux étapes. Enfin, concernant le séchage de l’AH, deux méthodes, l’une par lyophilisation et l’autre par précipitation en solvant organique, ont été comparées. Ces dernières permettent d’obtenir moins de 20 % d’humidité et de conserver les propriétés des molécules d’AH / Hyaluronic acid (HA) is a biopolymer with mechanical and biological properties interesting the health and cosmetic areas. The industrial HA production is realized by implementation of streptococcus strains (group C or D). At the end of the production phase, a part of HA is free in a complex culture medium while the other remains associated to the cells in a capsule. The two main difficulties of the purification of HA lie, firstly, on the complexity of the production medium and, secondly, on the high requirements of the European Pharmacopoeia for such an application. The aim of this thesis was to provide an appropriate sequence of separation processes and a set of operating conditions for HA purification from a complex production medium which complies with the Pharmacopea. Initially, two original analytical methods for quantifying and evaluating the size of HA in complex environments have been developed in order to evaluate the performance criteria of the separation processes. Then, the HA extraction from the capsule, the elimination of cells, the purification and drying of HA were using classical separation processes and studied. The HA extraction by SDS or TCA showed that the HA bound to cells corresponds to 7 % of HA production. As a consequence, it was concluded that this step was not necessary. The cell separations from the culture medium by tangential microfiltration was unsuitable because of an excessive retention of HA (even at pore diameters higher than 0.22 µm) and a too fast membrane clogging. Good performances were observed with dead-end filtration using Celite. Then, the purification of HA by diafiltration (DF) with ultrafiltration membranes was considered. The operating conditions (PTM, feed rate, HA concentration and cutoff) allowing to maximize the permeate flow rate and the HA retention were selected from design of experiments methodology. The performances of purification by diafiltration (DF) in these conditions (yield, purity and productivity) were monitored. A method for predicting the performances according to the complex medium composition, based on the conventional mass balance equations and the DF permeate flow rate, was then proposed. This was done in order to facilitate the arrangement of the purification steps. In DF, the requirement of the pharmacopoeia in term of overall purity was obtained (> 95 %) but the proteins and nucleic acids levels were still above the threshold. This is why the adsorption of these molecules on activated carbon was studied as a function of temperature, ionic strength, pH and the type of activated carbon. The isotherm equations that better fitted the experimental data were selected and used combined to the equations of DF performances in order to find an appropriate chaining. Finally, the AH lyophilization and precipitation in organic solvent were compared. Both drying methods present less than 20 % moisture and preserve the properties of the molecule

La quantification de l’utilisation des antimicrobiens (UAM) est un élément clé des programmes de surveillance de la résistance aux antimicrobiens. Cette thèse a pour objectif général d’évaluer plusieurs méthodes de quantification de l’UAM dans les fermes laitières québécoises. Plus précisément, elle vise à définir un indicateur adapté au contexte canadien pour rapporter l’UAM chez les bovins, à déterminer le taux d’UAM annuel moyen dans les fermes laitières québécoises et à comparer différentes méthodes de quantification afin d’identifier une méthode potentielle de surveillance de l’UAM dans les fermes laitières québécoises. Une étude observationnelle de cohorte a été menée à partir du recrutement de 101 producteurs laitiers du Québec. Un inventaire des antimicrobiens utilisés a été réalisé pendant un an pour chaque ferme à partir de la collecte (1) des emballages de médicaments utilisés pour traiter les bovins et (2) des factures de meunerie détaillant les quantités d’aliments médicamenteux livrées. Le taux d’UAM a été estimé en nombre de doses définies par 100 vache-années. Les doses définies n’existaient pas pour les bovins au Canada et ont été développées : dose journalière (DDDbovCA) et dose pour un traitement complet (DCDbovCA). Étant donnée l’utilisation de formulations à action prolongée en production laitière (comme les intra-mammaires au tarissement), l’unité DCDbovCA a été privilégiée pour les analyses. Un taux moyen de 537 DCDbovCA/100 vache-années a été observé, soit 537 traitements antibiotiques administrés annuellement dans un troupeau standard de 100 vaches laitières. La voie d’administration intra-mammaire était la plus utilisée. Les antimicrobiens d’importance critique les plus prioritaires en médecine humaine représentaient 17,5% de l’utilisation totale. Une faible proportion de fermes utilisait des antimicrobiens médicalement importants dans l’alimentation des animaux. L’incidence des maladies n’expliquait que partiellement la variance de l’utilisation totale. D’autres facteurs restent à déterminer pour expliquer les pratiques d’UAM dans les fermes laitières québécoises. Les données issues de plusieurs méthodes de quantification ont été comparées aux données de l’étude observationnelle. Pour les médicaments vétérinaires d’une part, le taux d’UAM estimé à partir des factures vétérinaires décrivait de façon presque parfaite le taux d’UAM réel (coefficient de corrélation de concordance, CCC = 0,83) alors que les méthodes utilisant les données du programme gouvernemental « Amélioration de la santé animale au Québec » ou des registres de traitements complétés à la ferme performaient moins bien. Pour les aliments médicamenteux d’autre part, le taux d’UAM estimé à partir des prescriptions vétérinaires pour aliments médicamenteux ou à partir des informations obtenues lors d’une entrevue individuelle avec le producteur corrélait bien le taux d’UAM réel (CCC = 0,66 et 0,73 respectivement). Le projet a permis de quantifier l’UAM annuelle dans les fermes laitières québécoises (par catégorie d’antimicrobiens et voie d’administration) en utilisant un nouvel indicateur de mesure (DCDbovCA). De plus, ce projet démontre la validité des données issues des factures et prescriptions vétérinaires pour quantifier l’UAM dans les troupeaux laitiers québécois. Le logiciel de facturation utilisé par la majorité des médecins vétérinaires praticiens du Québec pourrait servir au développement d’un système provincial de surveillance et de benchmarking de l’UAM. / Quantification of antimicrobial usage (AMU) is a key component of surveillance programs on antimicrobial resistance. The general objective of this thesis was to assess different quantification methods of the AMU in Québec dairy farms. More specifically, the project was designed to define a metric adapted to the Canadian context for AMU reports in cattle, to determine the mean annual AMU rate in Québec dairy herds, and to compare several quantification methods in order to identify a potential method suitable for AMU surveillance in Québec dairy farms. An observational cohort study was conducted from the recruitment of 101 Québec dairy producers. Antimicrobials used to treat dairy cattle were quantified over one year using a garbage can audit involving the collect of (1) veterinary drugs into a receptacle and (2) medicated feed delivered on the farm from feed mills invoices. The AMU rate was estimated in number of defined doses per 100 cow-years. Defined doses were not available in Canada for cattle and were assigned as part of the project: daily doses (DDDbovCA) and course doses (DCDbovCA). Due to usage of long-acting products in dairy cattle (such as intramammary formulations for dry cows), the DCDbovCA unit was preferred for analyses. Overall, an estimated mean of 537 DCDbovCA/100 cow-years was observed, meaning that an average of 537 antimicrobial treatments were administered annually in a standard 100-cow herd. The intramammary route during lactation was the most frequently observed. Highest priority critically important antimicrobials accounted for 17.5% of the total usage. A low proportion of farms used medically important antimicrobials in animal feed. Incidence of diseases explained only partially the variance in total AMU rate. Other factors have to be determined to explain the AMU in Québec dairy farms. Data from several quantification methods were compared to the observational study data. First, for veterinary drugs, the AMU rate estimated from veterinary sales described almost perfectly the actual AMU rate (concordance correlation coefficient, CCC = 0.83), whereas other methods using data from the governmental program “Amélioration de la santé animale au Québec” or from treatment records completed on the farm were not as reliable. Second, for medicated feed, the AMU rate estimated from veterinary prescriptions for medicated feed or from information obtained by individual interviews with producers were well correlated with the actual AMU rate (CCC = 0.66 and 0.73, respectively). Quantification of AMU was successfully performed by antimicrobial category and by route of administration in Québec dairy farms over one year using a newly defined unit of measure (DCDbovCA). This project demonstrates the validity of the data extracted from veterinary invoices and prescriptions to quantify the AMU in Québec dairy herds. The billing software used by most of Québec veterinary practitioners could be used to develop a monitoring and benchmarking system of the AMU at the provincial level.

La lutte chimique est la principale méthode utilisée pour contrôler les maladies causées par les champignons phytopathogènes. Dans certains cas, desphénomènes de résistance envers les fongicides se développent au sein despopulations, altérant parfois l’efficacité des molécules. La compréhension du moded’action des fongicides et des mécanismes de résistance sous-jacents participe à élaboreret à adapter des stratégies de management anti résistance ; et ainsi permettre depérenniser la durée de vie des molécules. Le fenhexamid est un fongicide récent (BayerCropScience, 2000), avec un mode d’action unique. Il est le seul fongicide commercialisébloquant l’étape de C4-déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol. Plusieurs typesde résistance (naturelle et acquises) ont été détectées dans les vignobles européens chez lecomplexe d’espèces Botrytis spp. responsable de la pourriture grise de la vigne. Lestravaux développés durant la thèse s’inscrivent dans l’objectif de la caractérisation dumode d’action et de l’élucidation des mécanismes de résistance. Le premier axe s’estattaché à la caractérisation fonctionnelle de deux gènes impliqués dans la C-4déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol : le gène erg27 codant la 3-céto réductase,cible du fenhexamid, et le gène erg28 codant une protéine qui interagirait en partie avecla 3-céto réductase. Concernant la résistance au fenhexamid, il a été démontré que, pargénétique inverse, les mutations détectées dans le gène erg27 de différents types d'isolatsrésistants issus du vignoble (phénotypes de résistance HydR3- et HydR3+) conféraient larésistance. Par ailleurs, une analyse de fitness du phénotype le plus préoccupant(phénotype HydR3+) a été réalisée en conditions contrôlées sur des souches isogéniquesartificielles afin d’apporter une réponse sur la persistance possible de ces souches auvignoble. Une méthode fine de quantification moléculaire de ces mêmes isolats aégalement été mise au point pour faciliter le suivi de leur évolution et de la persistancedes populations naturelles à l’échelle des vignobles. Cette nouvelle méthode, nomméeASPPAA PCR, exploite le polymorphisme nucléotidique du gène erg27, à l’origine de larésistance. Enfin, la résistance naturelle au fenhexamid de l’espèce apparentée à Botrytiscinerea, appelée Botrytis pseudocinerea a été élucidée. La résistance au fongicide de cetteespèce a été expliquée par la combinaison de modifications de cible (mécanismeminoritaire) et d’une dégradation du fongicide par un cytochrome P450 nomméCyp68.4 (mécanisme majeur). Il s’agit de la première identification et caractérisationgénétique d’un mécanisme de résistance à un fongicide conférée par un processus dedétoxification chez un champignon phytopathogène. / Chemical control is the main method used to control diseases caused byphytopathogenic fungi. In some cases, the resistance phenomena towardfungicides occur within fungal populations, which might alter practicalefficiency of molecules. Understanding modes of action of fungicides andunderlying resistance mechanisms participate to the development and adaptationof management strategies against resistance, and thus help to sustain the life ofmolecules. Fenhexamid is a recent fungicide (Bayer CropScience, 2000), with aparticular mode of action. It is the only fungicide marketed blocking the C4-demethylation step of ergosterol biosynthesis. Several types of resistance (naturaland acquired) were detected in European vineyards in the Botrytis spp speciescomplex, causing grey mold disease. This work focused on the characterization ofthe mode of action and the elucidation of resistance mechanisms. The first aspectinvestigated the functional characterization of two genes involved in the C4-demethylation of ergosterol biosynthesis. The erg27 gene potentially encoding the3-keto reductase which is the fenhexamid target and the erg28 gene encoding aprotein that interact in part with the 3-ketoreductase. Concerning fenhexamidresistance, we shown by reverse genetics that mutations detected in the erg27 genefrom different resistant isolates from the vineyards (phenotypes HydR3- andHydR3+) confer resistance. Furthermore, a fitness analysis under controlledconditions on the most worrying resistant phenotype (HydR3+) was performed onisogenic artificial strains in order to predict the possible persistence of these strainsin vineyards. A fine molecular method to quantify these isolates was developed tofacilitate the follow-up of evolution and persistence of resistant populations in thevineyard. This new method, named ASPPAA PCR is based on the nucleotidepolymorphism of the erg27 gene, responsible for fenhexamid resistance. Finally,the natural resistance to fenhexamid of the related species to Botrytis cinerea, B.pseudocinerea, was elucidated. Fungicide resistance of this species is explained bythe combination of target site modifications (minor mechanism) and fungicidedegradation mediated by a cytochrome P450 named Cyp68.4 (major mechanism).This is the first characterization of a genetic resistance mechanism to a fungicideconferred by detoxification in a phytopathogenic fungus.

科学研究費補助金 研究種目:基盤研究(C)(2) 課題番号:11610113 研究代表者:村上 隆 研究期間:1999-2000年度

Im Rahmen der vorliegenden Dissertationsschrift „Semi-quantitative röntgentomographische Untersuchungen zur Biodistribution von magnetischen Nanopartikeln in biologischem Gewebe“ wurden tomographische Untersuchungen an biologischen Objekten durchgeführt. Bei diesen Objekten handelt es sich um Gewebeproben nach minimal-invasiven Krebstherapien wie zum Beispiel magnetischem Drug Targeting und magnetischer Wärmebehandlung. Der Erfolg dieser Therapien ist sowohl abhängig von der korrekten Verteilung der magnetischen Nanopartikel als auch von der Tatsache, dass diese in der Zielregion in einer ausreichenden Menge vorhanden sind. Das Vorliegen dieser beiden Voraussetzungen ist in der vorliegenden Arbeit untersucht worden. Dabei lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Quantifizierung von magnetischem Material in unterschiedlichen biologischen Gewebeproben mittels Röntgenmikrocomputertomographie (XµCT). Für diesen Zweck wurde ein Kalibrationssystem mit speziellen Phantomen entwickelt, mit dessen Hilfe eine Nanopartikelkonzentration einem Grauwert voxelweise zugewiesen werden kann. Mit Hilfe der Kalibration kann der Nanopartikelgehalt sowohl in monochromatischen als auch in polychromatischen tomographischen Daten im Vergleich zu magnetorelaxometrischen Ergebnissen mit wenigen Prozent Abweichung ermittelt werden. Trotz Polychromasie und damit einhergehenden Artefakten können 3-dimensionale röntgentomographische Datensätze mit einer geringfügigen Konzentrationsabweichung im Vergleich zur quantitativen Messmethode Magnetorelaxometrie semi-quantitativ ausgewertet werden. / The success of the minimal invasive cancer therapies, called magnetic drug targeting and magnetic heating treatment, depends strongly on the correct distribution of the magnetic nanoparticles on one side. On the other side it depends on the fact that a sufficient amount of magnetic nanoparticles carrying drugs is accumulated in the target region. To study whether these two requirements are fulfilled motivates this PhD thesis „Semi-quantitative X-ray-tomography examinations of biodistribution of magnetic nanoparticles in biological tissues“. The analysis of the distribution of the magnetic nanoparticles in tumours and other tissue examples is realized by means of X-ray-micro computer tomography (XμCT). The work focuses on the quantification of the magnetic nanoparticles in different biological tissue samples by means of XµCT. A calibration of the tomographic devices with adequate phantoms, developed in the frame of this work, opens now the possibility to analyze tomographic data in a semi-quantitative manner. Thus, the nanoparticle concentration can be allocated voxel-wise to the grey values of the three-dimensional tomographic data. With the help of calibration of the tomography equipments used, polychromatic as well as monochromatic three-dimensional representations of objects can be analyzed with regard to the biodistribution of magnetic nanoparticles as well as with regard to their quantity. The semi-quantitative results have been compared with results obtained with a quantitative measurement method magnetorelaxometry (MRX). Thereby a good agreement of the semi-quantitative and quantitative data has been figured out.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertationsschrift „Semi-quantitative röntgentomographische Untersuchungen zur Biodistribution von magnetischen Nanopartikeln in biologischem Gewebe“ wurden tomographische Untersuchungen an biologischen Objekten durchgeführt. Bei diesen Objekten handelt es sich um Gewebeproben nach minimal-invasiven Krebstherapien wie zum Beispiel magnetischem Drug Targeting und magnetischer Wärmebehandlung. Der Erfolg dieser Therapien ist sowohl abhängig von der korrekten Verteilung der magnetischen Nanopartikel als auch von der Tatsache, dass diese in der Zielregion in einer ausreichenden Menge vorhanden sind. Das Vorliegen dieser beiden Voraussetzungen ist in der vorliegenden Arbeit untersucht worden. Dabei lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Quantifizierung von magnetischem Material in unterschiedlichen biologischen Gewebeproben mittels Röntgenmikrocomputertomographie (XµCT). Für diesen Zweck wurde ein Kalibrationssystem mit speziellen Phantomen entwickelt, mit dessen Hilfe eine Nanopartikelkonzentration einem Grauwert voxelweise zugewiesen werden kann. Mit Hilfe der Kalibration kann der Nanopartikelgehalt sowohl in monochromatischen als auch in polychromatischen tomographischen Daten im Vergleich zu magnetorelaxometrischen Ergebnissen mit wenigen Prozent Abweichung ermittelt werden. Trotz Polychromasie und damit einhergehenden Artefakten können 3-dimensionale röntgentomographische Datensätze mit einer geringfügigen Konzentrationsabweichung im Vergleich zur quantitativen Messmethode Magnetorelaxometrie semi-quantitativ ausgewertet werden. / The success of the minimal invasive cancer therapies, called magnetic drug targeting and magnetic heating treatment, depends strongly on the correct distribution of the magnetic nanoparticles on one side. On the other side it depends on the fact that a sufficient amount of magnetic nanoparticles carrying drugs is accumulated in the target region. To study whether these two requirements are fulfilled motivates this PhD thesis „Semi-quantitative X-ray-tomography examinations of biodistribution of magnetic nanoparticles in biological tissues“. The analysis of the distribution of the magnetic nanoparticles in tumours and other tissue examples is realized by means of X-ray-micro computer tomography (XμCT). The work focuses on the quantification of the magnetic nanoparticles in different biological tissue samples by means of XµCT. A calibration of the tomographic devices with adequate phantoms, developed in the frame of this work, opens now the possibility to analyze tomographic data in a semi-quantitative manner. Thus, the nanoparticle concentration can be allocated voxel-wise to the grey values of the three-dimensional tomographic data. With the help of calibration of the tomography equipments used, polychromatic as well as monochromatic three-dimensional representations of objects can be analyzed with regard to the biodistribution of magnetic nanoparticles as well as with regard to their quantity. The semi-quantitative results have been compared with results obtained with a quantitative measurement method magnetorelaxometry (MRX). Thereby a good agreement of the semi-quantitative and quantitative data has been figured out.