Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

QepA is a plasmid-mediated efflux pump found in some strains of Escherichia coli, in which it significantly elevates the resistance against quinolones. The protein has similarities with 14-TMS major facilitator superfamily transporters and is situated in the inner membrane of the bacteria. It was acquired by horizontal gene transfer and integrated into a now inactivated class 1 integron, also harbouring several other antibiotic resistance genes such as rmtB and blaTEM-1. QepA alone is not sufficient to raise the resistance level over the clinical breakpoint and is in clinical isolates therefore associated with other quinolone antibiotic resistance genes or quinolone target point mutations. The mechanisms regulating qepA expression are not yet understood. Therefore, in this study the qepA gene was amplified from an E. coli clinical isolate and, together with its upstream promotor sequence, was inserted into the E. coli chromosome. It was shown that qepA gene expression can be induced by exposure to 0.5-fold MIC concentrations of ciprofloxacin, trimethoprim and other DNA damaging antimicrobials. The deletion of a LexA binding site situated after a PcW promotor, which was predicted to drive qepA expression, did not alter this induction behaviour. Nested deletions of up to 200 nts downstream sequence of the PcW promotor, led to the identification of a sequence region required for expression induction. This study showed that qepA expression is induced by environmental factors leading to DNA damage and further identified a previously unknown DNA sequence required for expression regulation.

Den vanligaste cancerformen hos män är prostatacancer, med 10 000 nya dödsfall årligen. Vid prostatacancerdiagnostik utförs prostata biopsi. För att minska risken för komplikationer i samband med biopsi ges i Sverige en singeldos av antibiotikapreparatet Ciprofloxacin. Andelen bakterier som är resistenta mot ciprofloxacin har ökat. För detektion av genmutationer som orsakar antibiotikaresistens kan droplet digital PCR (ddPCR) användas. Det är en metod som ger en absolut kvantifiering av antalet DNA-sekvenser. Den är baserad på vatten olja-emulsionsdroppsystem.  Syftet med denna studie var att optimera och validera en digital droplet PCR för att detektera och kvantifiera mutationen S83L i gyrA genen från faecesprover, samt att jämföra digital droplet resultat från studieprover med odlingsresultat från resistensbestämning och ration mellan S83L allelen och vildtyps allelen i prover tagna före och efter biopsi. För att optimera och validera metoden användes prover tagna före och efter biopsi från nio patienter som genomgått en transrektal prostatabiopsi och fått en dos antibiotika profylax i samband med ingreppet.  Den optimala annealingtemperaturen bedömdes vara 60°C och den optimala  primer- och probekoncentrationen bestämdes till 1,2 µM respektive 0,4µM. Dessa koncentrationer gav lägst antal falskt positiva droppar. Den minsta detektionsnivån för S83L gyrA (EC40) var 160 kopior/ml och för vildtyps gyrA (EC108) var det 78 kopior/ml. Resultatet från valideringen visade att både vildtyps gyrA och S83L gyrA kunde detekteras och kvantifieras i rektalprover från samtliga patienter. / The most common form of cancer in men is prostate cancer, with 10,000 new deaths annually. In prostate cancer diagnosis, prostate biopsy is performed. To reduce the risk of complications in connection with biopsy, a single dose of the antibiotic drug Ciprofloxacin is given in Sweden. The proportion of bacteria that are resistant to ciprofloxacin has increased. For the detection of gene mutations that cause antibiotic resistance, droplet digital PCR (ddPCR) can be used. It is a method that provides an absolute quantification of a DNA sequence in a sample. It is based on water oil emulsion drop system.  The purpose of this study was to optimize and validate a digital droplet PCR to detect and quantify the S83L mutation in the gyrA gene from faecal samples and to compare digital droplet results from study samples with culture results from resistance determination and the ration between the S83L allele and the wild-type allele in samples taken before and after biopsy. To validate the method, samples taken before and after biopsy were used from nine patients who had undergone a transrectal prostate biopsy and received a dose of ciprofloxacin or trimethoprim in connection with the procedure.  The optimal annealing temperature was determined to be 60 °C and the optimal primer and probe concentrations were determined to be 1.2 µM and 0.4µM, respectively. These concentrations gave the lowest number of false positive droplets. The minimum detection level for S83L gyrA (EC40) was 160 copies/ml and for wild-type gyrA (EC108) it was 78 copies/ml. The results showed that both wild-type gyrA and S83L gyrA could be detected and quantified in rectal samples from all nine patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em diversos estados do Brasil, foram relatadas epidemias de infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) desde o ano 2000. A maioria dos casos foi principalmente associada ao clone BRA100 de Mycobacterium massiliense, recentemente renomeada para Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, isolado de pacientes submetidos a procedimentos invasivos nos quais os instrumentos médicos não foram adequadamente esterilizados e/ou desinfetados. Sendo as quinolonas uma opção no tratamento de infecções por MCR e sugerida para esquemas terapêuticos para esses surtos, foram avaliadas nesse trabalho as atividades in vitro de quatro gerações de quinolonas para cepas clinicas e de referência de MCR através da microdiluição em caldo. Também foram analisadas as sequências peptídicas das regiões determinantes da resistência a quinolonas (RDRQ) das subunidades A e B da DNA gyrase (GyrA e GyrB) após o seqüenciamento de DNA seguido pela tradução da sequência de aminoácidos. Cinquenta e quatro cepas de M. abscessus subsp bolletii, incluindo o clone BRA100, isoladas em diferentes estados do Brasil, e 19 cepas de referência de MCR foram caracterizadas. Todas as 54 cepas clínicas de M. abscessus subsp. bolletii foram resistentes a todas as gerações de quinolonas e mostraram o mesmo resíduo nas RDRQ, incluindo Ala-83 em GyrA, Arg-447 e Asp-464 em GyrB, descritos como sendo responsáveis por gerar um baixo nível de resistência a quinolonas em micobactérias. Porém, outras espécies de MCR apresentaram diferentes susceptibilidade e padrões de mutações contrários aos classicamente já definidos, sugerindo que outros mecanismos de resistência, diferentes de mutações em gyrA e gyrB também possam estar envolvidos na alta resistência a quinolonas. / Several outbreaks of infections caused by rapidly growing mycobacteria (RGM) have been reported in many Brazilian states since 2000. Most of the cases were mainly associated to Mycobacterium massiliense, recently renamed as Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, BRA100 clone recovered from patients who had undergone invasive procedures, in which medical instruments have not been properly sterilized and / or disinfected. Since quinolones have represented an option for the treatment of general RGM infections and suggested for therapeutic schemes for these outbreaks, we evaluated the in vitro activities of four generations of quinolones for clinical and reference RGM by broth microdilution, and analysis of peptide sequences of the quinolone resistance determining regions (QRDR) of GyrA and GyrB after DNA sequencing followed by amino acid translation. Fifty four isolates of M. abscessus subsp bolletii, including clone BRA100, recovered in different states of Brazil, and 19 reference strains of RGM species were characterized. All 54 M. abscessus subsp. bolletii isolates were resistant to all generations of quinolones and showed the same amino acids in the QRDR including the Ala-83 in GyrA, Arg-447 and Asp-464 in GyrB, described as responsible for an intrinsic low level of resistance to quinolones in mycobacteria. But other RGM species presented distinct susceptibilities to this class of antimicrobials and patterns of mutations contrary to what has been traditionally defined, suggesting that other mechanisms of resistance, different from gyrA or gyrB mutations, may also be involved in resistance to high levels of quinolones.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em diversos estados do Brasil, foram relatadas epidemias de infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) desde o ano 2000. A maioria dos casos foi principalmente associada ao clone BRA100 de Mycobacterium massiliense, recentemente renomeada para Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, isolado de pacientes submetidos a procedimentos invasivos nos quais os instrumentos médicos não foram adequadamente esterilizados e/ou desinfetados. Sendo as quinolonas uma opção no tratamento de infecções por MCR e sugerida para esquemas terapêuticos para esses surtos, foram avaliadas nesse trabalho as atividades in vitro de quatro gerações de quinolonas para cepas clinicas e de referência de MCR através da microdiluição em caldo. Também foram analisadas as sequências peptídicas das regiões determinantes da resistência a quinolonas (RDRQ) das subunidades A e B da DNA gyrase (GyrA e GyrB) após o seqüenciamento de DNA seguido pela tradução da sequência de aminoácidos. Cinquenta e quatro cepas de M. abscessus subsp bolletii, incluindo o clone BRA100, isoladas em diferentes estados do Brasil, e 19 cepas de referência de MCR foram caracterizadas. Todas as 54 cepas clínicas de M. abscessus subsp. bolletii foram resistentes a todas as gerações de quinolonas e mostraram o mesmo resíduo nas RDRQ, incluindo Ala-83 em GyrA, Arg-447 e Asp-464 em GyrB, descritos como sendo responsáveis por gerar um baixo nível de resistência a quinolonas em micobactérias. Porém, outras espécies de MCR apresentaram diferentes susceptibilidade e padrões de mutações contrários aos classicamente já definidos, sugerindo que outros mecanismos de resistência, diferentes de mutações em gyrA e gyrB também possam estar envolvidos na alta resistência a quinolonas. / Several outbreaks of infections caused by rapidly growing mycobacteria (RGM) have been reported in many Brazilian states since 2000. Most of the cases were mainly associated to Mycobacterium massiliense, recently renamed as Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, BRA100 clone recovered from patients who had undergone invasive procedures, in which medical instruments have not been properly sterilized and / or disinfected. Since quinolones have represented an option for the treatment of general RGM infections and suggested for therapeutic schemes for these outbreaks, we evaluated the in vitro activities of four generations of quinolones for clinical and reference RGM by broth microdilution, and analysis of peptide sequences of the quinolone resistance determining regions (QRDR) of GyrA and GyrB after DNA sequencing followed by amino acid translation. Fifty four isolates of M. abscessus subsp bolletii, including clone BRA100, recovered in different states of Brazil, and 19 reference strains of RGM species were characterized. All 54 M. abscessus subsp. bolletii isolates were resistant to all generations of quinolones and showed the same amino acids in the QRDR including the Ala-83 in GyrA, Arg-447 and Asp-464 in GyrB, described as responsible for an intrinsic low level of resistance to quinolones in mycobacteria. But other RGM species presented distinct susceptibilities to this class of antimicrobials and patterns of mutations contrary to what has been traditionally defined, suggesting that other mechanisms of resistance, different from gyrA or gyrB mutations, may also be involved in resistance to high levels of quinolones.