L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une insuffisance médullaire, des malformations congénitales et une prédisposition accrue au développement de cancers. Aujourd’hui, 16 protéines sont identifiées pour coopérer ensemble dans la voie métabolique de Fanconi, impliquées principalement dans la réparation de l’ADN. Pour mieux comprendre le rôle des protéines Fanconi dans d’autres mécanismes cellulaires, un criblage en double hybride a été réalisé au laboratoire afin d’identifier plusieurs nouveaux partenaires protéiques d’intérêt. La protéine associée aux microtubules, la stathmine (STMN) a ainsi été identifiée comme un nouveau partenaire potentiel de la protéine Fanconi C (FANCC). L’étude de l’interaction a confirmé un lien direct entre FANCC et STMN et révèle qu’une mutation ponctuelle, ou une délétion de l’exon 1 de FANCC, cause une perte de cette interaction. Afin d’éclaircir la fonction du complexe FANCC-STMN, nous avons étudié la localisation des protéines durant le cycle cellulaire par immunofluorescence. Les résultats ont permis de mettre en évidence une localisation commune de FANCC et STMN dans les centrosomes de cellules en mitose. Une variation de l’état de phosphorylation de STMN dans les centrosomes a été observée dans plusieurs lignées cellulaires de patients. Ainsi, les protéines FANC semblent participer à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la progression du cycle cellulaire. Pour finir, les cellules de patients FA présentent de nombreuses malformations mitotiques, tels qu’un nombre important de centrosomes surnuméraire et un fuseau mitotique de petites tailles. Notre étude a permis de montrer que la protéine FANCC participe à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la division cellulaire, via une interaction directe. Nos résultats suggèrent également que les protéines FANC semblent participer à la progression du cycle cellulaire, en régulant de manière indirecte l’activité de STMN. Puisque la dérégulation de STMN est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse, une augmentation de l’activité de STMN dans les cellules FA semble expliquer la sensibilité des patients à développer différents types de cancer et représente une nouvelle cible prometteuse pour le traitement des cancers chez les patients FA. / The Fanconi Anemia (FA) is a genetic recessive disease characterized by a bone marrow failure, various congenital malformations, and predispose to the development of cancers. Currently, 16 proteins are identified to cooperate together in Fanconi pathway, known mainly to play a role in DNA reparation. For better understanding the involvement of Fanconi proteins in other cellular mechanisms and to identify new partners of interest, a double hybrid screen had been realized at the laboratory. The microtubule-associated protein, the stathmin (STMN), had been identified as a new potential protein partner of the Fanconi protein C (FANCC). Our study has confirmed a direct interaction between FANCC and STMN proteins, and identified that a punctually mutation or exon 1 deletion in FANCC induced a loss of this interaction. In order to clarify the function of the FANCC-STMN complex, we have study the localization of these proteins during the cell cycle by immunofluorescence experiments. These results have unveiled a co-localization of FANCC and STMN proteins in the centrosome of cells in mitosis. A decrease of STMN phosphorylation in the centrosome had been observed in fibroblast cells of FA patients. So, the FANC protein seems to be involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell cycle progression. Finally, the cells from FA patients display many mitotic spindle abnormities, such as an elevated number of supernumerary centrosomes and a decrease of mitotic spindle sizes. Our study demonstrates that the FANCC protein is involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell division. Our results suggest also that the FANC protein seems participate in the cell cycle progression. Knowing that the STMN deregulation is involved in the carcinogenesis, an increase of STMN activity in the FA cells seems explain the sensibility of patients to develop various cancers. The STMN protein represents a possible therapeutic target to cancer treatment of FA patients.

Dix-sept sujets sains marchaient sur un tapis roulant avant, pendant et après une exposition, de durée variable (49-1629 cycles de marche), à un champ de force perturbant la marche, appliqué à la jambe par un élastique (2 jours consécutifs). Le but était de voir l'effet de la durée d'exposition au champ de force élastique sur le contrôle de la jambe durant la locomotion. Avec l'élastique, une erreur initiale était observée dans la vitesse maximale du premier orteil puis les suj ets adaptaient graduellement leur patron de marche (vitesse de l'orteil, activité musculaire). Au jour 1, après le retrait de la force, une persistance temporaire du patron modifié était observée. Les sujets ayant été exposés plus longtemps à l'élastique maintenaient ce patron plus longtemps. Au jour 2, avec l'élastique, les sujets avaient significativement réduit l'erreur initiale de la vitesse de l'orteil indépendamment de la durée d'exposition du jour 1. Ces résultats suggèrent que, lors de la marche dans un champ de force, une exposition de courte durée (2: 49 cycles de marche) semble suffisante pour obtenir un ajustement des paramètres locomoteurs et une rétention de ceux-ci lors d'une deuxième exposition.

Plusieurs pathologies sont liées à un excès de cholestérol, notamment l'athérosclérose et les maladies neurodegeneratives, telles que l'Alzheimer et le Parkinson. Le cérébrostérol (24S-hydroxycholestérol) constitue la principale forme d'élimination du cholestérol du cerveau et excrété au niveau du foie. Dans le foie, environ 50% du cérébrostérol est métabolisé en un dérivé glucuronidé et sulfaté. Par ailleurs, le cérébrostérol a aussi une fonction biologique comme activateur naturel des récepteurs nucléaires LXRa et p. Nos travaux avaient pour but de clarifier le rôle de la glucuronidation dans l'homéostasie et le contrôle de l'activité biologique du 24S-hydroxycholestérol. Nous avons identifié le 24S-hydroxycholestérol et le 24S-hydroxycholestérol-3-sulfate-24-glucuronide comme étant les metabolites circulants les plus abondants chez l'humain. Également, nous avons identifié l'enzyme UDP-glucuronosyltransferase (UGT)1A4 comme étant l'enzyme responsable de la glucuronidation du 24S-hydroxycholestérol. Enfin, nous avons mis en évidence l'effet positif de l'activation de LXRa sur l'expression hépatique d'UGT1A4, suggérant ainsi que le 24S-hydroxycholestérol est capable de réguler son propre métabolisme. Ces résultats permettent de mieux comprendre les processus moléculaires régissant le métabolisme et l'inactivation du 24S-hydroxycholestérol, et méritent d'être approfondis, afin de déterminer l'intérêt thérapeutique de la glucuronidation du cérébrostérol dans le cadre de traitements visant à réduire l'excès de cholestérol au cerveau.

Thèse en cotutelle : Université Laval, Québec, Canada et Università Studi Cagliari, Cagliari, Italie / Les facteurs environnementaux jouent un rôle clé dans le développement du syndrome métabolique et de l'obésité, qui sont maintenant de véritables épidémies soulevant des problèmes de santé publique. Les excès de graisse corporelle dans l'obésité et la perte de masse grasse et maigre dans les conditions de dénutrition ou d'anorexie mentale sont le résultat d'un déséquilibre énergétique. Par conséquent, le maintien de l'équilibre énergétique est crucial à la fois pour la prévention de l'obésité et pour le traitement de l'anorexie mentale et d'autres formes de dénutrition. Les signaux lipidiques tels que ceux médiés par les médiateurs des endocannabinoidomes sont profondément impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Dans cette thèse, au sein de deux projets différents, nous avons étudié comment différents facteurs environnementaux, y compris la restriction calorique, l'activité physique, la supplémentation en vitamine D et les médicaments antipsychotiques, peuvent conduire à une modification du métabolisme énergétique par la modulation de la signalisation des endocannabinoïdomes. Les résultats des travaux expérimentaux montrent comment les différentes conditions étudiées provoquent des changements dans les niveaux tissulaires du médiateur lipidique endocannabinoïdome ainsi que dans l'expression de leurs récepteurs et enzymes métaboliques, ce qui peut contribuer aux changements observés de la masse grasse corporelle et du métabolisme énergétique au sein des modèles. Nous concluons que les conditions étudiées peuvent provoquer des changements dans le bilan énergétique par altération de l'endocannabinoidome. / Environmental factors play a key role in the development of obesity-induced metabolic syndrome and obesity, which are now true epidemics raising public health concerns. Both excess body fat in obesity, and fat and lean mass loss in undernutrition conditions or anorexia nervosa, are the result of energy imbalance. Therefore, maintaining energy balance is crucial for both the prevention of obesity and the treatment of anorexia nervosa and other forms of undernutrition. Lipid signals such as those mediated by endocannabinoidome mediators are deeply involved in the control of energy metabolism. In this thesis, within two different projects, we studied how different environmental factors including calorie restriction, physical activity, vitamin D supplementation and antipsychotic drugs, may lead to energy metabolism modification through modulation of the endocannabinoidome signaling. The results of the experimental work show how the different studied conditions cause changes in the tissue levels of endocannabinoidome lipid mediator as well as in the expression of their receptors and metabolic enzymes, which may contribute to the observed changes in body fat mass and energy metabolism within the models. We conclude that the investigated conditions may cause changes in energy balance through alteration of the endocannabinoidome.

La relation entre la mère et l'enfant a un impact sur le développement du système nerveux du nouveau-né. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle de stress, chez le rat, perturbant cette relation. Nous nous sommes intéressés aux conséquences à long terme de ce stress néonatal sur les mécanismes contrôlant la ventilation lors d'un excès sanguin de CO2 (hypercapnie). Une altération de ce réflexe ventilatoire est une des causes de plusieurs troubles respiratoires tels que les apnées du sommeil. Il a été observé, dans notre laboratoire, que la SMN altère la réponse ventilatoire à l'hypercapnie (RVHC) de façon différente selon le sexe de l'animal. Cette thèse a pour but de trouver les mécanismes, affectés par la SMN, responsables des altérations de la RVHC. Nous nous sommes premièrement intéressés à la contribution des chémorécepteurs et barorécepteurs carotidiens chez les mâles. Cette étude a révélé une inhibition de la contribution des chémorécepteurs carotidiens à la ventilation et une augmentation du baroréflexe inhibant la ventilation. Par contre, il subsiste toujours une diminution de la sensibilité de la RVHC qui n'est pas attribuable aux corps carotidiens. Nous avons donc évalué la chémodétection centrale, mais elle ne semble pas responsable du phénotype. Par la suite, nous avons testé l'influence des récepteurs bronchopulmonaires d'étirement sur la ventilation. Nous avons observé une inhibition du réflexe d'Hering-Breuer chez les rats SMN qui pourrait expliquer l'altération de la RVHC dans certaines conditions. Finalement, chez les rates adultes, nous avons découvert que la SMN n'affecte pas la production d'hormones sexuelles et que l'augmentation de la RVHC est inhibée par l'anesthésie. Nous concluons que, chez les rats mâles, la SMN affecte la contribution des afférences périphériques probablement par une altération de l'intégration au niveau central et que, chez les femelles, l'augmentation de la RVHC, chez les rats éveillés, est probablement causée par l'effet anxiogène du CO2.

Lorsque l’insuline se lie à son récepteur, elle induit une cascade de réactions indispensables à l’utilisation du glucose. La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 qui affectent une fraction croissante de la population résultent d’un défaut de signalisation de l’insuline. La voie de signalisation PI3K qu’emprunte l’insuline pour promouvoir l’utilisation du glucose est d’abord décrite en introduction de cette thèse. Aussi, il existe plusieurs mécanismes de désensibilisation qui sont essentiels pour limiter l’ampleur du signal à la réponse métabolique requise. Cependant, ces mécanismes sont altérables et de faibles dérèglements peuvent devenir responsables d’une propagation défaillante du signal insulinique. Les souris viable motheaten (mev), déficientes en activité SHP-1, nous ont permis au premier chapitre de démontrer que SHP-1 constitue un de ces mécanismes de désensibilisation. Ces souris montrent une plus grande tolérance au glucose et une meilleure sensibilité à l’insuline que les souris non-déficientes en SHP-1, ainsi qu’une meilleure signalisation de l’insuline dans le foie et le muscle squelettique. De plus, nous avons pu démontrer que SHP-1 contrôle aussi la clairance hépatique de l’insuline, importante pour réguler la concentration et la sensibilité systémique de l’insuline. Cette première étude a donc permis d’établir un nouveau rôle pour SHP-1 dans la régulation de l’action de l’insuline. Par la suite, il devenait primordial de décrire les mécanismes impliqués dans la sensibilisation à l’insuline par la déficience en SHP-1 dans le muscle et le foie. À l’aide d’adénovirus codant pour un mutant catalytiquement inerte de SHP-1 (DNSHP-1), nous rapportons au deuxième chapitre, par l’expression de DNSHP-1 dans les hépatocytes Fao, que la diminution de la production hépatique de glucose observée chez les souris mev résulte d’une augmentation de la glycogénèse plutôt que d’une diminution de la gluconéogenèse. Enfin, au dernier chapitre, DNSHP-1 exprimé dans les myocytes L6 favorise la signalisation via Akt, et accroît l’expression de GLUT4, le principal transporteur de glucose sensible à l’insuline. Ensemble, nos résultats suggèrent clairement que SHP-1 est un nouveau modulateur de l’action de l’insuline dans le foie et le muscle squelettique. SHP-1 pourrait donc représenter une nouvelle cible thérapeutique pour traiter le diabète de type 2. / After binding to its receptor, insulin induces a reaction cascade that is essential for glucose utilization. Insulin resistance and type 2 diabetes are affecting an increasing portion of the population and result from insulin signaling impairment. Insulin signaling pathways promoting glucose utilization are reviewed in the introduction of the thesis, as well the desensitization mechanisms which are crucial to limit insulin signal duration and intensity. Viable motheaten (mev) mice, harboring a spontaneous mutation leading to SHP-1 activity deficiency, allowed us to demonstrate in chapter I that SHP-1 constitutes one of these desensitization mechanisms. Indeed, mev mice showed an increased glucose tolerance and insulin sensitivity as compared to wild type littermates, resulting from increased insulin signaling in liver and skeletal muscle. Moreover, we show that SHP-1 controls hepatic insulin clearance, which is important to control systemic insulin concentration and sensitivity. This first study thus establishes a novel role for SHP-1 in the regulation of insulin action and glucose homeostasis. Thereafter, it became primordial to describe cell autonomous mechanisms by which SHP-1 enhances insulin sensitivity in liver and muscle. In the second chapter, expression of DNSHP-1 using adenoviral gene transfer into Fao rat hepatoma cells indicates that decreased hepatic glucose production observed in mev mice is likely the result of enhanced glycogenesis rather than reduced gluconeogenesis. Finally, I show in the last chapter that DNSHP-1 expression in myocytes increased insulin signaling to Akt, and increased GLUT4 expression, the main insulin responsive glucose transporter. Together, our results clearly establish that SHP-1 is a new modulator of insulin action in liver and skeletal muscle. SHP-1 may represent a novel therapeutic target to combat type 2 diabetes.

Le facteur de transcription GATA4 est essentiel au développement et à la fonction des tissus dérivant du mésoderme et de l’endoderme, incluant les gonades. Le gène GATA4 est exprimé sous différents transcrits qui se distinguent par la séquence de leur premier exon non codant. Deux de ces transcrits sont majoritairement exprimés et sont conservés à travers les espèces : le transcrit GATA4 E1a (généré par un promoteur proximal 1a) et le transcrit GATA4 E1b (produit par le promoteur distal 1b). Des études effectuées chez des modèles de souris ont démontré qu’une séquence de 5 kb en amont du promoteur 1a du gène Gata4 est suffisante pour récapituler l’expression endogène du gène seulement dans une sous-population de cellules ayant le facteur GATA4, incluant les cellules de Sertoli dans les gonades mâles. Nous avons donc émis l’hypothèse que le promoteur 1b, tout comme le promoteur 1a, contribue au profil d’expression cellules- et tissus-spécifique de Gata4. Afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent l’activité du promoteur alternatif 1b du gène Gata4 in vivo, nous avons généré une souris transgénique exprimant la protéine GFP sous le contrôle d’une séquence de 2 kb en amont de l’exon 1b. L’expression du transgène a été analysée dans plusieurs tissus et à différents stades de développement en détectant la protéine GFP par épifluorescence, immunohistochimie et Western Blot. Les résultats ont démontré qu’une séquence de 2 kb n’est pas suffisante pour induire l’expression du transgène chez la souris et suggèrent que des éléments de régulation supplémentaires sont nécessaires pour permettre l’expression endogène du gène Gata4 via son promoteur alternatif 1b. Afin d’identifier ces éléments, divers outils bio-informatiques couplés à des analyses in vitro ont été utilisés. Mes travaux de maîtrise mettent en évidence huit nouveaux enhancers potentiellement impliqués dans la régulation de l’activité du promoteur 1b de Gata4. Les résultats de cette étude permettent une meilleure compréhension des mécanismes transcriptionnels de l’activité du promoteur 1b de Gata4 dans différents types cellulaires et à différents stades du développement. / The GATA4 transcription factor is essential for the development and function of multiple tissues derived from both mesoderm and endoderm, such as the gonads. The GATA4 gene is expressed as multiple transcripts that differ in their first untranslated exon sequence. Two of them are predominantly expressed and are conserved among species: transcripts GATA4 E1a (generated by the proximal 1a promoter) and GATA4 E1b (via its distal 1b promoter). Previous studies using transgenic mice demonstrated that a 5 kb sequence upstream of 1a promoter is sufficient to recapitulate endogenous Gata4 expression only in a subset of cells normally containing GATA4, including Sertoli cells in the male gonad. We therefore hypothesized that 1b promoter, like 1a promoter, contributes to cell- and tissue-specific Gata4 expression. To gain insight into the mechanisms that control the activity of the Gata4 1b promoter in vivo, we generated transgenic mice expressing a GFP reporter under the control of 2 kb of sequences upstream of the distal promoter. Transgene expression was assessed in several tissues and at many developmental stages by detecting GFP protein by epifluorescence, immunohistochemistry and Western Blot. The results showed that 2 kb of upstream sequences of Gata4 1b promoter are not sufficient to direct transgene expression in the mouse and suggest that other elements are required for endogenous transcription of the gene from its distal 1b promoter. To identify these elements, several bioinformatic analyses coupled with in vitro assays were performed. My work highlights eight new enhancers potentially involved in Gata4 1b promoter activity. The results from this thesis will help to provide a better understanding of the mechanisms involved in the transcriptional regulation of the GATA4 gene in different cell types and at different developmental stages.

Ce travail s'inscrit dans un programme de recherche sur les mécanismes de régulation génique par les hormones glucocorticoïdes. Il rapporte la mise au point d'un système de transfert de gènes et d'analyse transcriptionnelle dans l'oocyte de Xenope, par la micro-injection de plasmides recombinants du gène viral de la thymidine kinase (TK), dont l'un porte une séquence du virus de la tumeur mammaire de souris contenant les sites de réponse aux hormones glucocorticoïdes. Le travail inclut la mise au point des conditions pratiques de micro-manipulation, l'évaluation de diverses méthodes de purification de l'ARN total d'oocyte pour l'analyse transcriptionnelle et la standardisation d'une technique simple de préparation des transcrits par séparation sur coussin de chlorure de cesium, et enfin l'analyse de l'activité transcriptionnelle TK des recombinants micro-injectés. La cartographie à la nucléase S_l montre que la transcription des plasmides modèles est correctement initiée dans le système oocyte. / Montréal Trigonix inc. 2018

Le cotransporteur Na+-K+-G" rénal, aussi appelé NKCC2, est une protéine polytopi-que dont le rôle est de coupler le mouvement des ions Na+, K+ et Cl" à la surface cellulaire. Il est exprimé exclusivement dans la membrane apicale de l'anse ascendante large de Henle (TALH) où il veille à la réabsorption des ions filtrés. Ce faisant, il contribue à la concentration et à la dilution de l'urine, au rétrocontrôle tubuloglomérulaire et au maintien de la pression artérielle (PA) via celui du volume extracellulaire. À cet effet, l'inactivité de NKCC2 dans le syndrome héréditaire de Bartter se manifeste par des pressions qui sont souvent normales basses. L'activité de NKCC2 augmente lorsque la concentration intracellulaire (Ci) des ions transportés diminue, et ce, grâce à des modifications posttranslation-nelles qui incluent la phosphorylation du transporteur. L'activité de NKCC2 est aussi régulée avant l'étape de la traduction en protéine, mais il y a peu de données disponibles à ce chapitre. Le but du présent mémoire était de déterminer si des changements de la concentration intracellulaire des ions Na⁺, K⁺ ou C1⁻ affectaient aussi l'expression de NKCC2 par des mécanismes opérant aux étapes transcriptionnelle ou posttranscriptionnelle de la synthèse du transporteur. Pour ce faire, nous avons transfecté des cellules immortalisées provenant du TALH avec des régions promotrices de NKCC2, les avons soumises à différentes conditions de culture, et les avons analysées de manière à quantifier l'activité transcriptionnelle de NKCC2 et son expression. Nos résultats montrent qu'à court terme, une diminution de la concentration intracellulaire des ions Na⁺ et Cl⁻ entraîne une augmentation de l'activité transcriptionnelle de NKCC2 et sans doute aussi de la stabilité de son ARNm, alors qu'à moins court terme, elle entraîne une diminution de l'activité transcriptionnelle de NKCC2. Ces données suggèrent donc l'existence de facteurs de transcription dont l'activité est sensible à la concentration intracellulaire des ions transportés par NKCC2 et dont la cible comprend le promoteur du gène. Elles suggèrent aussi que l'effet immédiat d'une diminution de la concentration intracellulaire des ions est d'augmenter l'activité de NKCC2 par différents mécanismes à action rapide, mais que l'effet plus tardif est d'autolimiter la synthèse du cotransporteur à l'étape transcriptionnelle pour empêcher un transport excessif des ions vers l'intérieur de la cellule.

Les androgènes contrôlent la prolifération des cellules de prostate en activant le récepteur des androgènes (AR). Une exposition prolongée à des concentrations élevées de ces hormones sexuelles mâles favorise toutefois un cancer de la prostate (PCa). La suppression des hormones consiste en un traitement fort utilisé, concrétisé entre autres par l'utilisation d'anti-androgènes, tel le Casodex. De nombreuses études sur des lignées cellulaires de PCa en culture montrent que l'homéostasie des androgènes dépend entre autres des UDP-glucuronosyltransférases (UGT) 2B15 et 2B17. Ce projet de maîtrise s'intéresse d'une part à préciser la régulation des UGT2B15 et 2B17 par le traitement hormonal, représenté par le Casodex, et, d'autre part, à valider in vivo ces observations. Le traitement des lignées cellulaires de PCa AR+ LNCaP et LAPC-4 avec du Casodex dans du milieu avec sérum a induit les UGT2B15/2B17 de façon dose- et temps-dépendantes, tel que déterminé aux niveaux transcriptionnel, protéique et activité avec des PCR en temps réel, des immunobuvardages avec des anticorps spécifiques et des essais enzymatiques de glucuronidation. L'utilisation d'une lignée cellulaire LNCaP contenant un ARN interfèrent inductible contre l'AR a révélé que l'induction des UGT2B15 et 2B17 est AR-dépendante, mais que leur régulation par le Casodex implique AR uniquement pour TUGT2B15. En parallèle, deux types de souris transgéniques pour YUGT2B15 humaine ont été créés en utilisant la portion codante ainsi que l'intron 1 du gène humain, dont l'expression est contrôlée soit par le promoteur de 2,4kb d, UGT2B15 (Tg-p2B15), résultant en une distribution tissulaire similaire à l'humain, soit par le promoteur prostate-spécifique de la probasin (Tg-pProba), confinant l'expression du transgène à la prostate. La caractérisation de ces modèles est présentement en cours. En somme, l'utilisation du Casodex démontre une régulation fine des UGT par les androgènes, qui pourra être approfondie ultérieurement in vivo avec les souris transgéniques.