Chez les Vibrio spp., le QS est impliqué dans de nombreuses fonctions comme la colonisation de niche écologiques, les stratégies de survie ou encore la virulence. Cependant, pour la majorité des espèces de Vibrio, la diversité des AHLs produites reste largement sous-estimée et l'étude du QS est encore limitée à quelques espèces modèles ou pathogènes. Toutefois, dans les environnements aquatiques, ces espèces sont minoritaires et les espèces les plus abondantes ne sont que très peu étudiées. Nos résultats ont révélé une importante diversité d'AHLs mais aussi, de façon surprenante, une hétérogénéité dans les phénotypes de production d'AHL au sein d'une même espèce de Vibrio. Pour la première fois, nous avons mis en évidence qu'une même souche de Vibrio pouvait présenter des phénotypes de production d'AHLs différent au cours du temps et une approche statistique a révélé l'implication de certains déterminants biotiques et abiotiques dans ces variations temporelles. Par ailleurs, une approche à micro-échelle a révélé une structuration des populations de Vibrio en unités fonctionnelles constituées de souches phylogénétiquement proches qui partagent des niches écologiques spécifiques et des comportements sociaux. Nos résultats ont mis en évidence que les modalités de communication pouvaient être hétérogènes suggérant l'absence d'un langage commun au sein de ces unités fonctionnelles. En conclusion, ce travail de thèse a permis d'apporter de nouvelles connaissances sur le QS chez les Vibrio dans l'environnement marin, de la souche à la population, et propose une vision intégrée des mécanismes de régulation de la production d'AHLs dans l'environnement. / Quorum sensing is an important mechanism among Vibrio species and is involved in many vital functions such as niche colonization, survival strategies or virulence. However, AHL diversity still largely underestimated for the majority of Vibrio species and the current knowledge on AHL-mediated QS is limited to a few pathogenic or bioluminescent species. Nonetheless, these species are weakly abundant in seawater while dominant species in the environment are poorly studied. Our results revealed a unexpected diversity of AHL molecules but also a quite surprising intra-species diversity of AHL production phenotypes. For the first time, we showed that different isolates of a single genotype switched between different AHL production phenotypes among time and we revealed the potential involvement of abiotic and biotic parameters in these variations. However, it appears that when studied at a microscale, Vibrio populations are showing a functional structuration in ecological units consisting of phylogenetically close strains sharing habitat and social traits. In this context, it was necessary to determine if these different AHL production phenotypes were associated to different micro-habitats in the water column. We did not demonstrate that a common language was spoken within ecological populations. This thesis work provide new insights on AHL-mediated QS among a broader range of species and among Vibrio populations and depicts the potential impact of multiple aspects of marine environments on AHL production.

Les bactéries ont longtemps été considérées comme des organismes unicellulaires. Cependant, elles se comportent comme des systèmes multicellulaires dans lesquels des cellules séparées communiquent ensemble en utilisant des systèmes moléculaires appelés autoinducteurs. Ce processus, appelé Quorum Sensing (QS), est capable de détecter la densité de population bactérienne et régule ainsi l'expression de certaines fonctions biologiques importantes, telles que la virulence bactérienne ou la formation de biofilm, liées à la pathogénicité humaine ou à la croissance végétale. Comme le QS implique plusieurs types de molécules, il s'agit donc d’une thématique intéressante pour les études à l’interface chimie biologie visant à synthétiser des molécules capables de moduler le QS. Deux aspects du QS sont étudiés dans cette thèse: Le premier est la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d’analogues d’autoinducteurs en tant que modulateur QS bactérien. Dans cette section, différentes relations structure-propriété d'un type d'auto-inducteur chez les bactéries Gram-négatives : les Acyl Homoserine Lactones (AHL) ont été étudiées. Ces études montrent que la chiralité de l’homosérine lactone est importante, que le remplacement du groupe amide central par des hétérocycliques ou des composés AHL structurellement non apparentés jouent un rôle important dans la modulation QS. Dans une deuxème partie, une étude structurale a permis de comprendre comment l’agrocinopine A a été en mesure d'intervenir dans le processus du QS c’est à dire la production de signaux AHL et d'activer la virulence bactérienne chez la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Le rôle clé du groupement pyranose-2-phosphate de l'agrocinopine est démontré comme étant responsable de sa reconnaissance par les protéines de transport AccA et de la régulation du QS. Dans l'ensemble, cette thèse est la combinaison de deux composés organiques synthétiques liés au QS, tous deux destinés à améliorer les connaissances de base de ce processus biologique, contribuant potentiellement à l'avenir à de nouvelles stratégies capables d'influencer la pathogénicité bactérienne. / Over the past decades, it has been recognized that the social communication of bacteria either play a beneficial role or can worse pathogenicity in plant and human health. The language of bacteria used for communication are signal molecules called auto-inducers (AIs), which are regulated by themselves. This specific bacterial regulation process is termed as “quorum sensing (QS)”, by which bacteria coordinate various phenotypes such as biofilm formation or virulence factors in many microorganisms. To artificially alter the QS response of bacteria through design of QS chemical signal molecules for improving the pathogenicity have attracted the attention with innovative antibacterial strategies. Two chemical approaches towards bacteria QS have been studied in this thesis. One contributed to the design, synthesis and biological evaluation of novel QS inhibitors, another focused on the investigation of the role of agrocinopine and analogues in QS regulation in a specific bacteria Agrobacterium tumefaciens (AT). Both aimed at improving basic knowledge on QS biological processes in bacteria. The first part figured out the chirality-activity relationship of Acyl Homoserine Lactones (AHLs), studied the replacement of the central amide group of AHLs by heterocyclic scaffolds, and designed a family of nitroaniline derivatives as LuxR-regulated QS inhibitors. The L-one of enantiomeric AHLs was found to be predominant in QS modulation, and some AHLs unrelated nitroaniline compounds were capable of inhibiting LuxR type of QS, whereas the bioactivity of heterocyclic scaffolds depends on its substitution sites. The second part elaborated the mechanism by which agrocinopine A and its analogues were able to involve QS process, and activate virulence spread in AT. A series of analogues of agrocinopine A have been synthetized for investigating their binding properties with AccA. A specific key pyranose-2-phosphate motif has been identified to be responsible for both antibiotic import and QS regulation in AT.

Cette thèse est centrée sur l’analyse du rôle de l’adhésion cellule-substrat et des facteurs de détectionde Quorum sur la migration amibienne de Dictyostelium . Des outils pour automatiser les enregistrementsde vidéoomicroscopie et l’analyse d’image ont été développés afin de travailler avec de trèsgrands échantillons de cellules et de quantifier la migration cellulaire. Un dispositif microfluidique dedétachement cellulaire sous flux hydrodynamique combiné une platine motorisée a permis une étude statistique de l’adhésion mais aussi de la dynamique de détachement. L’analyse de la migration de Dictyostelium en milieu non nutritif met en évidence le rôle de la densité sur la différentiation des celluleset leur capacité de migration. Nous observons la présence d’une vitesse maximale de migrationaprès 6h de carence. Nous montrons que l’adhésion sur verre est deux fois plus faible en milieu carenc´equ’en milieu nutritif. Les exp´eriences de migration en milieu nutritif ont révélé la présence d’un facteur de détection de densité sécrété par les cellules et régulant leur migration aléatoire. Le coefficient de diffusion, la persistance du mouvement et la morphologie des cellules varient en fonction de la concentrationde ce facteur. Ce facteur ne modifie pas l’adhésion cellulaire mais uniquement la dynamique de d´etachement. Enfin, le protocole d’analyse développé nous a permis de faire une étude comparative de la migration en faisant varier d’autres paramètres tel que la surface ou la composition chimique du milieu expérimental. Ce travail se conclue en exposant le possible rôle de l’adhésion sur la migrationchez Dictyostelium en milieu nutritif. / This thesis focuses on the analysis of the role of adhesion between substrate and cell and factors of Quorum sensing on the migration of Dictyostelium amoeba. Tools to automate the recordings of videomicroscopy and image analysis have been developed to work with very large samples of cells and toquantify cell migration. A microfluidic device for cell detachment in hydrodynamic flow combined witha motorized stage has allowed a statistical study of adhesion but also the dynamics of detachment. The analysis of the migration of Dictyostelium in non nutritive medium highlights the role of density on celldifferentiation and migration capacity. We observe the presence of a maximum speed of migration after6 hours of starvation. We show that the adhesion to glass is twice as low in deprivation buffer as inthe nutrient medium. The experiences of migration in growth medium revealed the presence of a factorof detection of density secreted by the cells and regulating their random migration. The diffusion coefficient, the persistence of the movement and morphology of cells vary depending on the concentrationof this factor. This factor does not affect cell adhesion but only the dynamics of detachment. Finally, the testing protocol developed allowed us to make a comparative study of migration by varying otherparameters such as surface or the chemical composition of experimental medium. This work concludesby outlining the possible role of adhesion to the migration of Dictyostelium in nutrient medium.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic, nosocomial pathogen for which antibiotic resistance and biofilm development is common. Quorum sensing communication is known to be a major controlling factor in virulence gene expression, biofilm development, antibiotic resistance factors, and specifically MexAB-OprM multi-drug efflux pump expression in P.aeruginosa. MexAB-OprM efflux pumps contribute to antibiotic resistance of tetracycline and other antibiotics in pseudomonads and other organisms. P.aeruginosa infections are problematic in cystic fibrosis and burn patients; it is also the number one causative agent of respiratory infections for intensive care unit patients. Present day antibiotics are losing the battle against these infections. In theory, quorum sensing inhibitors (QSI) reduce pathogencity of the organism; making it less virulent, thus allowing either the host immune system to clear the infection or use of a QSI in combination with an antibiotic to clear more persistent pathogens. For these reasons two alternative modes of treatment were explored in this study: quorum sensing inhibition by folk-medicinal plant extracts and an example of combination drug therapy, the “thyme-tetracycline effect”. Fifty folk-medicinal plant extracts were screened for potential anti-quorum sensing activity using two quorum sensing inhibition (QSI) reporter strains, Pseudomonas aeruginosa QSIS2 and Chromobacterium violaceum 12725. These were used to test specifically for C4-C6 and C12 HSL quorum sensing inhibition. Of the fifty plants tested, thirty plant families were represented. Eleven plant extracts (basil, chaparral, clove, cranberry, oregano, pomegranate, rosemary, sage, sassafras, thyme and witch hazel) showed C4 HSL quorum sensing inhibition as determined by both assays. Interestingly, five of the plants were from the Lamiaceae family. Thymus vulgaris (thyme), also from the Lamiaceae family, was chosen for further assessment. Previous research has shown that thyme extract can synergistically augment tetracycline activity against tetracycline-resistant Pseudomonas aeruginos, creating the “thyme-tetracycline effect.” Disc diffusion assay, thin layer chromatography (TLC), and TLC bioassay techniques were used to show that thymol is the active component in the thyme extract that augments tetracycline activity against resistant Pseudomonas. This study also showed that thymol is a potent C4 HSL quorum sensing inhibitor. The collective data suggests a potential mode of action for the thyme-tetracycline effect: thymol appears to prevent MexAB-OprM efflux pump gene expression. By blocking MexAB-OprM expression, tetracycline antibiotic accumulation can occur within the cell, thus allowing cellular damage.

Autoinducer 2 (AI-2) is a quorum sensing signal employed by bacteria to coordinate their response to environmental stresses. The objective of this study was to determine the relationship between presence of AI-2 molecules, exposure to sub-therapeutic tetracycline, the expression of genes associated with the conjugal transfer of antibiotic resistance plasmids, and the conjugal transfer of these plasmids in Escherichia coli. The studies showed that AI-2 activity increased in Tets E. coli in the presence of tetracycline (2 µg/mL) under both batch and continuous culture conditions. The presence of AI-2 molecules induced tetracycline tolerance development in Tets E. coli. The studies showed that the survival rates of Tets E. coli exposed to AI-2 molecules were significantly higher compared to the cells not exposed to AI-2 molecules or cells that were exposed to only LB (Lauria-Bertani) broth. Molecular analyses using real-time PCR indicate that the expression of at least one conjugation-associated gene (trbC) is increased 9-fold in cells exposed to AI-2 molecules in the presence of sub-therapeutic tetracycline compared to its negative controls. The transconjugation frequency of the plasmid RP4 carrying the tet(A) gene increased between 10-100 fold in the presence of AI-2 molecules. In companion studies, AI-2-like activity was detected in fish, tomatoes, cantaloupes, carrots and milk samples. Interestingly, ground beef and poultry meat contained substances that appear to inhibit AI-2 activity. Collectively, these results highlight the potential importance of bacterial quorum sensing signals such as AI-2 in the response of bacterial cells to environmental stimuli and the possible role of quorum sensing signals in the quality and safety of foods.

L'identification, chez divers organismes, d'enzymes de dégradation des N-acyl homosérineslactones (NAHLs) impliquées dans la signalisation QS pose la question de leurs rôles dans lesinteractions bactéries-eucaryotes. Dans une première partie, une synthèse bibliographique analyse lesconnaissances acquises sur ces enzymes dégradant les NAHLs. Dans une seconde partie, la croissancedes bactéries dégradant les signaux NAHLs a été stimulée par l'application de g-caprolactone (GCL)dans la rhizosphère de plants de pommes de terre à des fins de phytoprotection. L'effet de cetraitement sur la diversité des communautés bactériennes rhizosphériques a été évalué en combinantdifférentes approches d'écologie microbienne moléculaire comme la DGGE, le pyroséquençaged'amplicons rrs, et la métagénomique fonctionnelle. Cette dernière approche appliquée à une banquede 30 000 clones environ a conduit à l'identification d'un gène qsdB codant la dégradation des signauxNAHL. Ce travail révèle ainsi l'existence d'une nouvelle classe d'enzymes de dégradation des NAHLsappartenant à la famille des enzymes possédant une signature amidase (AS) dont des membres sontpar ailleurs impliqués dans la dégradation de composés xénobiotiques. Dans une troisième partie, unsystème expérimental a été développé afin de mesurer le transfert conjugatif du plasmide de virulenceTi (tumor inducing) chez des dérivés du pathogène Agrobacterium tumefaciens, appelés "tricheurs",incapables de produire des signaux NAHLs mais utilisateurs de ceux produits par les autres bactéries.Ce modèle a permis de montrer l'effet modérateur de lactonases dégradant les NAHLs exprimées chezdes agrobactéries produisant les NAHLs, chez des bactéries réceptrices du plasmide Ti, ou des planteshôtes des agrobactéries sur le transfert conjugatif initié par les tricheurs. L'ensemble de ce travailrévèle à la fois une nouvelle famille d'enzymes impliquées dans la dégradation des NAHLs, ainsiqu'un nouveau rôle de ces enzymes dans la modulation des flux de gènes entre bactériesphytopathogènes en interaction avec une plante hôte.

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Study program: Pharmacy Candidate: Jana Roubalová Consultant: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Title of thesis: Optimization of methods for sensitivity evaluation of biofilm-forming microbial agents towards substances with antimicrobial potential Background: The aim of this diploma thesis was to optimize the methodical approach to the production of yeast biofilms in vitro on the so-called pegs and the walls of the wells of the 96-well panel. This biofilm formation system should be an analogous approach to the commercially available Calgary Biofilm Device. 10 strains of Candida yeast and 4 different culture media (nutritionally poor / rich) were used to optimize the methodology. Both the reference strains and the clinical isolates were among the yeast strains tested. Methods: The ability to form yeast biofilms by different strains in different culture media was evaluated by the approach of fixation, staining of the formed biofilms by crystal violet and extraction and spectrophotometric measurement of the intensity of the extracted color. Results: Individual strains, after cultivation in different media, were categorized according to their ability to form biofilm. Larger yeast adherence occurs in the wells than on pegs where the yeast adhered very...

Avec le développement de l'Internet, l'informatique s'est basée essentiellement sur les communications entre serveurs, postes utilisateurs, réseaux et data centers. Au début des années 2000, les deux tendances à savoir la mise à disposition d'applications et la virtualisation de l'infrastructure ont vu le jour. La convergence de ces deux tendances a donné naissance à un concept fédérateur qu'est le Cloud Computing (informatique en nuage). Le stockage des données apparaît alors comme un élément central de la problématique liée à la mise dans le nuage des processus et des ressources. Qu'il s'agisse d'une simple externalisation du stockage à des fins de sauvegarde, de l'utilisation de services logiciels hébergés ou de la virtualisation chez un fournisseur tiers de l'infrastructure informatique de l'entreprise, la sécurité des données est cruciale. Cette sécurité se décline selon trois axes : la disponibilité, l'intégrité et la confidentialité des données. Le contexte de nos travaux concerne la virtualisation du stockage dédiée à l'informatique en nuage (Cloud Computing). Ces travaux se font dans le cadre du projet SVC (Secured Virtual Cloud) financé par le Fond National pour la Société Numérique " Investissement d'avenir ". Ils ont conduit au développement d'un intergiciel de virtualisation du stockage, nommé CloViS (Cloud Virtualized Storage), qui entre dans une phase de valorisation portée par la SATT Toulouse-Tech-Transfer. CloViS est un intergiciel de gestion de données développé au sein du laboratoire IRIT, qui permet la virtualisation de ressources de stockage hétérogènes et distribuées, accessibles d'une manière uniforme et transparente. CloViS possède la particularité de mettre en adéquation les besoins des utilisateurs et les disponibilités du système par le biais de qualités de service définies sur des volumes virtuels. Notre contribution à ce domaine concerne les techniques de distribution des données afin d'améliorer leur disponibilité et la fiabilité des opérations d'entrées/sorties dans CloViS. En effet, face à l'explosion du volume des données, l'utilisation de la réplication ne peut constituer une solution pérenne. L'utilisation de codes correcteurs ou de schémas de seuil apparaît alors comme une alternative valable pour maîtriser les volumes de stockage. Néanmoins aucun protocole de maintien de la cohérence des données n'est, à ce jour, adapté à ces nouvelles méthodes de distribution. Nous proposons pour cela des protocoles de cohérence des données adaptés à ces différentes techniques de distribution des données. Nous analysons ensuite ces protocoles pour mettre en exergue leurs avantages et inconvénients respectifs. En effet, le choix d'une technique de distribution de données et d'un protocole de cohérence des données associé se base sur des critères de performance notamment la disponibilité en écriture et lecture, l'utilisation des ressources système (comme l'espace de stockage utilisé) ou le nombre moyen de messages échangés durant les opérations de lecture et écriture. / With the development of Internet, Information Technology was essentially based on communications between servers, user stations, networks and data centers. Both trends "making application available" and "infrastructure virtualization" have emerged in the early 2000s. The convergence of these two trends has resulted in a federator concept, which is the Cloud Computing. Data storage appears as a central component of the problematic associated with the move of processes and resources in the cloud. Whether it is a simple storage externalization for backup purposes, use of hosted software services or virtualization in a third-party provider of the company computing infrastructure, data security is crucial. This security declines according to three axes: data availability, integrity and confidentiality. The context of our work concerns the storage virtualization dedicated to Cloud Computing. This work is carried out under the aegis of SVC (Secured Virtual Cloud) project, financed by the National Found for Digital Society "Investment for the future". This led to the development of a storage virtualization middleware, named CloViS (Cloud Virtualized Storage), which is entering a valorization phase driven by SATT Toulouse-Tech-Transfer. CloViS is a data management middleware developped within the IRIT laboratory. It allows virtualizing of distributed and heterogeneous storage resources, with uniform and seamless access. CloViS aligns user needs and system availabilities through qualities of service defined on virtual volumes. Our contribution in this field concerns data distribution techniques to improve their availability and the reliability of I/O operations in CloViS. Indeed, faced with the explosion in the amount of data, the use of replication can not be a permanent solution. The use of "Erasure Resilient Code" or "Threshold Schemes" appears as a valid alternative to control storage volumes. However, no data consistency protocol is, to date, adapted to these new data distribution methods. For this reason, we propose to adapt these different data distribution techniques. We then analyse these new protocols, highlighting their respective advantages and disadvantages. Indeed, the choice of a data distribution technique and the associated data consistency protocol is based on performance criteria, especially the availability and the number of messages exchanged during the read and write operations or the use of system resources (such as storage space used).

La galle du collet, caractérisée par la formation d'une tumeur, représente la bactériose la plus répandue chez la vigne et entraine d'importantes pertes économiques à travers le monde. L'agent responsable de cette maladie est le plasmide Ti (pTi) qui confère à ces bactéries hôtes, telles que des Allorhizobium vitis, leur pouvoir pathogène. En plus du pTi, les A. vitis sont aussi les hôtes d'autres plasmides dont les fonctions et les modes de dissémination sont peu documentés. Afin d'étudier l'adaptation particulière des souches d'A. vitis à la vigne, nous nous sommes intéressés à la diversité de ces pathogènes ainsi qu'au rôle de ces plasmides et à la régulation de leur dissémination. Tout d'abord, nous avons analysé la diversité des isolats provenant de vignobles du Maroc atteints par la galle du collet. Nous avons pu mettre en évidence que l'ensemble des isolats pathogènes (e.g. porteur d'un pTi) forme 4 groupes génétiques se distinguant par le type d'opine produit. Nous nous sommes par la suite intéressés à la souche A. vitis S4 qui héberge 5 plasmides dont 3 possèdent un mécanisme de transfert pouvant être régulé par un système de communication bactérienne nommé quorum sensing (QS). Nous avons montré que le système QS du plasmide p130 (renommé pApi) contrôle non seulement le transfert conjugatif du pApi mais aussi d'autres fonctions plasmidiques non caractérisées. Ce système QS nécessite la synthèse d'une molécule signal de type N-acyl-homosérine lactone qui d'après nos travaux de caractérisation possède une structure atypique. De plus, des analyses génomiques couplées à des tests de résistance au cuivre nous ont permis d'identifier, sur le plasmide p79 d'A. vitis S4, un îlot de gènes potentiellement impliqués dans la résistance au cuivre de cette souche. Via des analyses de diversité ainsi que l'étude d'une souche modèle, nos travaux fournissent des connaissances sur l'adaptation d'Allorhizobium vitis à son unique plante hôte, la vigne / Crown gall disease, characterized by the formation of a tumor, represents the most widespread bacteriosis in the vineyard and causes significant economic losses throughout the world. The causing agent is the Ti plasmid (pTi) which confers pathogenicity to their bacterial hosts, such as Allorhizobium vitis. In addition to pTi, A. vitis harbours other plasmids whose functions and ways of dissemination are poorly documented. In order to study the peculiar adaptation of A. vitis strains to grapevine, we studied the diversity of these pathogens as well as the role of plasmids and the regulation of their dissemination.First, we analyzed the diversity of isolates from vineyards of Morocco affected by crown gall. We highlighted that all the pathogenic isolates (e.g. carrying a pTi) form 4 genetic groups that are distinguished by the type of opine produced and the ability to induce a hypersensitive response. We then focused on strain A. vitis S4, which contains 5 plasmids, including 3 possessing a transfer mechanism that can be regulated by a bacterial communication system called quorum sensing (QS). We demonstrated that the QS system of plasmid p130 (renamed pApi) controls not only the conjugative transfer of the pApi but also other uncharacterized plasmid-encoded functions. This QS system requires the synthesis of a N-acyl-homoserine lactone signal molecule with an atypical structure. In addition, genomic analyzes combined with copper resistance assays allowed us to identify, on plasmid p79 of A. vitis S4, a genomic island that is likely involved in copper resistance of this strain.Through analyzes of diversity and study of a model strain, our work provides insight into adaptation of Allorhizobium vitis to its unique host plant, grapevine

O fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) é o agente causal do cancro em citros. O desenvolvimento da infecção depende do sucesso de XAC na colonização do hospedeiro. Para isso, além do sistema de secreção tipo III, que injeta efetores de virulência dentro da célula do hospedeiro, Xanthomonas também conta com o processo de quorum-sensing. O aumento da densidade celular em XCC (Xanthomonas campestris pv campestris) promove o acúmulo da molécula sinalizadora difusível (DSF) produzida por RpfF, que ativa o sistema de dois componentes formado pelas proteínas RpfC e RpfG, as quais transduzem o sinal de ativação para o fator de transcrição Clp (CAP Like Protein - homóloga da proteína CAP de E. coli). A proteína RpfG contém um domínio de fosfodiesterase conservado (HD-GYP) que regula a concentração de diGMP cíclico (c-diGMP), um segundo mensageiro bacteriano. Dessa forma o domínio HD-GYP atua contrapondo-se à atividade dos domínios diguanilato ciclases (GGDEF). No caso de XCC, foi demonstrado que a ativação do domínio HD-GYP de RpfG reduz a concentração de c-diGMP na célula e promove a ligação e ação positiva de Clp no promotor do gene de engXCA. Com intuito de estudar a via Rpf em XAC, produzimos mutantes não-polares de rpfF, rpfC, rpfG, dos genes que codificam os domínios GGDEF que interagiram com RpfG (Andrade et al. 2006), clp, fliC, pilT, gumD e também geramos mutantes dos operons xcs e xps, que codificam sistemas de secreção do tipo 2 em XAC. Análise por HPLC-MS/MS mostrou que a deleção de rpfG, mas não clp, promoveu um aumento de aproximadamente 4 vezes dos níveis celulares de c-diGMP. Também foi demonstrado por EMSA que c-diGMP inibe a ligação de Clp ao promotor do operon xcs. Os mutantes ΔrpfF-C-G e Δclp mostraram um comprometimento da mobilidade, redução da biossíntese de exopolissacarídeos e na produção de fatores de virulência. Em adição, observamos uma diminuição significativa no crescimento dos mutantes ΔrpfG e Δclp dentro do hospedeiro. Além disso, identificamos também novos fatores envolvidos no metabolismo do c-diGMP e (p)ppGpp em XAC. Além do c-diGMP, outro segundo mensageiro o (p)ppGpp, cuja concentração na célula é regulada pelas proteínas SpoT e RelA, pode afetar a expressão de maneira dependente da subunidade ω da RNA polimerase em XAC. Finalmente, propusemos um modelo onde a concentração de c-diGMP sob controle da via do quorum-sensing e a sinalização por (p)ppGpp podem convergir para alguns efetores que regulam a mobilidade e a patogenicidade em XAC. / In Xanthomonas, the cell-cell signaling mediated by diffusible molecules is known to play an important role in regulating physiological process, including the formation and dispersal of biofilms and virulence. It has been shown that the ability of Xanthomonas species to incite disease depends on several factors, including adhesins, synthesis of extracellular enzymes, type III secretion system (T3SS) effectors and the exopolysaccharide (EPS) xanthan. The rpf genes act to positively regulate the synthesis of extracellular enzymes, EPS and pathogenicity. The rpfF, rpfC and rpfG genes are implicated in a regulatory system involving a diffusible signal factor (DSF) whose synthesis of DSF depends on RpfF. DSF perception and signal transduction are mediated by the two-component system comprising RpfC and RpfG. High cell densities are thought to lead to the phosphorylation of RpfG by RpfC which in turn activates the RpfG HD-GYP phosphodiestarase domain whose substrate has been shown to be the important second messenger cyclic diGMP (c-diGMP) (Ryan et al., 2006). This work was prompted to by the observation that the HD-GYP domain of RpfG interacts with a subset of diguanylate cyclase (GGDEF) proteins (Andrade et al., 2006), responsible for c-diGMP synthesis in Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). In order to study rpf signaling in XAC, we produced non-polar knockouts of rpfF, rpfC, rpfG, all genes coding the GGDEF domains shown to interact with RpfG, CAP-like protein (clp), fliC, pilT, gumD and polar insertions in the operons of both type 2 secretion systems coded by the XAC genome. HPLC-MS/MS analysis showed that the deletion of rpfG, but not clp, promoted an approximate 4-fold increase in cellular c-diGMP levels. We Also demonstrated that c-diGMP inhibits the binding of Clp to the promoter of the XAC0694 gene, the first gene in the operon coding the type 2 secretion system. The rpf genes and clp knockouts have impaired motility, reduction in exopolissacarides and extracellular enzyme production. Furthermore, we observe a significant decrease in the growth of rpfG and clp mutants in host tissues. Our results demonstrate that RpfF-RpfC-RpfG-Clp signaling in XAC is associated with cellular c-diGMP levels and is important for XAC virulence, motility, and EPS production. In addition, we have identified new factors involved to metabolism of c-diGMP and (p)ppGpp in XAC. The (p)ppGpp synthesis and degradation is under control of the proteins SpoT and RelA; However the effect of (p)ppGpp on gene expression seems to depend of the ω subunit of RNA polimerase in XAC. Finally, we propose the model where c-diGMP levels controlled by quorum-sensing and the (p)ppGpp signalization may converge to regulate the motility and pathogenicity of XAC.