LRP1 est un récepteur d’endocytose multifonctionnel capable non seulement d’interagir avec de nombreux ligands et de réguler leur endocytose, mais également de moduler certaines voies de signalisation intracellulaire. Ce récepteur se révèle implique dans de nombreux mécanismes physiologiques et pathologiques, comme l’athérosclérose, la maladie d’Alzheimer ou encore le cancer. La multiplicité de ses partenaires fait émerger le concept selon lequel LRP1 est capable de réguler le protéome membranaire et ainsi d’influencer le comportement migratoire de nombreuses cellules. De plus, les résultats récents obtenus au sein de notre laboratoire indiquent que ce récepteur d’endocytose est capable de contrôler la dynamique d’adhérence des cellules tumorales. Nous avons donc cherche à identifier un nouveau partenaire membranaire de LRP1, capable de participer à la régulation de l’adhérence tumorale. Notre étude s’est portée sur le récepteur d’adhérence CD44. L’utilisation de RAP, un antagoniste de LRP1 révèle que ce récepteur d’endocytose module la présence de CD44 à la membrane plasmique. Nous avons également découvert que ces deux récepteurs colocalisent fortement dans la cellule tumorale, que ce soit à la surface cellulaire ou au niveau intracellulaire. De plus LRP1 et CD44 co-immunoprécipitent à partir d’extraits totaux et membranaires, indiquant que ces deux récepteurs sont fortement associés au sein d’un même complexe moléculaire. L’étude de la répartition membranaire du complexe LRP1/CD44 a montré qu’il était en grande partie situé dans les radeaux lipidiques et particulièrement les cavéoles. Toutefois ces structures n’apparaissent pas nécessaires à l’établissement du complexe et ne sont pas impliquées dans les processus d’endocytose relatifs à ces récepteurs. En effet, des expérimentations visant à quantifier l’endocytose de CD44 couplées à différents traitements (β-MCD, conditions hyperosmotiques) révèlent que l’endocytose de ce complexe implique principalement la voie des vésicules tapissées de clathrine. Nous avons également démontré que ce mécanisme dynamique permettait de réguler l’adhérence tumorale. Enfin, des travaux sur le shedding de CD44 ont permis d’identifier les protéases impliquées (MT1MMP, ADAMs 10 et 17) et mettent en évidence un effet protecteur de LRP1 sur le clivage de l’ectodomaine de CD44. / The low-density lipoprotein receptor-related protein-1(LRP-1) is a large endocytic recept or mediating the clearance of various molecules from the extracellular matrix. In the field of cancer, LRP1-metiated endocytosis was first associated to anti-properties. However, recent results suggested that LRP-1 may coordinate the adhesion-deadhesion balance in malignant cells to support tumor progression. Here, we observed that LRP-1-silencing or RAP (receptor-associated protein) treatment led to tumor cell surface accumulation of CD44. Moreover, we evidenced a tight interaction between CD44 and LRP-1, not exclusively localized in lipid rafts. Overexpression of LRP-1-derived mini-receptors indicated that the fourth ligand-binding cluster of LRP-1 is required to bind CD44. CD44 labeling with EEA1 and LAMP-1 showed that internalized CD44 was highly reduced under hyperosmotic conditions but poorly affected by membrane cholesterol depletion, revealing that it proceeds mostly via clathrin-coated pits. Finally, we demonstrated that CD44-silencing abolishes RAP-induced tumor cell attachment, revealing that cell-surface accumulation of CD44 under LRP-1 blockade is mainly responsible for the stimulation for tumor cell adhesion. Altogether, our data shed light on the LRP-1 mediated internalization of CD44 that appeared critical to define the adhesive properties of tumor cells.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le vieillissement s'accompagne d'un déclin de l'immunité, c'est l'immunosénéscence. Les lymphocytes sont des cibles du vieillissement et lors de la stimulation de leur récepteur (TCR) la production d'interleukine-2 est déficiente. Pour expliquer la perte de fonctionnalité des lymphocytes T avec le vieillissement humain, plusieurs hypothèses sont mises en avant dont celle suggérant un défaut de transmission du signal intracellulaire à partir du TCR. Plusieurs études ont démontré que des défauts de signalisation sont effectivement présents dans les voies de signalisation du TCR. La plupart des voies de signalisation sont affectées et il est possible qu'une défaillance en amont puisse toutes les expliquer. Cependant, aucune explication ne pouvait être apportée jusqu'à la découverte de l'existence des radeaux lipidiques membranaires. Ces radeaux lipidiques enrichis en cholestérol et molécules facilitent la signalisation intracellulaire en permettant la formation du signalosome. Ces structures sont initiatrices de la signalisation du TCR. Nous avons émis l'hypothèse que ce sont des défaillances dans les fonctions des radeaux lipidiques qui expliqueraient les altérations en aval de la membrane. Nous avons démontré que les cellules T quiescentes de la personne âgée (+ 65 ans) ont une quantité de cholestérol deux fois plus importante dans les radeaux lipidiques. Ceci s'accompagne d'une diminution de la fluidité. La modulation du contenu en cholestérol par la cyclodextrine permet de contrôler la fluidité membranaire. Cependant, la cyclodextrine a d'autres effets et n'est pas préconisée pour moduler les fonctions des lymphocytes T. De plus, LAT est dans un état de phosphorylation significativement supérieur avec le vieillissement. En ce qui concerne Lck, la molécule est hyper-phosphorylée dans les radeaux lipidiques. Cet état d'activation est relié au phénomène d'Inflamm-Aging. Lors de la stimulation du TCR, le recrutement des molécules de signalisation est diminué par rapport aux sujets jeunes (18-25 ans). La phosphorylation de LAT et Lck est significativement diminuée dans les radeaux lipidiques des lymphocytes CD4[indice supérieur +] activés de personnes âgées. La signalisation issue du CD28 est altérée dans ces cellules (Akt). La mesure de la quantité de CD28 dans les radeaux lipidiques est significativement supérieure dans les cellules CD8 [indice supérieur +] comparativement aux cellules CD4[indice supérieur +]. Les cellules CD8[indice supérieur +] ont un signalosome pré-formé alors que les lymphocytes CD4[indice supérieur +] sont dépendants de la polarisation des radeaux lipidiques. La perte d'expression du CD28 chez les cellules CD8[indice supérieur +] n'a pas de répercussion sur sa signalisation alors que les cellules CD4[indice supérieur +] ont un défaut dans la phosphorylation de Akt malgré l'expression du CD28 inchangée. L'immunosénéscence s'explique en partie par la perte de fonction des radeaux lipidiques dans les cellules CD4[indice supérieur +]. Ces résultats suggèrent que les fonctions des radeaux lipidiques dans les sous-populations lymphocytaires définissent la capacité des cellules à répondre et à s'adapter au milieu environnant.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées. / Macrophages are specialized cells of the immune system which mediate destruction and killing of invading micro-organisms. They do so by engulfing them by a process called phagocytosis. Microbes are then captured in an intracellular compartment, the phagosome, which gradually acquire molecules able to attack and degrade its cargo. Use of proteomics let us demonstrate the presence of flotillin-1 enriched microdomains (also called lipid rafts or membrane rafts) on the phagosomes. Our team demonstrated the crucial importance of these rafts in the phagocytosis process. Indeed, survival of L. donovani correlates with its presence in a ‘raftless’ phagosome while a mutated L. donovani without LPG is rapidly killed in a phagosome containing lipid rafts. To understand the membrane raft destabilisation mechanism mediated the LPG molecule, we induced phagocytosis of parasites devoid of LPG (LPG-) and compared it to the wild type parasite by microscopy. We first demonstrated that LPG alone is necessary to prevent normal maturation of the phagosome. Additionally, we discovered that the LPG molecule not only inhibits lipid rafts formation on the phagosome but also disorganise pre-existing lipid rafts. This effect of LPG is proportional to the number of repetitive sugar units (Gal( 1,4)-Man 1-PO4) which compose this molecule. Our work demonstrated for the first time an important role of the membrane rafts in the phagosome maturation. Moreover, our conclusions will give new interesting leads for clinical studies on leishmaniosis. The second goal of this work was to characterise them with proteomics and lipidomics tools. To do this, we undertook the systematic identification of proteins present on both subdomains of the phagosome (lipid rafts versus the rest of the phagosomal membrane). To achieve this, we purified phagosomes, from which we isolated lipid rafts by floating Triton X-100 insoluble membranes (DRMs for Detergent Insoluble Membranes). After that, we identified proteins by mass spectrometry.

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées. / Macrophages are specialized cells of the immune system which mediate destruction and killing of invading micro-organisms. They do so by engulfing them by a process called phagocytosis. Microbes are then captured in an intracellular compartment, the phagosome, which gradually acquire molecules able to attack and degrade its cargo. Use of proteomics let us demonstrate the presence of flotillin-1 enriched microdomains (also called lipid rafts or membrane rafts) on the phagosomes. Our team demonstrated the crucial importance of these rafts in the phagocytosis process. Indeed, survival of L. donovani correlates with its presence in a ‘raftless’ phagosome while a mutated L. donovani without LPG is rapidly killed in a phagosome containing lipid rafts. To understand the membrane raft destabilisation mechanism mediated the LPG molecule, we induced phagocytosis of parasites devoid of LPG (LPG-) and compared it to the wild type parasite by microscopy. We first demonstrated that LPG alone is necessary to prevent normal maturation of the phagosome. Additionally, we discovered that the LPG molecule not only inhibits lipid rafts formation on the phagosome but also disorganise pre-existing lipid rafts. This effect of LPG is proportional to the number of repetitive sugar units (Gal( 1,4)-Man 1-PO4) which compose this molecule. Our work demonstrated for the first time an important role of the membrane rafts in the phagosome maturation. Moreover, our conclusions will give new interesting leads for clinical studies on leishmaniosis. The second goal of this work was to characterise them with proteomics and lipidomics tools. To do this, we undertook the systematic identification of proteins present on both subdomains of the phagosome (lipid rafts versus the rest of the phagosomal membrane). To achieve this, we purified phagosomes, from which we isolated lipid rafts by floating Triton X-100 insoluble membranes (DRMs for Detergent Insoluble Membranes). After that, we identified proteins by mass spectrometry.

La prise en charge de la douleur est un enjeu médical majeur car il existe toujours des douleurs réfractaires aux traitements antalgiques actuels. La détection de la douleur est assurée par les neurones nociceptifs dont l'excitabilité est majoritairement contrôlée par les canaux sodiques dépendants du potentiel (Nav). Parmi eux, le canal Nav1.9 se distingue par son expression restreinte dans les nocicepteurs et par ses caractéristiques électrophysiologiques qui lui confèrent un rôle particulier dans l'électrogenèse de ces neurones. Au cours de ce travail de thèse nous avons caractérisé le rôle du canal Nav1.9 dans trois modèles de douleurs inflammatoires : aigue, persistant et chronique. Nous avons mis en oeuvre un ensemble de techniques d'analyses comportementales, moléculaires et électrophysiologiques, qui nous ont permis de montrer le rôle du canal Nav1.9 dans ces trois modèles de douleur et de révéler plusieurs mécanismes de régulation potentiels.Par la suite, nous nous sommes attachés à décortiquer l'un de ces mécanismes. Nous avons montré que le canal Nav1.9 est présent dans des microdomaines membranaires riches en cholestérol. Nous avons mis en évidence que l'inflammation diminuait la quantité de cholestérol dans les tissus. Ce mécanisme est à l'origine de douleurs dues à l'activation des canaux Nav1.9 et à leur relocalisation en dehors des radeaux lipidiques. Enfin nos expériences montrent que l'application topique de cholestérol peut réduire les douleurs inflammatoires, ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques. / In mammals, perception of pain is initiated by signaling the occurrence of noxious stimuli through nociceptive neurons located in peripheral sensory ganglia. Nociceptive neurons play a pivotal role in pain perception as they transmit painful information to the central nervous system (CNS). They are largely responsible for the modifications of pain sensation caused by a lesion/inflammation or during the course of chronic diseases like rheumatoid arthritis. Unravelling the precise mechanism of ion channel activation during such pathophysiological conditions is one of the most challenging issues to design new therapeutic pain killer strategies.In this PhD thesis work, we will focus on one particular and promising sodium channel, named Nav1.9. We characterized Nav1.9 channel function in three inflammatory pain models: acute, persistent and chronic, using behavioural, molecular and electrophysiological analysis technics. This work allowed us to point out different putative mechanisms of regulation of this channel.We further decipher the regulation of Nav1.9 by cholesterol lipid in membrane microdomains. We showed that Nav1.9 channel is present in rafts specialized membrane microdomains enriched in cholesterol. We demonstrated that inflammation triggers a decrease in cholesterol level in inflamed territories and that cholesterol deletion induces mechanical allodynia in animals. In addition, we demonstrated that this pain was due to Nav1.9 channel activation and relocalization of this channel out of lipid rafts. Finally our experiments reported that exogenous cholesterol application reduces inflammatory pain. All these results provide a new insight in therapeutic perspectives.

La stimulation de cellules T naïves nécessite du déclenchement de la signalisation par l'intermédiaire du récepteur d'antigène de cellule T (TCR) ainsi que l'activation simultanée des récepteurs de co-stimulation. Toutefois, les cellules T CD8+ naïves peuvent proliférer de façon antigène-indépendants suite à la stimulation synergique par certaines cytokines homéostatiques (IL-7 ou IL-15) et inflammatoires (IL-6 ou IL-21). Ces cellules pré-stimulées prolifèrent même à des faibles concentrations d'antigènes ou en présence d’agonistes du TCR. Ceci leur permet de sécréter des cytokines effectrices, d'être plus spécifiques à leur antigène et d’avoir une activité cytolytique plus importante. Les mécanismes déclenchés par les cellules T CD8+ permettant une sensibilité accrue à l'antigène suite à la "pré-stimulation aux cytokines" n'ont pas encore été élucidés. Nous avons utilisé trois différents modèles de souris transgéniques portant le TCR P14, PMEL ou 8.3-NOD sur les lymphocytes T CD8+ afin d’étudier les mécanismes moléculaires suite à la pré-stimulation aux cytokines. Les cellules T CD8+ portant le TCR transgénique amorcées avec les cytokines, possèdent une augmentation globale des protéines tyrosine-phosphorylés après stimulation du TCR par rapport aux cellules naïves. Cette augmentation de la phosphorylation de la protéine tyrosine a été associée à une augmentation de l'expression de CD8, et a été moins prononcé lorsque CD8 a également été réticulés avec le TCR. Ceci suggère que l'amorçage aux cytokines peut prédisposer le TCR et CD8 à colocaliser, ce qui renforcerait la phosphorylation des chaînes du TCR par la kinase Lck associée à CD8. Les lymphocytes T CD8+ amorcées aux cytokines présentent également des quantités accrues de radeaux lipidiques plasmatiques à la membrane, qui organisent la plate-forme de signalisation du TCR au cours de la stimulation antigénique. L’amorçage aux cytokines des lymphocytes T CD8+ a également augmenté la localisation de CD45, une phosphatase qui diminue l’inhibition automatique de la Lck dans les radeaux lipidiques. Cependant, l'amorçage aux cytokines n'a pas d'incidence sur la capacité des cellules CD8+ T pour former des conjugués avec les cellules présentatrices d'antigène puisées avec des peptides apparentés. En conclusion, ces résultats suggèrent que la composition et les fonctions des radeaux lipidiques peuvent moduler la sensibilité à l'antigène via le TCR lorsque les lymphocytes T CD8+ ont été pré-stimulés aux cytokines.

Conçues à partir d’une approche rationnelle, nous avons créé de nouvelles sondes membranaires permettant l’imagerie de l’organisation de la membrane plasmique cellulaire. Dans ce travail, nous avons d’abord développé un groupe d’outils, à partir du fluorophore solvatochrome Nile Red et de Black Hole Quencher-2, capable de marquer spécifiquement les domaines ordonnés et désordonnés (radeaux) en les identifiant par leur couleur d’émission. Les études cellulaires, à l’aide de ces sondes, suggèrent que la membrane plasmique est composée de deux phases distinctes. Puis dans le but de créer de nouvelles sondes basées sur Nile Red compatibles avec le sérum et fixables par formaldéhyde/glutaraldéhyde, nous avons modifié la sonde, préalablement développée, NR12S avec un groupement PEG ou amino, respectivement. Etonnamment, la sonde PEGylée est rapidement internalisée dans la cellule et le dérivé animo agrège avec l’agent fixant. D’un autre côté,basée sur Nile Red, nous avons conçu une sonde capable de détecter un récepteur donné et de visualiser son environnement lipidique. Initialement, nous avons obtenu des sondes capables d’allumer leur fluorescence en se liant sur le RCPG à l’ocytocine. Puis, nous avons conjugué NR12Spar l’intermédiaire d’un espaceur PEG(12) au ligand de l’intégrine, RGD. Les résultats préliminaires montrent que la molécule peut se lier à la membrane et détecter l’ordre lipidique, cependant les études cellulaires nécessitent un achèvement. Nous avons aussi travaillé sur des sondes membranaires fluorogéniques (turn-on) pour de l’imagerie multi-couleurs. Basées sur le fluorophore3-méthoxychromone, nous avons obtenu des sondes plus brillantes et plus photostables que la sonde développée originellement à partir de 3-hydroxychromone (F2N12S). Grâce à l’important déplacement de Stokes, elles permettent une imagerie de la membrane cellulaire avec une autofluorescence minimale dans la région spectrale bleue, compatible avec les marqueurs communs verts et rouges. Pour finir, basées sur le fluorophore squaraine, nous avons développé trois nouvelles sondes opérant dans la région rouge lointain, qui est particulièrement intéressante pour l’imagerie in vitro et in vivo. Ces sondes montrent une orientation parallèle avec la membrane lipidique, alors que les expériences cellulaires indiquent que seule la sonde avec deux ancres lipidiques est capable de marquer de façon stable la membrane plasmique. Ces sondes développées ici sont prévues pour être utilisées dans la recherche des radeaux lipidiques aussi bien que pour l’imagerie super-résolution et multi-couleurs de cellules vivantes. / Based on rational molecular design, we design new membrane probes that enable fluorescence imaging of cell plasma membrane organization. In this work, we first synthesized a toolkit, based on solvatochromic Nile Red dye and Black Hole Quencher-2, that can stain specifically ordered and disordered lipid domains (rafts) and identify them by the emission color. Cellular studies with these probes suggested that the plasma membrane is composed of two distinct phases. Then,with the idea to make Nile Red-based probes compatible with serum medium and fixable by formaldehyde/glutaraldehyde, we modified previously developed probe NR12S with PEG and aminogroups, respectively. Surprisingly, the PEGylated probe is quickly internalized inside the cell and the amino-derivative aggregates with the fixing agent. On the other hand, based on Nile Red we designed probes capable to detect a given receptor and visualize its lipid environment. Initially, we obtained probes that can turn-on fluorescence on binding to the oxytocin GPCR receptor. Then, we conjugated NR12S through a PEG(12) spacer to the ligand of intergrin, RGD. The first data show that the molecule can bind to the membrane and detect the lipid order, though cellular studies have to be completed. We also worked on fluorogenic (turn-on) membrane probes for multi-color imaging. Based on blue 3-methoxychromone dyes, we obtained probes that are brighter and more photostable than the originally developed probe based on 3-hydroxychromone (F2N12S). Due to large Stocks shift, they enabled cell membrane imaging with minimal auto-fluorescence in the blue spectral region, compatible with common green and red probes. At the end, based on squaraine fluorophore, we developed three new probes operating in the far red region, which is also very interesting for in vitro and in vivo imaging. These dyes show a parallel orientation with the lipid membrane, while the cellular experiments point out that only the probe with two anchor groups is able to stain stably the plasma membrane. The probes developed here are expected to be used for lipid rafts research as well as for super-resolution and multi-color imaging of living cells.

Les plaquettes sont des cellules sanguines anucléées impliquées dans les phénomènes d'hémostase et de thrombose. La majorité des fonctions plaquettaires dépend de leur membrane cellulaire, qui contient de nombreux microdomaines lipidiques ordonnés appelés radeaux lipidiques. Ces microdomaines jouent un rôle central dans toutes les phases de l'hémostase médiées par les plaquettes. Les radeaux lipidiques sont essentiels pour le fonctionnement des récepteurs responsables de l'activation des plaquettes et de la transduction du signal. Le rôle des plaquettes dans la thrombose artérielle est crucial et explique l'intérêt continu de la recherche dans la thérapie antiplaquettaire. Dans ce contexte, nous avons cherché à étudier les radeaux lipidiques comme lieu d'assemblage principal des récepteurs membranaires. Nous avons également cherché à identifier des protéines impliquées dans la fonction des plaquettes, en vue de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons utilisé des analyses lipidomiques et protéomiques ainsi que des analyses d'immunoblotting pour identifier les radeaux lipidiques de la membrane des plaquettes et étudier leur organisation dans les plaquettes non stimulées, stimulées et traitées par des antiagrégants plaquettaires. Des détergents, l'ultracentrifugation et les gradients de sucrase ont été utilisés principalement pour le fractionnement de la membrane et l'isolement des radeaux lipidiques. Les principaux résultats de notre travail sont: 1) Élaboration d'une méthodologie pour l'étude des radeaux lipidiques des plaquettes ; 2) Présentation d'un profil global de la composition lipidique et protéique des radeaux lipidiques ; 3) Démonstration de l'impact de l'activation plaquettaire et des antiagrégants plaquettaires sur la réorganisation des radeaux lipidiques ; Et 4) Proposition de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles par protéomique et identification de réseau interactif de protéines autour notamment du facteur XIII (FXIII) et de la phosphoprotéine stimulée par vasodilatateur (V ASP). Nos résultats montrent que les radeaux lipidiques peuvent potentiellement être considérés comme nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de nouveaux antiagrégants plaquettaires. Les études "Omics" sont importantes pour élargir nos connaissances dans ce domaine / Latelets are blood ce lis at the crossroads of both haemostasis and thrombosis. The majority of platelet functions depend on their membrane, which contains numerous, ordered lipid microdomains named lipid rafts. These microdomains play a pivotai role in all phases of platelet­mediated haemostasis. Lipid rafts are a prerequisite for the functioning of receptors in charge of platelet activation and signal transduction. The role of platelets in thrombotic diseases is crucial, and underpins the continue research interest in antiplatelet therapy. ln this context, we aimed to study the lipid rafts of platelet membranes as the principal assembly place of known receptors, and likely also other, unknown elements that participate in the thrombotic function of platelets, with a view to proposing new therapeutic targets. We used lipidomics and proteomics as well as immunoblot analysis to identify lipid rafts and investigate the organization of lipid rafts in resting, stimulated and antiplatelet-treated platelets. Detergents, ultracentrifugation and sucrose gradients were used mainly for membrane fractionatio and isolation of lipid rafts. The main findings of our work are: 1) Development of a framework or guidelines for platelet lipid raft investigation; 2) Presentation of a global profile of the lipid and protein composition of plate let lipid rafts; 3) Demonstration of the impact of activators and inhibitors on the reorganization of platelet lipid rafts; and 4) Suggestion for potential new therapeutic targets by proteomics analysis through interactive network analyzing of coagulation factor XIII (FXIII) and Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (VASP). Our results show that lipid rafts have potential as new therapeutic targets in pharmacological research in antiplatelets. "Omics" studies are important to expand our knowledge in this field