O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O desenvolvimento de vacinas contra a raiva tão eficientes quanto as atuais ainda é considerado importante para a profilaxia dessa doença devido ao alto número de mortes por ano no mundo. Este trabalho mostra dois sistemas para a expressão recombinante do principal antígeno da raiva, a glicoproteína viral (RVGP): células Schneider 2 de Drosophila melanogaster estavelmente transfectadas (S2 rRVGP) e vírus Semliki Forest (SFV) carregando o RNA da RVGP (SFVRVGP). Ensaios de purificação por cromatografia de afinidade, da rRVGP de S2 rRVGP produzida em biorreator, demonstraram resultados promissores para o isolamento de monômeros da rRVGP. Para os estudos de imunogenicidade, camundongos foram vacinados com rRVGP de S2 rRVGP e SFV-RVGP. Dosagem de anticorpos anti-glicoproteína do vírus da raiva, neutralizantes, IgG1 e IgG2a, e citocinas demonstraram que o SFV-RVGP induziu predominantemente uma resposta imune do tipo celular e que os dois vetores foram capazes de expressar uma rRVGP imunogênica, apresentando um potencial uso clínico (veterinário e humano). / The development of new and equally efficient rabies vaccines is still considered important to the prophylaxis of the disease, which is responsible for many deaths per year worldwide. This work used two systems for recombinant expression of the major rabies antigen, the viral glycoprotein (RVGP): stably transfected Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (S2 rRVGP) and Semliki Forest Virus (SFV) carrying the RNA of RVGP (SFV-RVGP). Purification assays of the rRVGP by metal ion affinity chromatography, from S2 rRVGP cells produced in bioreactor, showed promising results for rRVGP monomers isolation. Analysis of antibodies anti-rabies virus glycoprotein, neutralizing, IgG1 and IgG2a, and citokines showed that the SFV-RVGP induced predominantly a cellular immune response, and both vectors were capable of expressing an immunogenic rRVGP, what reinforces potential clinical applications (veterinary or human).

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

A glicoproteína do vírus rábico (RVGP) é o antígeno capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e a resposta imune protetora contra a infecção pelo vírus rábico. Estudamos as cinéticas de expressão da RVGP e de seu RNA mensageiro (RVGPmRNA) em dois sistemas distintos de expressão recombinante: células de Drosophila melanogaster (S2) e células BHK-21 infectadas com vírus Semliki Forest Virus (SFV). Para isso, fizemos um trabalho de padronização do tratamento de amostras de cultivos celulares, adequando-as a um teste de ELISA para dosagem da RVGP e estabelecemos um método de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) para a dosagem do RVGPmRNA. Desenvolvemos também um novo método de titulação de partículas SFV por qRT-PCR, aplicável a praticamente qualquer construção de SFV recombinante. Em ensaios preliminares, as preparações de RVGP recombinante utilizadas para a imunização de camundongos foram capazes de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e de conferir um bom grau de proteção ao teste de desafio intracerebral com vírus rábico. / The rabies virus glycoprotein is the major antigen able to induce a neutralizing antibody response and survival after challenge against rabies virus infection. We have studied the kinetic expression of RVGP and its messenger RNA (RVGPmRNA) in two different recombinant expression systems: stably transfected Drosophila melanogaster cells (rS2) and BHK-21 cells infected with Semliki Forest Virus carrying RVGP genetic information (SFV-RVGP). We have done a work of standardization of the cell culture samples treatment prior to RVGP quantification by ELISA, and we have developed and standardized a quantitative RT-PCR (qRT-PCR) to quantify the RVGPmRNA. We have also developed a new method of SFV particles titration by qRT-PCR, which is applicable to other constructions of recombinant SFV. We utilized the RVGP expressed by rS2 and SFV-RVGP systems on preliminary in vivo assays. The RVGP samples used to mice immunization were able to induce neutralizing antibodies and to lead to a nice level of protection against the intracerabral rabies virus challenge.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 < pO2 <80%), da glicose (1 < GLC0 < 15g/L) e da glutamina (0.6 < GLN0 < 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-µX), o metabolismo celular (fatores de conversão - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN, YALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO2 reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC0 e GLN0, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram µX,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN0 igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH4+~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH4+~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO2, 10 g/L de GLC0 e 3,5 g/L de GLN0 resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 µg/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC0 afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC0, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores YX/GLC (2,3 vezes) e YX/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) e YNH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de YX/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para YNH4/GLN e 12 vezes para YALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN0, com redução de 3,6 vezes para YX/GLC e incrementos de 70% para YALA/GLC e para YLAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L. / The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 < pO2 < 80%), of initial glucose concentration (1 < GLC0 < 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 < GLN0 < 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - µX), cell metabolism (yield factors - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN and YALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO2 increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased µX,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC0, but improved 100% when GLN0 was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH4+~50 mg/L), as well as cell growth (NH4+~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 µg/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO2, 10 g/L of GLC0 and 3.5 g/L of GLN0 run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC0 changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - YX/GLC (2.3 times) e YX/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) and YNH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of YX/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - YNH4/GLN (7 times) and YALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution YX/GLC and a 70% augmentation for YALA/GLC and YLAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.

Linhagem de células de inseto S2 foram cultivadas em meio TC100 suplementado em reator bubble free de 1.5 L e para estudar o seu crescimento e expressão da glicoproteína G do vírus da raiva (RVGP). Os dados permitiram propor um modelo matemático que reproduz o crescimento e produção da glicoproteína e que considera oito variáveis de estado e vinte parâmetros cinéticos. O modelo considera a velocidade específica de crescimento limitada por glicose, glutamina e glutamato e inibida por NH4+; consumo e formação de glutamina; velocidade específica de morte limitada por NH4+ e inibida por glicose; velocidade específica de produção de NH4+ e de GPV associada ao crescimento e a degradação de GPV. As concentrações de oxigênio dissolvido (pO2), glicose e glutamina foram modificadas para se avaliar a sua influência na velocidade específica de crescimento máxima e nos fatores de conversão. Os parâmetros do modelo foram ajustados usando a técnica de otimização dos poliedros flexíveis e as equações diferenciais do modelo foram integradas pelo método de Gear. / S2 cell strain from Drosophila melanogaster were cultivated in supplemented TC100 media in reactor \"bubble free\" to study their growth and expression of glycoprotein G of rabies virus (RVGP). The data allowed proposing a mathematical model that reproduces the growth and production of glycoprotein and that consider eight state variables and twenty kinetic parameters. The model considers the specific growth rate limited by glucose glutamine and glutamate and inhibited by NH4+ consumption and formation of glutamine, specific death rate limited by NH4+ and inhibited by glucose; production specific rate of NH4+ and RGPV associated with growth and degradation of RGPV. The concentrations of dissolved oxygen (pO2), glucose and glutamine were varied to evaluate their influence on maximum specific growth rate and conversion factors. The model parameters were adjusted using the flexible polyhedron optimization method and the differential equations of the model were integrated by the method of Gear.

Linhagem de células de inseto S2 foram cultivadas em meio TC100 suplementado em reator bubble free de 1.5 L e para estudar o seu crescimento e expressão da glicoproteína G do vírus da raiva (RVGP). Os dados permitiram propor um modelo matemático que reproduz o crescimento e produção da glicoproteína e que considera oito variáveis de estado e vinte parâmetros cinéticos. O modelo considera a velocidade específica de crescimento limitada por glicose, glutamina e glutamato e inibida por NH4+; consumo e formação de glutamina; velocidade específica de morte limitada por NH4+ e inibida por glicose; velocidade específica de produção de NH4+ e de GPV associada ao crescimento e a degradação de GPV. As concentrações de oxigênio dissolvido (pO2), glicose e glutamina foram modificadas para se avaliar a sua influência na velocidade específica de crescimento máxima e nos fatores de conversão. Os parâmetros do modelo foram ajustados usando a técnica de otimização dos poliedros flexíveis e as equações diferenciais do modelo foram integradas pelo método de Gear. / S2 cell strain from Drosophila melanogaster were cultivated in supplemented TC100 media in reactor \"bubble free\" to study their growth and expression of glycoprotein G of rabies virus (RVGP). The data allowed proposing a mathematical model that reproduces the growth and production of glycoprotein and that consider eight state variables and twenty kinetic parameters. The model considers the specific growth rate limited by glucose glutamine and glutamate and inhibited by NH4+ consumption and formation of glutamine, specific death rate limited by NH4+ and inhibited by glucose; production specific rate of NH4+ and RGPV associated with growth and degradation of RGPV. The concentrations of dissolved oxygen (pO2), glucose and glutamine were varied to evaluate their influence on maximum specific growth rate and conversion factors. The model parameters were adjusted using the flexible polyhedron optimization method and the differential equations of the model were integrated by the method of Gear.

Células eucariotas usadas como plataforma de expressão de proteínas recombinantes são geralmente cultivadas com soro fetal bovino (SFB), porém, abordagens biotecnológicas atuais sobre cultura de células devem evitar o uso deste suplemento, devido a problemas de custo, variações entre os lotes e risco de contaminação. Assim, nosso objetivo foi expressar as proteínas recombinantes: GFP (proteína verde fluorescente), NS3 (proteína não estrutural 3 do vírus da hepatite C) e RVGP (glicoproteína do vírus da raiva) em células BHK-21 adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM) usando o sistema de expressão baseado no Semliki Forest Virus (SFV). Os resultados do presente trabalho mostraram que células adaptadas em SFM cresceram de forma eficiente, produziram mais partículas virais recombinantes de SFV do que células suplementadas com soro, sendo que estas partículas virais podem ser usadas diretamente para imunização, pois garantiram uma amplificação e expressão eficiente das diferentes proteínas dentro da célula hospedeira. / Eukaryotic cells are cultured with serum, however current biotechnological approaches of cell culture need to avoid using of this supplement, due to the high costs, lot-to-lot variation and risk of contamination. Thus, our aim was to express the recombinant protein: GFP (green fluorescent protein); NS3 (Hepatitis C virus non-structural protein 3) and RVGP (rabies virus glycoprotein) in BHK-21 cells cultured in serum free culture based on Semliki Forest Virus system. The results of this work showed that cells cultured in serum-free media (SFM) were grown efficiently, they were produce more recombinant viral particles when compared with cells supplemented with SFB. These viral particles can be used directly for immunization, since generated amplification and expression efficient of different proteins within the host cell.

Células eucariotas usadas como plataforma de expressão de proteínas recombinantes são geralmente cultivadas com soro fetal bovino (SFB), porém, abordagens biotecnológicas atuais sobre cultura de células devem evitar o uso deste suplemento, devido a problemas de custo, variações entre os lotes e risco de contaminação. Assim, nosso objetivo foi expressar as proteínas recombinantes: GFP (proteína verde fluorescente), NS3 (proteína não estrutural 3 do vírus da hepatite C) e RVGP (glicoproteína do vírus da raiva) em células BHK-21 adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM) usando o sistema de expressão baseado no Semliki Forest Virus (SFV). Os resultados do presente trabalho mostraram que células adaptadas em SFM cresceram de forma eficiente, produziram mais partículas virais recombinantes de SFV do que células suplementadas com soro, sendo que estas partículas virais podem ser usadas diretamente para imunização, pois garantiram uma amplificação e expressão eficiente das diferentes proteínas dentro da célula hospedeira. / Eukaryotic cells are cultured with serum, however current biotechnological approaches of cell culture need to avoid using of this supplement, due to the high costs, lot-to-lot variation and risk of contamination. Thus, our aim was to express the recombinant protein: GFP (green fluorescent protein); NS3 (Hepatitis C virus non-structural protein 3) and RVGP (rabies virus glycoprotein) in BHK-21 cells cultured in serum free culture based on Semliki Forest Virus system. The results of this work showed that cells cultured in serum-free media (SFM) were grown efficiently, they were produce more recombinant viral particles when compared with cells supplemented with SFB. These viral particles can be used directly for immunization, since generated amplification and expression efficient of different proteins within the host cell.