O microquimerismo vem sendo identificado em uma série de situações biológicas, sendo decorrentes de procedimentos clínicos ou condições fisiológicas. A transfusão sangüínea é um dos procedimentos que pode produzir a mistura de células do doador com as do receptor. Na transfusão sanguínea, o maior constituinte são as hemácias, logo a interferência microquimérica que pode ocorrer deve-se apenas aos leucócitosque são transfundidos do doador. A admistração rotineira de produtos derivados do sangue é a principal causa de doenças, aonde estes hemocomponente vindos de doadores alogênicos contém leucócitos capazes de sobreviver e se expandir. Os leucócitos presentes nas bolsas de concentrado de hemácias usados em transfusões sanguíneas podem causar a doença do enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral e interferir na identificação genética do receptor. Este trabalho teve como objetivo avaliar, em um primeiro momento, o limite de detecção de microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em amostras biológicas misturadas em proporções conhecidas e, posteriormente, verificar a presença e o tempo de duração de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão sangüínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A análise foi realizada a partir de amostras biológicas de três grupos: sete misturas de DNA extraídos antes desse estudo, cinco misturas de sangue e 20 pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Todas essas amostras foram também genotipadas individualmente. A genotipagem foi realizada através de PCR seguido por eletroforese capilar, sendo amplificadas as seguintes regiões do genoma: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina. Os resultados obtidos no grupo de mistura de amostras de DNA foi observada a presença de microquimerismo de 1:30 (ou 3,3%). No grupo de misturas de sangue, microquimerismo foi identificado até a proporção de 1:10 (ou 10%). Entretanto, não foi identificada a presença de microquimerismo em amostras coletadas nas primeiras 24 hs de pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Esses resultados sugerem que a metodologia utilizada é sensível para identificar microquimerismo em misturas biológicas até o limite de 3,3%. Portanto, podemos concluir que o microquimerismo em pacientes transfundidos avaliados nesse estudo não atingiu o limite mínimo de detecção da metodologia empregada nesse trabalho. / Microchimerism has been identified in a series of biologic situations, being due to clinical procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure that can produce a mixture of donor and receptor cells. In blood transfusions, where red blood cells are the major component, microchimeric interference is due to donor leukocytes. Even blood cell components previously processed may contain a small portion of leukocytes. In some cases, the routine administration of blood-derived products may be the main cause of diseases9 because these hemocomponents from allogeneic donors contain leukocytes capable of surviving and expanding10. Leukocytes present in bags of red blood cell concentrates used in blood transfusions may cause graft-versus-host disease (GVHD), as well as fever and, viral transmission, and may interfere in the genetic identification of the recipient. This work aimed to evaluate, at first, detection limit of microchimerism, using microssatelites (short tandem repeats - STR), in mixed biological samples of controlled proportions and, later, to verify presence and duration of microchimerism in patients postblood transfusion in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Analysis was performed in biological samples from three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood mixtures and patients submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed individually. Allelic patterns were performed through PCR, using fluorescent primers, followed by capillary electrophoresis, with amplification of the following genome regions: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. These results in the group of DNA mixtures, microchimerism was observed up to 1:30 (or 3.3%). In the group of blood mixtures, microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of microchimerism was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to blood transfusion. These results suggest that the applied methodology is sensitive to identify microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3.3%. Therefore, we can conclude that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this study did not reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.

O microquimerismo vem sendo identificado em uma série de situações biológicas, sendo decorrentes de procedimentos clínicos ou condições fisiológicas. A transfusão sangüínea é um dos procedimentos que pode produzir a mistura de células do doador com as do receptor. Na transfusão sanguínea, o maior constituinte são as hemácias, logo a interferência microquimérica que pode ocorrer deve-se apenas aos leucócitosque são transfundidos do doador. A admistração rotineira de produtos derivados do sangue é a principal causa de doenças, aonde estes hemocomponente vindos de doadores alogênicos contém leucócitos capazes de sobreviver e se expandir. Os leucócitos presentes nas bolsas de concentrado de hemácias usados em transfusões sanguíneas podem causar a doença do enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral e interferir na identificação genética do receptor. Este trabalho teve como objetivo avaliar, em um primeiro momento, o limite de detecção de microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em amostras biológicas misturadas em proporções conhecidas e, posteriormente, verificar a presença e o tempo de duração de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão sangüínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A análise foi realizada a partir de amostras biológicas de três grupos: sete misturas de DNA extraídos antes desse estudo, cinco misturas de sangue e 20 pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Todas essas amostras foram também genotipadas individualmente. A genotipagem foi realizada através de PCR seguido por eletroforese capilar, sendo amplificadas as seguintes regiões do genoma: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina. Os resultados obtidos no grupo de mistura de amostras de DNA foi observada a presença de microquimerismo de 1:30 (ou 3,3%). No grupo de misturas de sangue, microquimerismo foi identificado até a proporção de 1:10 (ou 10%). Entretanto, não foi identificada a presença de microquimerismo em amostras coletadas nas primeiras 24 hs de pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Esses resultados sugerem que a metodologia utilizada é sensível para identificar microquimerismo em misturas biológicas até o limite de 3,3%. Portanto, podemos concluir que o microquimerismo em pacientes transfundidos avaliados nesse estudo não atingiu o limite mínimo de detecção da metodologia empregada nesse trabalho. / Microchimerism has been identified in a series of biologic situations, being due to clinical procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure that can produce a mixture of donor and receptor cells. In blood transfusions, where red blood cells are the major component, microchimeric interference is due to donor leukocytes. Even blood cell components previously processed may contain a small portion of leukocytes. In some cases, the routine administration of blood-derived products may be the main cause of diseases9 because these hemocomponents from allogeneic donors contain leukocytes capable of surviving and expanding10. Leukocytes present in bags of red blood cell concentrates used in blood transfusions may cause graft-versus-host disease (GVHD), as well as fever and, viral transmission, and may interfere in the genetic identification of the recipient. This work aimed to evaluate, at first, detection limit of microchimerism, using microssatelites (short tandem repeats - STR), in mixed biological samples of controlled proportions and, later, to verify presence and duration of microchimerism in patients postblood transfusion in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Analysis was performed in biological samples from three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood mixtures and patients submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed individually. Allelic patterns were performed through PCR, using fluorescent primers, followed by capillary electrophoresis, with amplification of the following genome regions: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. These results in the group of DNA mixtures, microchimerism was observed up to 1:30 (or 3.3%). In the group of blood mixtures, microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of microchimerism was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to blood transfusion. These results suggest that the applied methodology is sensitive to identify microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3.3%. Therefore, we can conclude that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this study did not reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.

O microquimerismo vem sendo identificado em uma série de situações biológicas, sendo decorrentes de procedimentos clínicos ou condições fisiológicas. A transfusão sangüínea é um dos procedimentos que pode produzir a mistura de células do doador com as do receptor. Na transfusão sanguínea, o maior constituinte são as hemácias, logo a interferência microquimérica que pode ocorrer deve-se apenas aos leucócitosque são transfundidos do doador. A admistração rotineira de produtos derivados do sangue é a principal causa de doenças, aonde estes hemocomponente vindos de doadores alogênicos contém leucócitos capazes de sobreviver e se expandir. Os leucócitos presentes nas bolsas de concentrado de hemácias usados em transfusões sanguíneas podem causar a doença do enxerto versus hospedeiro, febre, transmissão viral e interferir na identificação genética do receptor. Este trabalho teve como objetivo avaliar, em um primeiro momento, o limite de detecção de microquimerismo, através de microssatélites (STRs), em amostras biológicas misturadas em proporções conhecidas e, posteriormente, verificar a presença e o tempo de duração de microquimerismo em pacientes submetidos à transfusão sangüínea no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A análise foi realizada a partir de amostras biológicas de três grupos: sete misturas de DNA extraídos antes desse estudo, cinco misturas de sangue e 20 pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Todas essas amostras foram também genotipadas individualmente. A genotipagem foi realizada através de PCR seguido por eletroforese capilar, sendo amplificadas as seguintes regiões do genoma: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 e Amelogenina. Os resultados obtidos no grupo de mistura de amostras de DNA foi observada a presença de microquimerismo de 1:30 (ou 3,3%). No grupo de misturas de sangue, microquimerismo foi identificado até a proporção de 1:10 (ou 10%). Entretanto, não foi identificada a presença de microquimerismo em amostras coletadas nas primeiras 24 hs de pacientes submetidos à transfusão sangüínea. Esses resultados sugerem que a metodologia utilizada é sensível para identificar microquimerismo em misturas biológicas até o limite de 3,3%. Portanto, podemos concluir que o microquimerismo em pacientes transfundidos avaliados nesse estudo não atingiu o limite mínimo de detecção da metodologia empregada nesse trabalho. / Microchimerism has been identified in a series of biologic situations, being due to clinical procedures or from physiological conditions. Blood transfusion is a procedure that can produce a mixture of donor and receptor cells. In blood transfusions, where red blood cells are the major component, microchimeric interference is due to donor leukocytes. Even blood cell components previously processed may contain a small portion of leukocytes. In some cases, the routine administration of blood-derived products may be the main cause of diseases9 because these hemocomponents from allogeneic donors contain leukocytes capable of surviving and expanding10. Leukocytes present in bags of red blood cell concentrates used in blood transfusions may cause graft-versus-host disease (GVHD), as well as fever and, viral transmission, and may interfere in the genetic identification of the recipient. This work aimed to evaluate, at first, detection limit of microchimerism, using microssatelites (short tandem repeats - STR), in mixed biological samples of controlled proportions and, later, to verify presence and duration of microchimerism in patients postblood transfusion in the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Analysis was performed in biological samples from three groups: DNA mixtures isolated previously to this study, blood mixtures and patients submitted to blood transfusion. All these samples were also analyzed individually. Allelic patterns were performed through PCR, using fluorescent primers, followed by capillary electrophoresis, with amplification of the following genome regions: D3S1358, D16S539, THO1, TPOX, CSF1PO, D7S820 and Amelogenin. These results in the group of DNA mixtures, microchimerism was observed up to 1:30 (or 3.3%). In the group of blood mixtures, microchimerism was identified up to 1:10 (or 10%). However, presence of microchimerism was not identified in samples collected up to 24 h from patients submitted to blood transfusion. These results suggest that the applied methodology is sensitive to identify microchimerism in biological mixtures up to the limit of 3.3%. Therefore, we can conclude that microchimerism in patients submitted to blood transfusion evaluated in this study did not reach the minimal detection limit for the methodology applied in this work.

El propósito de este trabajo es estudiar una serie de pacientes afectos de enfermedades hematológicas, en edad pediátrica, sometidos a un trasplante de progenitores hemopoyéticos (TPH). Para ello se ha realizado el seguimiento del trasplante en pacientes que han recibido un trasplante alogénico deun donante de diferente sexo mediante el estudio del QUIMERISMO y se ha relacionado con diferentes parámetros clínico-biológicos; el seguimiento en pacientes que presentaban una alteración cromosómica al diagnóstico, tanto si recibían un TPH autólogo o un TPH alogénico, mediante el estudio de la ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR); y se ha evaluado la Influencia del cariotipo observado y del pronóstico de las alteraciones cromosómicas detectadas en el diagnóstico de la enfermedad, en la recaída y en la supervivencia post-trasplante.Se han obtenido los siguientes resultados:En el estudio del quimerismo se ha establecido un valor umbral del 1%, para considerar detección de células del paciente. Se han detectado células del paciente en el 42% de los casos mediante la técnica de FISH y en el 16% mediante citogenética. 10 de ellos, han presentado un QM estable, de los cuales seis mostraron un aumento de células del paciente que provocó la recaída clínica en tres; en uno de ellos se detectó el aumento de las células residuales antes de la recaída clínica. Se ha observado una relación estadísticamente significativa entre la presencia de QM y el seso del paciente (el 80% con QM eran niñas, y el 69% con QC eran niños) y el régimen de acondicionamiento (el 60% con QM habían recibido únicamente quimioterapia mientras que el 80% con QC habían recibido quimioterapia e ICT). La SG ha sido la misma para los pacientes con QM o con QC (65%) y la SLE ha sido menor para el grupo con QM (51% vs 75%).En el estudio de la EMR se ha establecido un valor umbral del 6% de núcleos con la fusión para considerar presencia de la reorganización BCR/ABL mediante FISH. Se ha detectado el cariotipo observado al diagnóstico en el 26% (10/38) de los pacientes. De los 10 pacientes que han presentado la EMR, en ocho la detección coincidió con la recaída clínica y en dos la detección se realizó antes de la recaída.EN EL estudio del CARIOTIPO Y su Influencia en la EVOLUCION POSTTRASPLANTE se ha observado que las alteraciones cromosómicas detectadas al diagnóstico de la enfermedad, han mantenido su valor pronóstico después del TPH. Se ha observado la evidencia de una peor evolución de las alteraciones en 11q23 en las LLA (han fallecido 2/4), y una evolución no tan desfavorable en las LMA (no ha fallecido ninguno de 4). En la presente serie, la presencia de un cariotipo alterado ha constituido un factor de mal pronóstico, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo alterado. El valor pronóstico del cariotipo se ha mantenido post-TPH, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo de pronóstico desfavorable. En la presente serie, la indicación de un TPH autólogo en le grupo de pacientes con cariotipo de mal pronóstico, no ha resultado en una mejora en la supervivencia de estos, que quizás podrían beneficiarse de un TPH alogénico no emparentado; ya que la SG y la PR ha sido del 51,8% y del 31%, respectivamente para los pacientes que recibieron un TPH alogénico y del 33% y del 75% respectivamente, para los pacientes que recibieron un TPH autólogo, siendo estas diferencias estadísticamente significativas. / In this work we have performed the follow-up of children with haematological diseases who received a progenitor cells transplantation (PCT). We have studied of chimerism in a sex-mismatched allogeneic PCT, the minimal residual disease (MRD) when the patient showed a chromosome aberration at diagnosis of the malignant disease, and we have analyzed the correlation between the karyotype at diagnosis and the outcome after of the PCT.- In the chimerism analysis we have observed a mixed chimerism (MC) we have detected more than 1% of host cells. The 42% patients showed host cells by FISH, and only the 16% by cytogenetics. Ten of them showed MC, and six of them showed a increase of the host cells, in one patient before of the clinical relapse a progressive increase of host cells was detected. The results indicate that female patients and a less intensive conditioning regimen are significantly associated with the MC status. The overall survival (OS) was similar for the patients with MC or donor chimerism (DC), and leukaemia-free survival was higher in DC than in the MC groups.- In the follow-up of MRD, BCR/ABL reorganization has been considered to exist when more than 6% of fusion nuclei was observed. The karyotype observed at diagnosis was detected 26% of patients. In two of them the karyotype showed at diagnosis was observed before of the clinical relapse.- The prognosis of the karyotype observed at diagnosis has been similar as prognostic factor in the outcome after PCT. The prognosis of 11~23 chromosome aberration in LLA was worse in LMA. To detect an abnormal karyotype at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. To detect a karyotype of the worst prognosis at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. The outcome of patient who showed a karyotype of worst prognosis at diagnosis of the disease and received an autologous PCT was worse the group of patients with karyotype of worst prognosis and who received an allogenic PCT.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pasquini / Co-orientadora: Drª. Noemi Farah Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 01/08/2014 / Inclui referências / Resumo: O resultado do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) é avaliado por meio da recuperação hematológica e da análise do quimerismo. Este estudo tem como objetivo avaliar os níveis de quimerismo em pacientes com Anemia Aplástica Severa (AAS) Adquirida com mais de 18 meses de acompanhamento pós-TCTH, que apresentaram recuperação hematológica parcial ou completa no sangue periférico. Foram analisados 104 pacientes com AAS transplantados no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná e monitorados no período de 1987 a 2012. Os pacientes foram divididos em dois grupos, conforme o regime de condicionamento. Os pacientes do grupo I (n=55) receberam ciclofosfamida (CFA) isolada, 200 mg/Kg de peso corpóreo e os do grupo II (n=49) CFA, 120 mg/Kg de peso corpóreo, associada ao bussulfano (BUS), 12 mg/Kg de peso corpóreo. Cada grupo foi subdividido de acordo com os seguintes níveis de quimerismo em relação às células do doador: ?50%, entre 51 e 90% e >90%. A análise de quimerismo foi realizada pela amplificação de locos VNTRs/STRs com detecção dos fragmentos em gel de poliacrilamida e coloração com sais de prata (84 pacientes) até julho de 2009 e após esse período por eletroforese capilar em Analisador Genético de DNA (20 pacientes). Os níveis de quimerismo foram correlacionados com as variáveis pré-transplante (idade e sexo do paciente e intervalo entre o diagnóstico e o TCTH), variáveis do transplante (idade e sexo do doador e número de células infundidas) e variáveis pós-transplante (número de neutrófilos, plaquetas e dosagem de hemoglobina após 18 meses do transplante). A análise dos resultados mostrou associação entre os níveis de quimerismo e os tipos de condicionamento empregados (p<0,001). A recuperação autóloga (quimerismo ?50%) foi encontrada em 36,4% dos pacientes do grupo I e em nenhum dos pacientes do grupo II. Quimerismo entre 51 e 90% foi identificado em 11 pacientes (20,0%) do grupo I e em 5 pacientes (10,2%) do grupo II. Quimerismo >90% foi mais frequente no grupo II (89,8%) quando comparado ao grupo I (43,6%). As características pré-transplante (idade e sexo do paciente e intervalo entre o diagnóstico e o TCTH) e do transplante (idade e sexo do doador) não mostraram associação ao quimerismo em nenhum dos grupos. O maior número de células infundidas mostrou associação com níveis de quimerismo mais elevados nos pacientes do grupo I (p=0,013) e não apresentou associação nos do grupo II. A análise multivariada mostrou que o nível de quimerismo >90% está associado ao condicionamento com CFA+BUS (p<0,001) e ao maior número de células infundidas (p=0,009). A recuperação hematológica, avaliada com base no último hemograma disponível, mostrou associação entre o número mais elevado de neutrófilos (p=0,003) e de plaquetas (p<0,001) e maior grau de quimerismo nos pacientes do grupo I. A dosagem de hemoglobina não mostrou associação com o quimerismo nos dois regimes de condicionamento. Este estudo sugere que o condicionamento com CFA associada ao BUS e o maior número de células infundidas são fatores preditivos da evolução do enxerto alogênico de células-tronco hematopoéticas. Os resultados deste estudo reforçam que a recuperação autóloga da hematopoese depende da intensidade da imunossupressão exigida para cada caso e que a função imunossupressora da CFA isolada pode induzir a regeneração hematológica autóloga. Palavras-chave: Anemia Aplástica Severa. Transplante de células-tronco hematopoéticas. Condicionamento. Quimerismo. / Abstract: The outcome of hematopoietic stem cell transplantation is evaluated (HSCT) by hematologic recovery and chimerism analysis. The aim of this study is to assess the levels of chimerism in Acquired Severe Aplastic Anemia (SAA) patients with post-transplant follow up of 18 months or more, and that have showed partial or complete hematologic recovery in peripheral blood. A total of 104 SAA patients transplanted at the Hospital de Clínicas of the Universidade Federal do Paraná and monitored from 1987 to 2012 were analyzed. Patients were divided into two groups on the basis of the conditioning regimen. Group I (n=55) received only cyclophosphamide (CY) at 200mg/kg of body weight, while those of group II (n=49) received CY at 120mg/kg of body weight associated with busulfan (BUS) at 12mg/kg of body weight. Each group was then subdivided according to the following levels of chimerism in relation to the donor's cells: ?50%, from 51 to 90%, and >90%. Chimerism analysis was performed by amplification of VNTR/STR loci followed by detection of fragments in polyacrylamide silver stained gels (84 patients) until July of 2009 and, from then on, by capillary electrophoresis in DNA Genetic Analyser (20 patients). Levels of chimerism were correlated to pre-transplant (patient's age, sex, and time elapsed from diagnosis to HSCT), transplant (donor's age, sex, and number of infused cells) and post-transplant (number of neutrophils and platelets, and hemoglobin levels from18 months on after transplant) variables. Data analysis showed an association between the levels of chimerism and the different conditioning regimens (p<0.001). Autologous recovery (chimerism ?50%) was achieved by 36.4% of patients from group I and by none of those from group II. Chimerism ranging from 51 to 90% was identified in 11 patients (20.0%) from group I and in 5 patients (10.2%) from group II. Levels of chimerism >90% were more frequent in group II (89.8%) than in group I (43.6%). Pre-transplant (patient's age, sex, and time elapsed from diagnosis to HSCT) and transplant (donor's age and sex) characteristics did not show association with chimerism in either one of the groups. The largest number of infused cells showed association with higher levels of chimerism in patients from group I (p=0.013), but not with those in group II. Multivariate analysis indicated that the chimerism level >90% is associated with the conditioning regimen CY+BUS (p<0.001) and with the highest number of infused cells (p=0.009). Hematologic recovery evaluated on the basis of the last available blood count indicated an association of the largest number of neutrophils (p=0.003) and platelets (p<0.001) with the highest level of chimerism in patients from group I. Hemoglobin levels did not show any association with chimerism in either one of the groups. This study suggests that the conditioning regimen with CY and BUS as well as the highest number of infused cells are predictive factors of the establishment of hematopoietic stem cell allogeneic graft. The results of this study corroborate that hematopoietic autologous recovery relies on the intensity of immunosuppression needed for each case, and that the immunosuppressive function of CY alone can induce autologous hematologic recovery. Keywords: Severe Aplastic Anemia. Hematopoietic stem cell transplantation. Conditioning regimen. Chimerism.

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: George Shigueki Yasui / Banca: Maria Angélica Spadella / Banca: Rafael Henrique Nóbrega / Banca: Carlos Alberto Vicentini / Resumo: O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada... / Abstract: Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species "piracanjuba" Brycon orbignyanus into "lambaris" Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba's testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into "lambaris" testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration ofbusulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species "piracanjuba" (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process / Doutor

O objetivo central desta dissertação de mestrado foi analisar se, pela sua resposta ao interferon-g (IFNg), as células não leucocitárias contribuem ao controle dos protozoários Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS e Plasmodium berghei ANKA. O IFNg é uma citocina que promove a ativação de diversos tipos de leucócitos, a sua ação sobre as células mononucleares fagóciticas merece um destaque especial. Apesar de conhecermos os pormenores do papel desta citocina na ativação dos leucócitos, desconhecemos se o IFNg exerce ação ativadora sobre as células estruturais (não leucocitárias), ou seja, sobre as células não profissionais da resposta imune. A nossa hipótese de trabalho é que, no caso dos parasitas intracelulares, o IFNg poderia reforçar a ação sinalizadora e efetora das células estruturais infectadas. Por outro lado, em ambas as situações de parasitas intracelulares e extracelulares, o IFNg, ao agir sobre diversas células estruturais, poderia induzir a produção de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, etc) que contribuiriam direta ou indiretamente à remoção/controle do parasita. A nossa abordagem tem sido o estudo da infecção por estes protozoários em quimeras de medula óssea B6/IFNgRKO, nas quais as células não leucocitárias são deficientes em receptores para IFNg e as células leucocitárias são normais. A análise por imunofluorescência de cortes histológicos mostrou uma alta expressão de IFNgR pelas células estruturais do coração dos animais B6 e quimeras controle B6/B6, mas nenhuma expressão deste receptor nos cortes histológicos correspondentes de animais IFNgRKO e quimeras experimentais B6/IFNgRKO, apesar de grande parte dos leucócitos dos animais deste último grupo ter se tornado IFNgR+. Após infecção pelo T. cruzi, o coração e músculo esquelético dos animais quiméricos B6/IFNgRKO mostraram maior carga parasitária e menor intensidade dos infiltrados 8 inflamatórios do que aqueles dos animais quiméricos B6/B6, resultados que sugerem o envolvimento das células estruturais no controle do parasita e promoção do recrutamento leucocitário. Na infecção pelo Plasmodium chabaudi AS a análise comparativa dos grupos IFNgRKO e quimera B6/IFNgRKO mostrou que no início da infecção as curvas de parasitemia destes grupos são idênticas sugerindo que nesta fase da infecção a presença do IFNgR nos leucócitos em pouco contribui na evolução da parasitemia. Por outro lado, a análise comparativa dos grupos quimera B6/IFNgRKO e quimera B6/B6 mostrou níveis mais elevados de parasitemia e maior índice de mortalidade nos animais B6/IFNgRKO, sugerindo que as células estruturais participam no controle do parasita através da sua resposta ao IFNg. Entretanto, em uma experiência preliminar de infecção pelo Plasmodium berghei ANKA não observamos grandes diferenças entre os animais dos grupos B6/IFNgRKO e B6/B6, não somente no que se refere à curva de parasitemias, como também na indução de morte precoce decorrente de malária cerebral. / The main purpose of our work was to analyze if by their response to Interferon-g (IFN-g), the non-leucocyte cells are able to control Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS and Plasmodium berghei ANKA protozoans. IFNg was described as a cytokine that promote activation on different types of leucocytes, its action on mononuclear phagocytic cells is important. Despite the fact that this cytokine activate leucocytes, it is unknown whether IFNg activates the structural cells (non-leucocytes), that is, the non-professional cells of the immune response. Our hypotheses suggest that in the case of intracellular parasites, IFNg could help the infected structural cells by increasing their signaling and effect actions. In addition, during the response against intracellular and extracellular parasites, IFNg could induce the production of inflammatory mediators by these cells guaranteeing direct or indirectly the parasite clearance. In the present study, we analyzed the infection of diferente protozoans on bone marrow B6/IFNgRKO chimeras, in which the non-leukocyte cells are deficient in IFNg receptor and the leukocyte cells are normal. Immunofluorescence analyses of histological sections revealed a high expression of IFNgR on the structural cells from the heart of B6 and control chimeras B6/B6 animals, but non-expression of this receptor on histological sections from IFNgRKO and experimental chimeras B6/IFNgRKO, despite the fact that a great part of leucocytes from the last group of animals express the receptor. After T. cruzi infection, the cardiac and skeletal muscle from B6/IFNgRKO chimera animals showed a huge amount of parasite and less infiltration inflammatory than B6/B6 animals, suggesting that the structural cells are involved in the parasite control and leukocyte recruitment. During Plasmodium chabaudi AS infection, comparative analyses from IFNgRKO and 10 B6/IFNgRKO groups showed that parasitemia curves at the early phase are similar, suggesting that during this phase IFNgR expression on leukocytes are not important. On the other hand, parasitemia and mortality levels on B6/IFNgRKO and B6/B6 groups were higher than those on B6/IFNgRKO animals, determining that structural cells participate during the course of infection through their response to IFNg. However, when B6/IFNgRKO and B6/B6 animals were infected with Plasmodium berghei ANKA no significantly difference was observed between these groups related to the course of parasitemia and cerebral malaria.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:37Z : No. of bitstreams: 1 000844259.pdf: 4595767 bytes, checksum: 71dce578d9bb8bd46aa509b0383e1407 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada de e / Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species piracanjuba Brycon orbignyanus into lambaris Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba's testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into lambaris testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration ofbusulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species piracanjuba (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process.

O objetivo central desta dissertação de mestrado foi analisar se, pela sua resposta ao interferon-g (IFNg), as células não leucocitárias contribuem ao controle dos protozoários Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS e Plasmodium berghei ANKA. O IFNg é uma citocina que promove a ativação de diversos tipos de leucócitos, a sua ação sobre as células mononucleares fagóciticas merece um destaque especial. Apesar de conhecermos os pormenores do papel desta citocina na ativação dos leucócitos, desconhecemos se o IFNg exerce ação ativadora sobre as células estruturais (não leucocitárias), ou seja, sobre as células não profissionais da resposta imune. A nossa hipótese de trabalho é que, no caso dos parasitas intracelulares, o IFNg poderia reforçar a ação sinalizadora e efetora das células estruturais infectadas. Por outro lado, em ambas as situações de parasitas intracelulares e extracelulares, o IFNg, ao agir sobre diversas células estruturais, poderia induzir a produção de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, etc) que contribuiriam direta ou indiretamente à remoção/controle do parasita. A nossa abordagem tem sido o estudo da infecção por estes protozoários em quimeras de medula óssea B6/IFNgRKO, nas quais as células não leucocitárias são deficientes em receptores para IFNg e as células leucocitárias são normais. A análise por imunofluorescência de cortes histológicos mostrou uma alta expressão de IFNgR pelas células estruturais do coração dos animais B6 e quimeras controle B6/B6, mas nenhuma expressão deste receptor nos cortes histológicos correspondentes de animais IFNgRKO e quimeras experimentais B6/IFNgRKO, apesar de grande parte dos leucócitos dos animais deste último grupo ter se tornado IFNgR+. Após infecção pelo T. cruzi, o coração e músculo esquelético dos animais quiméricos B6/IFNgRKO mostraram maior carga parasitária e menor intensidade dos infiltrados 8 inflamatórios do que aqueles dos animais quiméricos B6/B6, resultados que sugerem o envolvimento das células estruturais no controle do parasita e promoção do recrutamento leucocitário. Na infecção pelo Plasmodium chabaudi AS a análise comparativa dos grupos IFNgRKO e quimera B6/IFNgRKO mostrou que no início da infecção as curvas de parasitemia destes grupos são idênticas sugerindo que nesta fase da infecção a presença do IFNgR nos leucócitos em pouco contribui na evolução da parasitemia. Por outro lado, a análise comparativa dos grupos quimera B6/IFNgRKO e quimera B6/B6 mostrou níveis mais elevados de parasitemia e maior índice de mortalidade nos animais B6/IFNgRKO, sugerindo que as células estruturais participam no controle do parasita através da sua resposta ao IFNg. Entretanto, em uma experiência preliminar de infecção pelo Plasmodium berghei ANKA não observamos grandes diferenças entre os animais dos grupos B6/IFNgRKO e B6/B6, não somente no que se refere à curva de parasitemias, como também na indução de morte precoce decorrente de malária cerebral. / The main purpose of our work was to analyze if by their response to Interferon-g (IFN-g), the non-leucocyte cells are able to control Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS and Plasmodium berghei ANKA protozoans. IFNg was described as a cytokine that promote activation on different types of leucocytes, its action on mononuclear phagocytic cells is important. Despite the fact that this cytokine activate leucocytes, it is unknown whether IFNg activates the structural cells (non-leucocytes), that is, the non-professional cells of the immune response. Our hypotheses suggest that in the case of intracellular parasites, IFNg could help the infected structural cells by increasing their signaling and effect actions. In addition, during the response against intracellular and extracellular parasites, IFNg could induce the production of inflammatory mediators by these cells guaranteeing direct or indirectly the parasite clearance. In the present study, we analyzed the infection of diferente protozoans on bone marrow B6/IFNgRKO chimeras, in which the non-leukocyte cells are deficient in IFNg receptor and the leukocyte cells are normal. Immunofluorescence analyses of histological sections revealed a high expression of IFNgR on the structural cells from the heart of B6 and control chimeras B6/B6 animals, but non-expression of this receptor on histological sections from IFNgRKO and experimental chimeras B6/IFNgRKO, despite the fact that a great part of leucocytes from the last group of animals express the receptor. After T. cruzi infection, the cardiac and skeletal muscle from B6/IFNgRKO chimera animals showed a huge amount of parasite and less infiltration inflammatory than B6/B6 animals, suggesting that the structural cells are involved in the parasite control and leukocyte recruitment. During Plasmodium chabaudi AS infection, comparative analyses from IFNgRKO and 10 B6/IFNgRKO groups showed that parasitemia curves at the early phase are similar, suggesting that during this phase IFNgR expression on leukocytes are not important. On the other hand, parasitemia and mortality levels on B6/IFNgRKO and B6/B6 groups were higher than those on B6/IFNgRKO animals, determining that structural cells participate during the course of infection through their response to IFNg. However, when B6/IFNgRKO and B6/B6 animals were infected with Plasmodium berghei ANKA no significantly difference was observed between these groups related to the course of parasitemia and cerebral malaria.