Le retard de cicatrisation (RETCIC) est un problème clinique majeur, touchant les gens âgés, les diabétiques, drépanocytaires (DR), ou traités par les glucocorticoides (GC). Nous avons abordé les mécanismes des ulcères DR dans un modèle transgénique ayant un gène beta globine humain muté (SAD). Les souris SAD âgées ont un RETCIC corrélé au degré d'anémie et d'hemolyse, comme dans la DR humaine ; le RETCIC est lié à l'altération de l'angiogenèse cutanée et un faible recrutement de cellules endothéliales progénitrices (EPC) depuis la moelle. La sécrétion de CXCL12 dans la plaie par les kératinocytes et les cellules inflammatoires est diminuée. Fait notable, le traitement local de la plaie par des EPC ou du CXCL12 recombinant restaurent l'angiogenèse et une cicatrisation des souris SAD âgées. Nous avons ensuite abordé le rôle du récepteur minéralocorticoide dans la cicatrisation cutanée, et proposé ses antagonistes (MRA) pour améliorer le RETCIC en pathologie (traitement local GC, diabète murin); j'ai aussi participé à la démonstration de l'effet bénéfique des MRA sur l'atrophie épidermique GC-induite chez l'homme. A l'aide d'explants de peau murine et humaine, de plaies cutanées crées sur le dos de souris, et par l'analyse de la cicatrisation de biopsies chez le volontaire sain après traitement GC (étude post-hoc de l'essai SPIREPI), nous montrons que les MRA améliorent le RETCIC pathologique, et n'affectent pas la peau saine normale. Nous avons montré que l'effet bénéfique des MRA topiques implique une augmentation de la prolifération kératinocytaire et le canal sodium épithelial. Ces résultats montrent un rôle inédit et important du MR cutané dans la cicatrisation. / Impaired wound healing is a major unsolved clinical problem in aging, diabetes, sickle cell disease (SCD), glucocorticoid (GC) therapy or Cushing syndrome.First, we investigated the mechanisms underlying SCD ulcers, using SAD transgenic mouse model with mutated human beta globin. Old SAD mice displayed delayed healing correlated with the severity of anemia and hemolysis, as in human SCD, related to impaired cutaneous angiogenesis and poor endothelial progenitor cell (EPC) mobilization from the bone marrow. CXCL12 secretion by keratinocytes and inflammatory cells in SAD wounds was low. Noticeably, local wound therapy with EPCs or with recombinant CXCL12 restored wound angiogenesis and healing in old SAD mice.Second, we questioned the role of mineralocorticoid receptor (MR) in wound healing and proposed that MR blockade could improve reepithelialization in pathological situations (GC-treated skin, diabetic mouse models); I also participated to the demonstration that MR blockade limits GC-induced epidermal atrophy in human skin. We used skin explants from mouse and humans, full thickness skin wounds on the back of mice, and analyzed wound closure after skin biopsy in healthy volunteers pre-treated with GC, as a post-hoc study of the SPIREPI clinical trial. We found that MR blockers can rescue the pathological delayed wound healing while they did not modify wound closure in normal condition. We show that the improvement of GC-induced wound healing delay by MR blockade involves restoration of keratinocyte proliferation and down-regulation of the epithelial sodium channel. These results suggest an important and entirely novel role for MR in to improve delayed wound closure.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune médiée par les cellules T caractérisée par l'infiltration de leucocytes inflammatoires dans le système nerveux central (SNC) aboutissant à la destruction de la gaine de myéline. Des rémissions cliniques sont fréquemment observées lors de la grossesse chez des patientes atteintes de SEP suggérant que les hormones, particulièrement les œstrogènes, pourraient jouer un rôle protecteur. En effet, l'administration d'œstrogènes (17beta-œstradiol, E2) inhibe l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris, le modèle animal de la SEP. Par l'utilisation de souris KO conditionnelles pour REalpha dans différentes cellules du système immunitaire, notre équipe a précédemment montré que l'inhibition de l'EAE par l'E2 était associée à une suppression de l'activation des cellules Th1 et Th17 encéphalitogènes et que cet effet était dépendant de l'expression de RE? dans les lymphocytes T. Les objectifs de ma thèse ont été d'identifier les cellules T impliquées dans l'effet protecteur de l'E2 dans l'EAE et de disséquer les mécanismes sous-jacents. Nous avons mis en évidence que de fortes doses d'E2 in vivo inhibait sélectivement la différenciation des cellules T 2D2, possédant un TCR spécifique du peptide MOG, en lymphocytes Th1 et Th17 suite à leur transfert chez des souris receveuses. En utilisant des cellules T 2D2 déficientes pour REalpha, nous avons pu mettre en évidence que l'expression de REalpha par les cellules T CD4+ spécifiques de MOG n'était pas nécessaire à l'action inhibitrice de l'E2. Ces résultats suggéraient que l'activation intrinsèque de la voie de signalisation E2/RE? dans les cellules T spécifiques de l'antigène n'avait pas d'impact sur leur différenciation en cellules T effectrices. Nous avons confirmé ces résultats par des expériences effectuées in vitro, montrant que la sensibilisation des cellules T naïves à l'E2 in vivo et in vitro n'affectait pas leur capacité à se différencier en cellules Th1, Th2, Th17 ou Treg. De plus, nous avons mis en évidence que l'E2 via REalpha agissait sur les cellules T CD4+ endogènes pour inhiber le développement des réponses Th1 et Th17 inflammatoires par un mécanisme de suppression en trans. Ensuite, nous avons montré par un modèle de transfert adoptif que les cellules T REalpha+/+, mais pas REalphaKO, sensibilisées à l'E2 conféraient une protection contre l'EAE lorsqu'elles étaient transférées avec les cellules T 2D2 naïves REalphaKO dans des souris receveuses Rag2KO REalphaKO immunisées avec MOG. De plus, en utilisant des souris déficientes pour RE? sélectivement dans les Treg Foxp3+, nous avons démontré que l'action protectrice des cellules T CD4+ bystander sensibilisées à l'E2 était non seulement maintenue mais augmentée en comparaison aux cellules contrôles exprimant RE?. Ces résultats ont donc permis de mettre en évidence que l'E2 agissait sur les cellules T CD4+ Foxp3neg pour restreindre la différenciation des cellules T encéphalitogènes en lymphocytes Th17 en trans et ainsi inhiber le développement de l'EAE. / Multiple sclerosis (MS) is a T-cell mediated autoimmune disease characterized by the inflammatory leukocytes infiltration into central nervous system (CNS) resulting in myelin damages. Clinical remissions in MS patients are frequently observed during pregnancy suggesting that steroid hormones, particularly estrogens, could be protective. Indeed, administration of estrogens (17beta-œstradiol, E2) inhibits experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, the animal model of MS. Using ERalpha conditional KO mice, our group has shown previously that E2-mediated inhibition of EAE was associated with suppression of encephalitogenic Th1 and Th17 cell activation and that this effect required ERalpha expression in T cells. The objectives of my thesis aimed to identify the T cells implicated in E2 protective effect on EAE and to dissect the underlying mechanisms. We highlighted that pharmacological doses of E2 in vivo selectively inhibited MOG specific TCR 2D2 T cells differentiation into Th1 and Th17 lymphocytes following their transfer into recipient mice. Using ERalpha deficient 2D2 T cells, we have showed that ERalpha expression in MOG specific CD4+ T cells was not required for the E2 inhibitory action. These results suggested that intrinsic activation of E2/ERalpha signaling in antigen specific T cells didn't impact their differentiation into effector T cells. We confirmed these results by in vitro experiment, showing that in vitro and in vivo E2 treatment of naïve T cells didn't affect their differentiation capacity into Th1, Th2, Th17 or iTreg cells. Moreover, we highlighted that E2 acted through ER? in endogenous CD4+ T cells to inhibit inflammatory Th1 and Th17 responses by a suppressive mechanism in trans. Then, we have shown using an adoptive transfer model that E2 primed ER?+/+, but not ERalphaKO, CD4+ T cells conferred substantial protection against EAE when transferred together with 2D2 ERalphaKO transgenic T cells into naïve RagKO recipients lacking ERalpha prior to MOG immunization. Futhermore, using mice selectively lacking ERalpha in Foxp3+ Treg, we have demonstrated that E2-primed CD4+ T cell protective action was not only maintained but increased in comparison to ERalpha+/+ T cells. These results allowed us to conclude that E2 acts on CD4+ Foxp3neg T cells to restrict encephalitogenic Th17 cell differentiation in trans and inhibit EAE development.

La libération d'hormones glucocorticoïdes (GC), en réponse au stress, est un mécanisme important du contrôle de la neurogenèse chez l'adulte. Une question non résolue est de savoir si ces hormones agissent directement sur les précurseurs neuronaux (NPCs) ou indirectement, en agissant sur d'autres types cellulaires, modifiant la libération de facteurs de croissance ou l'activité de réseaux neuronaux. Afin de répondre à cette question, nous avons développé un modèle murin dans lequel le gène du récepteur des GC (GR) est invalidé, de façon inductible, dans les précurseurs neuraux adultes. Nous avons montré qu'en présence ou en absence du GR, un traitement chronique avec des GC affecte de façon similaire la différentiation et la survie des neurones nés chez l'adulte. L'effet connu des GC sur la suppression de la neurogenèse adulte n'est donc pas du à une action directe de ces hormones sur les NPCs. L'absence du GR n'affecte pas non plus le comportement des souris mutantes lorsque les GC circulent à un niveau de base. En revanche, un traitement chronique avec des GC induit chez les animaux contrôles un phénotype anxieux (observé dans les tests de novelty-suppressed feeding, light/dark box, and elevated O-maze) alors que les animaux mutés sont préservé de ce changement comportemental. De façon similaire, un traitement chronique avec des GC facilite l'apprentissage des souris contrôles lors d'un test d'apprentissage par la peur. L'invalidation du gène GR dans les NPC bloque cet effet. L'apprentissage des souris. Ces résultats précisent le rôle du GR dans le contrôle de la neurogenèse dans l'hippocampe adulte et dans la modulation des comportements de type anxieux. / Stress hormones are known as one of the strongest and most ecologically relevant mediators of adult neurogenesis. A lingering question in adult neurogenesis is whether these hormones, known as glucocorticoids (CG), act directly on neural progenitor cells (NPCs), or indirectly through secreted factors or changes in network activity. To address these unknowns, we generated a transgenic mouse model whose GC receptors (GRs) could be inducibly inactivated specifically in NPCs. We investigated the effect of this cell-specific GR knockout model on hippocampal survival and differentiation and found them to be similarly affected by chronic GC treatment compared to controls. This implies that GC-suppressed neurogenesis and its impact on morphology is indirect, and GR in other cells may be mediating the effects. Furthermore, mice with GR inactivation in newborn neurons behaved similarly to controls in all tasks observed under basal levels of GC. When mice were chronically treated with GC, however, controls exhibited an anxious phenotype, whereas transgenic mice behaved like untreated control groups in all anxiety measures except latency to feed in NSF. Neither GC nor inactivation of GR in adult-born neurons altered depression-like behaviors in the forced swim test, nor percent freezing in contextual fear discrimination. Lastly, we found that GC increased the rate of learning in 1-trial contextual fear conditioning, an effect not mediated by reducing GR signaling in the neurogenic pool. These results highlight the functional contributions of adult neurogenesis as well as how their GRs mediate anxiety-relevant behaviors irrespective of suppressed neurogenesis.

Le hématopoïétique protéine adaptateur spécifique SLP-76 est un élément clé des voies de transduction du signal en aval du récepteur des cellules T (TCR). Analyse des lignées de cellules T SLP-76 déficient et SLP-76 souris knock-out montré que SLP-76 est indispensable pour le développement des lymphocytes T et de réactivité des cellules T matures. Les travaux antérieurs de notre laboratoire en utilisant des lignées de cellules T a conduit à l'identification et la caractérisation d'une boucle de rétroaction négative impliquant SLP-76, qui module la signalisation TCR-dépendante et l'activation des cellules T. Cependant, la signification physiologique de ce mécanisme de régulation n'a pas été abordé jusqu'à présent. L'objectif de cette thèse est de répondre à la fonction de ce mécanisme de régulation in vivo par l'analyse de la fonction des cellules T dans une souche de souris généré récemment "knock-in", exprimant un mutant SLP-76-S376A. Basé sur les résultats précédents, était attendu ce mutant de perturber la boucle de rétroaction négative SLP-76-dépendante. Je montre ici que l'expression de SLP-76-S376A ne donne pas lieu à des modifications phénotypiques significatives de thymocytes matures ou des sous-ensembles de cellules T, ce qui suggère que ce mutant ne modifie pas de manière significative le développement des cellules T. En outre, aucune différence n'a été observée dans le taux de prolifération ou la mort cellulaire induite par activation de cellules T mutantes par rapport aux témoins, et l'expression des marqueurs d'activation de surface n'a été que légèrement affectées. Cependant, une activation accrue de plusieurs protéines de signalisation a été observée dans les cellules CD4 + et CD8 + T stimulées in vitro, conformément aux résultats précédents dans les lignées de cellules T humaines. In vitro les cellules T CD4 + activés ont montré une augmentation significative de la sécrétion de l'interleukine-4 et -5, tandis que d'autres cytokines comme l'interleukine-2 et l'interféron-γ est apparu insensible. Ces résultats suggèrent que le réglage de la signalisation TCR-dépendante par la boucle de rétroaction négative SLP-76-dépendante peut favoriser réponses de type Th2, avec des conséquences potentielles dans certaines pathologies telles que l'asthme ou les infections parasitaires. Ainsi, nous avons utilisé un modèle expérimental de l'asthme d'évaluer la réponse des cellules eosinophiles in vivo. En effet, les résultats préliminaires ont montré que l'antigène contesté souris mutantes d'asthme induisant recrutent beaucoup plus d'éosinophiles dans les poumons par rapport aux souris témoins. Pris ensemble, ces données suggèrent que les cellules SLP76-S376A T comprennent modulations dans proximale signal de transduction TCR qui peuvent générer un biais vers la production de cytokines Th2 en réponse à la stimulation du TCR. / The hematopoietic specific adapter protein SLP-76 is a key element of signal transduction pathways downstream of the T cell receptor (TCR). Analysis of SLP-76-deficient T cell lines and SLP-76 knockout mice showed that SLP-76 is indispensable for T cell development and for responsiveness of mature T cells. Previous work of our laboratory using T cell lines led to the identification and characterization of a negative-feedback loop involving SLP-76, which modulates TCR-dependent signaling and T cell activation. However, the physiological significance of this regulatory mechanism was not addressed thus far. The aim of this PhD thesis is to address the function of this regulatory mechanism in vivo by analyzing T cell function in a recently generated “knock-in” mouse strain expressing a SLP-76-S376A mutant. Based on previous results, this mutant was expected to disrupt the SLP-76-dependent negative feedback loop. I show here that expression of SLP-76-S376A does not result in significant phenotypic alterations of thymocytes or mature T cell subsets, suggesting that this mutant does not significantly affect T cell development. Furthermore, no differences were observed in proliferation rates or activation-induced cell death of mutant T cells compared to controls, and the expression of surface activation markers was only slightly affected. However, an increased activation of several signaling proteins was observed in both CD4+ and CD8+ T cells stimulated in vitro, in line with previous results in human T cell lines. In vitro activated CD4+ T cells showed a significant increase in secretion of interleukin-4 and -5, whereas other cytokines like interleukin-2 and interferon- appeared unaffected. These results, suggest that tuning of TCR-dependent signaling by the SLP-76-dependent negative feedback loop may favor Th2-type responses, with potential consequences in specific pathologies such as asthma or parasite infections. Thus, we have employed an experimental model of asthma to evaluate the eosinophil response in vivo. Indeed, preliminary results showed that asthma-inducing antigen challenged mutant mice recruit significantly more eosinophils to the lung compared to control mice. Taken together, these data suggest that SLP76-S376A T cells comprise modulations in proximal TCR signal transduction that may generate a bias towards production of Th2-cytokines in response to TCR stimulation.

La sécrétion de vasopressine (AVP) et de corticolibérine (CRH) déclenchent la sécrétion d'ACTH via leurs récepteurs V1B et CRF1, puis celle des catécholamines et des corticostéroïdes, résultant dans les effets physiologiques induits par le stress. Trois mutations résultant de variants non-synonymes affectant le récepteur V1B (K65N, R364H et G191R) ont été associées chez l'homme à des troubles psychiatriques tels que la phobie, l'hyperactivité et le comportement suicidaire. Nous avons étudiés les propriétés pharmacologiques de ces variants V1B qui pourraient être la cause de ces pathologies. Après construction de chacun des plasmides codant pour chaque variant, nous les avons exprimés dans des cellules HEK293 et avons établi les caractéristiques de chaque récepteur telles que son affinité de liaison, ses couplages à la PLC, à la MAP kinase et la mobilisation du Ca2+. Nous avons observé que le variant R191 avait un couplage à la PLC et à la MAP kinases fortement augmenté (+50%), alors que les autres variants montraient un baisse de ces couplages. Les différences n'étant pas dûes à des constantes d'activation (Kact) pour l'AVP différents. L'association avec les β-arrestines n'est pas équivalente pour tous les variants, le R191 montrant une forte association aux β-arrestines 1 et 2 alors que le variant N65 ne s'associe plus. Ces données indiquent que le déficit en ERK-phosphorylée peut être dû à la fois à une baisse de la production d'Inositol-P et de DAG via la voie Gq et à une baisse de signalisation directe via les β-arrestines. Nous avons également examiné les propriétés d'internalisation de ces variants en utilisant des lignées cellulaires stables exprimant chacun des récepteurs couplés à une EGFP. Nous avons observé, par microscopie confocale, que la cinétique et le taux d'internalisation étaient similaires pour tous les variants. Par contre, la voie du traffic intracellulaire est modifiée pour certains. Les variants possédant la mutation C terminale H364 (H364 et N65/H364) sont préférentiellement adressés à la voie de dégradation lysosomiale alors que les autres utilisent la voie classique de recyclage endosomial comme le récepteur sauvage, ainsi que le révèlent les marquages spécifiques de ces compartiments. En conclusion, les résultats obtenus durant cette thèse révèlent que les variants du récepteurs V1B trouvés chez des patients atteints de troubles affectifs ont des propriétés pharmacologiques de couplage et de trafic intracellulaire modifiées. Ces mutations pourraient participer à une plus grande vulnérabilité des patients au stress. Ainsi, elles pourraient être recherchées, à titre de marqueurs génétiques, chez des patients considérés comme à risque.Cette thèse translationnelle a été financée par un contrat doctoral CHRU/UM1. / The release of vasopressin (AVP) and corticoliberin (CRH) triggers the release of ACTH by the mean of V1B and CRF1 receptors, releasing catecholamines and corticosteroids and regulating stress. Genetic modifications of either element may produce severe consequences. Three non-synonymous variants of the V1B receptor gene were found in patients with phobia, hyperactivity or suicidal conducts (respectively K65N, R364H and G191R). To explore the pharmacological properties of these V1B variants, we generated and expressed in HEK293 cells cDNA constructs of each variant. We evaluated ligand affinity, PLC coupling, MAP kinase activation, Ca2+ mobilization. The capacity of R191 variant to accumulate inositol phosphates and to activate MAP kinase under AVP activation was higher as compared to N65 and H364 variants. However, all variants exhibited the same Kact for AVP. V1B variants were not similar in β-arrestin interaction either, with N65 variant impaired for this function, indicating that the deficit in ERK phosphorylation measured previously may result of 2 additional mechanisms, one due to a lower IP/DAG production with impaired coupling to Gq, and the other due to a decrease in β-arrestin interaction. Finally, we compared internalization properties using stable cell lines expressing EGFP–tagged V1B variants and confocal microscopy. First, we observed no difference neither in the internalization kinetics nor in amplitude (70% of total receptors internalized). However, H364 variant showed a different trafficking as compared to K65/G191/R364 (“wt”) and N65, with less cytoplasmic recycling endosomes and more lysosomial addressing as revealed by Lamp1 co-labelling.Altogether, these data reveal that V1B receptor variants in phobic and suicidal patients display modified coupling and/or desensitization processes. These mutations could participate to a predisposition to depression and could be used as diagnosis genetic markers in risky patients.M Manière's Ph.D Scholarship was granted on a translational CHRU/UM1.

Les monocytes détectent des signaux métaboliques circulants qu’ils traduisent en signaux immunologiques. ils infiltrent les tissus inflamés et sont également les précurseurs des macrophages. Dans l’obésité, la fréquence, le nombre, le phénotype et la fonctionnalité des sous populations de monocytes (CD14++CD16- [CM], CD14++CD16+ [IM] et CD14+CD16++ [NCM]) sont spécifiquement modulés. Le phénotype des monocytes est pro-inflammatoire avec une plus forte réponse à la stimulation de TLR4 et de TLR8. Nos travaux suggèrent une capacité migratoire accrue des CM et des IM. La comparaison du transcriptome des sous populations chez des sujets obèses et des témoins, révèle une signature spécifique de chaque sous population montrant un plus fort impact de l’obésité sur les CM. Ils soutiendraient l’inflammation en modulant des gènes impliqués dans la signalisation cellulaire. Ils migreraient avec les IM vers les tissus inflamés. Les NCM resteraient plus longtemps dans la circulation où leur fonction de « patrouilleurs » serait accrue. Les gènes les plus modulés par les CM et les IM, respectivement Clusterine et CDGSH iron sulfur domain 1 sont des ponts entre la réponse immunitaire, le métabolisme et la réponse au stress. L’étude des « tops » gènes dont l’expression est la plus fortement modulée et des fonctions les plus probablement modulées révèle que le métabolisme des monocytes serait modifié dans l’obésité. Ce travail ouvre des perspectives concernant : 1) une éventuelle composante auto-immune de l’inflammation de bas grade et 2) des relations entre des modifications du métabolisme des monocytes et leur fonctionnalité. / Systemic inflammation is pivotal in establishing and sustaining the obesity low-grade inflammatory status. Studying monocytes is important because they can detect metabolic cues in the circulation that are then translated into immunological factors. Monocytes infiltrating inflamed tissues are also macrophage precursors. In obesity, frequency, number, phenotype and functionality of the three monocyte-subsets (CD14++CD16- [CM], CD14++CD16+ [IM] et CD14+CD16++ [NCM]) are specifically altered. We observed a pro-inflammatory phenotype of monocytes in obesity with an increased response to TLR4 and TLR8 stimulation. Our work suggests an increased migratory capacity of CM and IM. Comparison of the transcriptome of the three subsets in obese and control subjects shows an increased imprint of obesity on CM. CM could sustain inflammation by modulating genes involved in cell signaling. They most probably migrate with the IM toward inflamed tissues. Whereas, NCM should stay longer in the circulation where their patrolling function could be increased. The most modulated genes by CM and IM, respectively Clusterin and CDGSH iron sulfur domain 1 (CISD1) are bridges between immune response, metabolism and stress response. The analysis of the top modulated genes and of the most probably modulated functions indicates that monocyte metabolism is altered by obesity. We open new paths of research: 1) a possible auto-immune trait of the low grade inflammation and 2) a possible link between altered monocyte metabolism and their functionality.

Les dendrimères sont des entités chimiques "arborescentes" multi-ramifiées. Cette famille de polymères non linéaires comporte des applications dans différents domaines. Un dendrimère nommé ABP a montré des propriétés immuno-modulatrices sur le système immunitaire humain in vitro. Ce dendrimère comporte le profil d'un nouvel agent thérapeutique pour être utilisé dans le traitement de maladies inflammatoires chez l'homme. Parmi les cellules mononucléaires du sang humain, le dendrimère ABP cible principalement les monocytes et induit une activation anti-inflammatoire de ces cellules. Cette nouvelle étude a visé à comprendre l'interaction entre le dendrimère ABP et les monocytes humains. De manière intéressante, une interaction spécifique a été observée. En utilisant des expériences de modélisation, de physico-chimie et de biologie moléculaire, nous démontrons que le dendrimère ABP induit une activation anti-inflammatoire des monocytes humains par l'intermédiaire d'un ou de récepteur (s). / Dendrimers are multi-branched "tree-like" chemical entities. This family of non-linear polymers has already been applied in different fields. A dendrimer named ABP has shown some immuno-modulatory properties toward the Human immune system in vitro. This dendrimer is at the dawn to become a new therapeutic agent by itself for the treatment of inflammatory diseases in Human. Among human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), the ABP dendrimer selectively targets human monocytes and induces an anti-inflammatory activation of these cells. This new study aims at understanding the interaction between the ABP dendrimer and human monocytes. Interestingly, a specific interaction was observed. Using, biological, physico-chemical and molecular modelling experiments we demonstrated that the ABP dendrimer triggers monocyte activation through receptor(s) recognition.

Le récepteur au goût sucré est un hétérodimère composé des sous-unités T1R2 et T1R3, alors que les sous-unités T1R1 et T1R3 s’assemblent pour composer le récepteur au goût umami. Chacune de ces sous-unités appartient à la classe C des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les membres de cette famille partagent une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) qui est relié à un domaine transmembranaire par une région riche en cystéines. Le DNT est constitué de deux lobes qui forment le site orthostérique, qui est le site de liaison des principaux agonistes. Il a été montré que les DNT de T1R1 (DNT-T1R1) est capable de lier le L-glutamate alors que le DNT de T1R2 (DNT-T1R2) est capable de lier les sucres naturels et certains édulcorants (Zhang et al., 2008 ; Nie et al., 2005). Cependant les mécanismes moléculaires de détections des molécules sapides au niveau de ces domaines restent encore largement méconnus. Lors de cette étude, nous avons exprimé les DNT-T1R1, DNT-T1R2 humains et le DNT-T1R1 de souris à l’aide de la bactérie Escherichia coli, sous forme de protéines insolubles, appelés corps d’inclusion (CI). Les CI ont été purifiés puis solubilisés en utilisant un agent chaotrope. Ensuite, les protéines ont été repliées in vitro puis caractérisées par différentes approches parmi lesquelles l’électrophorèse, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroïsme circulaire. Leur fonctionnalité a ensuite été vérifiée par microcalorimétrie de titration isotherme. Nous avons montré que les protéines sont fonctionnelles et présentent des affinités en accord avec les données sensorielles. Les grandes quantités de protéines produites permettront de futures études structurales par cristallographie. Parallèlement à ce travail, nous avons étudié un polypeptide végétal, inhibiteur des goûts sucré et umami chez les rongeurs, appelé gurmarine. Afin de pouvoir étudier son interaction avec les DNT des récepteurs gustatifs de souris, nous avons mis au point l’expression et la purification de gurmarine recombinante produite en levure Pichia pastoris. Ce système d’expression a permis la production de quantités importantes de gurmarine dont les caractéristiques structurales ont été vérifiées par dichroïsme circulaire et résonnance magnétique nucléaire. Nous avons aussi, par mutagénèse dirigée, modifié différents acides aminés décrits comme étant potentiellement impliqués dans l’interaction avec les récepteurs aux goûts sucré et umami. En collaboration, l’activité de la gurmarine a été confirmée à l’aide d’un test cellulaire basé sur l’expression fonctionnelle du récepteur de rat T1R2/T1R3. A l’aide de différentes combinaisons des sous-unités humaines et de rongeurs, nous avons montré que l’inhibition par la gurmarine nécessitait la présence de la sous-unité T1R3 de rat. / The sweet taste receptor is a heterodimer composed of two subunits called T1R2 and T1R3 whereas the T1R1 and the T1R3 subunits form a heterodimeric receptor for umami taste (the savory taste of monosodium glutamate). Each subunit belongs to the class C of G protein-coupled receptors (GPCRs) and is constituted by a large extracellular N-terminal domain (NTD) linked to the transmembrane domain by a cysteine-rich region. The NTD is composed of two lobes separated by a cleft in which ligands bind. T1R1- and T1R2-NTDs are able to bind sweeteners and umami compounds respectively and undergo ligand-dependent conformational changes (Zhang et al., 2008; Nie et al., 2005). However, the relative contribution of the two subunits to the heterodimeric receptor function remains largely unknown. To study the binding specificity of each subunit, a large amount of purified NTDs is suitable for biochemical and structural studies. To accomplish this goal, we expressed T1R1- and T1R2-NTD in high level in Escherichia coli as insoluble aggregated proteins (inclusion bodies). The proteins were solubilized and in vitro refolded using suitable buffer and additives. The soluble proteins were then purified and characterized using electrophoresis, gel filtration, fluorescence spectroscopy and circular dichroism. The functionality of T1R1- and T1R2-NTD was measured the using isothermal microcalorimetry. Our data showed that the proteins are properly refolded and able to bind sweet or umami compounds with physiological relevant affinities. In summary, our expression system will allow large-scale production of active T1R1- and T1R2-NTD suitable for structural and functional studies. In addition to this work, we have studied a 35 residue polypeptide named gurmarin, well known to selectively inhibit responses to sweet substances without affecting responses to other basic taste stimuli, such as NaCl, HCl, and quinine in rodents. To further understand the structural basis of gurmarin recognition by T1R2-T1R3 receptor, we developed for the first time the heterologous expression of gurmarin using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. This system allowed the expression of large quantities of recombinant gurmarin. The structural properties of gurmarin were checked by circular dichroism and nuclear magnetic resonance. We generated six mutants with single amino acids substitutions in the putative site of interaction between gurmarin and the rodent sweet taste receptor, using site-directed mutagenesis. In collaboration, the biological activity of was confirmed using a cell-based assay based on expression of rat T1R2-T1R3. Thanks to various combinations of human and rat T1R2-T1R3 chimeras, we showed that NTD of rat T1R3 is the major determinant of gurmarin’s inhibition.

Il y a quatre ans, lorsque j’ai commencé ma thèse en Neuropharmacologie, le rôle fonctionnel du récepteur serotoninergique2B (5-HT2B) central n’était guère connu. En effet, compte tenu de la mise en évidence de son expression dans le cerveau relativement récente par rapport aux autres récepteurs à la 5-HT, peu d’études avaient porté sur son impact au sein du système nerveux central. En particulier, il était établi que les récepteurs 5-HT2B, sans effet au niveau de la voie dopaminergique (DA) nigrostriée, sont capables d’exercer un contrôle tonique excitateur sur l’activité de la voie DA méso accumbale. Sur la base de cette régulation différentielle des voies DA sous-corticales, il avait été proposé que les antagonistes du récepteur 5-HT2B pourraient constituer des outils pharmacologiques pertinents pour le traitement des pathologies liées à unedysfonction du système DA et requérant une modulation indépendante des voies DA ascendantes, telles que la schizophrénie. Cependant, l’effet du blocage des récepteurs 5-HT2B au niveau de la voie DA mésocorticale, laquelle joue un rôle pivot dans le bénéfice thérapeutique des antipsychotiques (APs) atypiques,n’avait jamais été exploré. De plus, l’analyse de la littérature avait révélé que le blocage du récepteur 5-HT2B réduit les réponses neurochimiques et comportementales induites par l’amphétamine et la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine, suggérant que ce récepteur pourrait également représenter une cible pharmacologique intéressante pour le traitement de l’addiction. Néanmoins, la possible implication de ce récepteur dans les effets de la cocaïne, l’une des drogues les plus consommées au monde, restait alors inconnue.Ainsi, l’objectif de cette thèse était d’étudier l’influence exercée par le récepteur5-HT2B sur l’activité DA basale et activée par la cocaïne, afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de ce récepteur dans le traitement de la schizophrénie et de l’addiction. A cette fin, nous avons étudié les effets de deux antagonistes puissants et sélectifs du récepteur 5-HT2B (RS 127445 et LY 266097) sur l’activité DA, en utilisant des approches biochimiques, électrophysiologiques et comportementales chez le rat.Un premier groupe d’expériences a mis en évidence l’existence d’un contrôle tonique inhibiteur exercé par le récepteur 5-HT2B sur la libération de DA dans le cortex préfrontal médian (CPFm). Ce résultat, démontrant que les récepteurs 5-HT2B régulent de manière différentielle les trois voies DA ascendantes, indique que les antagonistes du récepteur 5-HT2B présentent un profil d’action idéale pour restaurer une fonction DA normale chez les patients schizophrènes. En accord avec cette proposition, les antagonistes 5-HT2B se révèlent efficaces dans plusieurs modèles classiquement utilisés pour prédire l’efficacité des APs, alors qu’ils n’ont pas d’effet dans une tâche comportementale prédisant la tendance des APs à induire des effets secondaires moteurs. Un second groupe d’expériences visant à étudier les mécanismes sous-tendant le contrôle différentiel exercé par le récepteur 5-HT2B sur l’activité DA montre que les effets opposés induits par les antagonistes 5-HT2B sur la libération de DA dans le CPFm et le noyau accumbens (NAc) résultent d’une interaction fonctionnelle avec les récepteurs 5-HT1A exprimés dans le CPFm. Enfin, nous avons également démontré que le blocage du récepteur 5-HT2B supprime l’hyperlocomotion provoquée par la cocaïne. Cet effet, qui se produit indépendamment de la libération de DA dans le NAc et le striatum, où l’activité DA est étroitement liée aux effets comportementaux induits par la cocaïne,implique une interaction post-synaptique dans les régions DA sous-corticales. En conclusion, le travail accompli au cours des quatre années passées apporte des informations substantielles quant au rôle fonctionnel du récepteur 5-HT2Bdans la régulation des voies DA ascendantes. / Four years ago, at the beginning of my thesis in Neuropharmacology, the functional role of the central serotonin2B receptor (5-HT2BR) remained poorly investigated. Indeed, in light of the relatively recent discovery of its presence in the mammalian brain, as compared to other 5-HT receptors, only few studies had explored its impact within the central nervous system. Interestingly, it had been shown that 5-HT2BRs, while having no effect at the level of the nigrostriatal dopaminergic (DA) pathway, afford a tonic excitatory control on the activity of the mesoaccumbal DA tract. This differential influence on subcortical DA brain regions had led to the proposal that 5-HT2BR antagonists may be a useful tool for improved treatment of DA-related disorders requiring an independent modulation of the activity of ascending DA pathways, such ass chizophrenia. However, the effect of 5-HT2BR blockade at the level of themesocortical DA pathway, which plays a pivotal role in the the rapeutic benefit of atypical antipsychotic drugs (APDs), had never been studied. In addition,analysis of the literature revealed that 5-HT2BR blockade suppresses amphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine-induced neurochemical and behavioral responses, suggesting that this receptor may also be a relevant pharmacological target for treating drug addiction. Nevertheless,its possible implication in the effects induced by cocaine, one of the most worldwide abused drugs, remained unknown.Thus, the aim of the present thesis was to study the regulatory control exerted by the 5-HT2BR on both basal and cocaine-induced stimulation of DA activity,in order to evaluate its therapeutic relevance for improved treatment of schizophrenia and drug abuse and dependence. To this purpose, we assessed the effects of potent and selective 5-HT2BR antagonists (RS 127445 and LY266097) on DA activity, by using biochemical, electrophysiological and behavioral approaches in rats.In a first group of experiments, we found that 5-HT2BRs exert a tonic inhibitory control on DA outflow in the medial prefrontal cortex (mPFC). This finding, by showing that 5-HT2BRs afford differential controls over the three ascending DA pathways, indicates that 5-HT2BR antagonists display an ideal pattern of effects to restore normal DA function in schizophrenia. Accordingly, 5-HT2BRantagonists were efficient in several behavioral models aimed at predicting APD efficacy, and had no effect in a behavioral task reflecting APD propensity to induce motor side effects. In a second group of experiments performed to determine the mechanisms under lying the differential control exerted by 5-HT2BRs on DA activity, we demonstrated that 5-HT2BR antagonist-induced opposite effects on DA ouflow in the mPFC and the nucleus accumbens (NAc)involve a functional interplay with 5-HT1ARs expressed in the mPFC. Finally,we found that 5-HT2BR blockade suppresses cocaine-induced hyperlocomotion.This effect, which occurs independently from changes of DA outflow in theNAc and the striatum, where DA activity is tightly related to cocaine-induced behavioral responses, likely involves a post-synaptic interaction in subcorticalDA brain regions.To conclude, the work accomplished over the past four years provides substantial information with regards to the functional role of 5-HT2BRs in the regulation of the activity of ascending DA pathways. In addition, while improving the understanding of the interaction between DA and 5-HT systems,the present findings altogether highlight the therapeutic potential of 5-HT2BRantagonists for treating schizophrenia and cocaine addiction.

Après les nombreux succès de la vaccination au XXème siècle, elle se heurte aujourd’hui aux pathogènes émergents qui nécessitent le développement de nouvelles formulations vaccinales, afin d’induire des réponses immunitaires complètes, et particulièrement des réponses CD8+ cytotoxique efficaces. Nous avons développé une stratégie innovante utilisant des pseudo-particules virales (VLP) dérivées d’un rétrovirus murin, le Virus de la Leucémie Murine (MLV), comme plateforme antigénique. Ces rétroVLP sont des candidats vaccins de choix, sécuritaires en raison de l’absence de matériel génomique et facilement manipulables par génie génétique, ce qui permet de les proposer dans différentes stratégies vaccinales, et notamment contre le VIH. Notre approche consiste à utiliser comme vaccin des rétroVLP recombinantes produites ex vivo, ou l’ADN codant les protéines capables de former in situ ces rétroVLP (stratégie dite « plasmoVLP »). Les travaux antérieurs de l’équipe ont montré que la formation des rétroVLP améliorait les réponses immunitaires dirigées contre les antigènes qu’elles véhiculent, et nous avons cherché au cours de cette étude à mieux caractériser les mécanismes expliquant leur immunogénicité. Nous avons montré dans un premier temps que les rétroVLP étaient capables d’activer efficacement les cellules dendritiques in vitro et in vivo, et de déclencher des réponses aussi bien humorales que cellulaires contre les protéines d’enveloppe du VIH et contre des épitopes T insérés dans la capside. Les mécanismes d’activation des cellules dendritiques ont également été précisés par une analyse transcriptomique. De plus, la vaccination plasmoVLP, qui favorise les réponses CD8+, a aussi montré de fortes réponses cellulaires contre des antigènes tumoraux associées à des résultats de protection très encourageants, y compris dans des schémas de vaccination thérapeutiques. Par ailleurs, nous avons développé au cours de ces travaux une nouvelle stratégie consistant à moduler l’immunogénicité des rétroVLP en ajoutant dans leur structure des molécules adjuvantes, notamment des ligands des récepteurs de type Toll (TLR). Ainsi, nous avons conçu et breveté au laboratoire une molécule d’ARN simple brin que nous avons appelée ncRNA. Nous avons mis en évidence l’effet immunostimulant du ncRNA, qui est capable d’activer plus efficacement les cellules dendritiques in vitro, d’orienter les réponses CD4+ vers un profil Th1 et de promouvoir la prolifération des lymphocytes T CD8+ spécifiques des antigènes véhiculés par les rétroVLP in vitro, démontrant qu’il améliore l’efficacité de la présentation croisée. Les réponses vaccinales contre les épitopes T internes et l’enveloppe du VIH sont également augmentées en présence de ncRNA, par un mécanisme impliquant la voie des TLR. Ces travaux ont donc permis de mieux caractériser l’immunogénicité des rétroVLP, mettant ainsi en avant leur potentiel vaccinal, et démontrent l’efficacité d’une stratégie d’adjuvantation innovante et prometteuse utilisant un ligand des TLR. / After a century of success, vaccination now faces new pathogens that require the development of new formulations to induce complete immune responses, especially potent CD8+ cytotoxic responses. We developed a novel strategy based on virus-like particles (VLPs) deriving from the Murine Leukemia Virus (MLV), so-called retroVLPs, as antigen platforms. RetroVLPs are promising vaccine candidates, as they are totally safe due to the lack of any genomic material in their composition, and they can be easily manipulated by genetic engineering, which allows using them in different vaccine strategies, including against HIV. We can use retroVLPs as a vaccine by producing them ex vivo and injecting them as proteins, or by injecting the DNA plasmids that encode the structural proteins that can self-assemble in vivo (“plasmoVLP” strategy). Previous work had shown that the retroVLP formation improves immune responses against antigens they carry, and we aimed in this study to better characterize the mechanisms explaining their immunogenicity. We showed that retroVLPs efficiently activate dendritic cells in vitro and in vivo, and trigger humoral as well as cellular vaccine responses, against HIV envelope and T cell epitopes inserted in the capsid. The mechanisms of dendritic cells activation have also been specified by transcriptome analysis. Moreover, plasmoVLP vaccination, which promotes CD8+ responses, showed strong cellular responses against tumor antigens associated with good protection, including in therapeutic vaccination schemes. Otherwise, we developed during this work a new strategy in order to modulate the immune properties of retroVLPs by adding in their structure adjuvant molecules, and particularly Toll-like receptor (TLR)-ligands. Thus, we designed and patented a single-stranded RNA acting as a TLR-ligand, that we called ncRNA. We demonstrated the immunostimulating properties of ncRNA, which is able to induce a higher activation of dendritic cells in vitro when carried by the retroVLPs, and to promote Th1-biased CD4+ T cell responses as well as proliferation of CD8+ T cell specific for an internal epitope carried into the retroVLP, showing ncRNA improves the efficacy of cross-presentation. Vaccine responses against both internal epitopes and HIV envelope are also improved in the presence of ncRNA, by a TLR-dependent mechanism. This work helped to better characterize the immunogenicity of retroVLP, highlighted their vaccine potential, and demonstrate the effectiveness of an innovative and promising strategy adjuvantisation using a TLR-ligand.