Techn. Hochsch., Diss., 2002--Aachen.

Ratten sind in urbanen Räumen allgegenwärtig. Sie leben hier zumeist im Untergrund oder doch gut verborgen vor menschlichem Blick. Von hier aus gestalten sie ohne bewusstes menschliches Zutun oder gar Akzeptanz bereits seit Jahrhunderten Stadträume eifrig mit. Dies Zusammenspiel von Ratten und Menschen wird in der vorliegenden Studie ausgehend von der unterfränkischen Stadt Würzburg untersucht. Die Autorin fragt nach Aushandlungsprozessen innerhalb alltäglicher Begegnungen von Menschen und Ratten, den damit verbundenen historischen Bezügen, Kontinuitäten und Brüchen sowie nach den hier wirksamen Narrationen. Mit den Multispecies Studies werden dabei Ratten als wirk- und handlungsmächtige Akteur*innen gesehen, die durch ihre Agency unter anderem Missstände in menschlichen Gesellschaften offenbaren. / Rats are omnipresent in urban areas. They live mostly underground or well hidden from human view. From here, they have been busily shaping urban spaces for centuries without conscious human intervention or acceptance. This study examines the interaction between rats and humans. The author deals with negotiation processes within everyday encounters between humans and rats, historical references, continuities and ruptures associated with them, as well as the narratives that are effective here. With Multispecies Studies, rats are seen as actors with the power to act, who reveal deficiencies in human societies through their agency.

Nach dem heutigen Wissenstand wird die Hämoxygenase-1 unter pathologischen Bedingunge der Niere, z.B. Ischämie, expremiert. Man nimmt an, dass die Hämoxygenase-1 eine Schutzfunktion für die Niere besitzt. Um dies zu bestätigen, führten wir eine tierexperimentelle Arbeit mit Ratten (n=101) durch in der wir durch Clamping der Nierenarterie ein reproduzierbares akutes ischämisches Nierenversagen induzierten. Bei einem Teil der Tiere wurde anschließend die Hämoxygenase durch injektion von SnMP gehemmt. Die Ratten wurden in 5 Gruppen randomisiert (Tag-0, Clamping+SnMP, Clamping+NaCl, Sham+SnMP, Sham+NaCl). In der Inulin/PAH-Clearance zeigte sich am ersten postoperativen Tag eine signifikante Verschlechterung bei den Clamping+SnMP-Tieren im Vergleich zu den Clamping+NaCl-Tieren. Die Ergebnisse wurden durch die erhöhten Retentionswerte und die erniedrigte PAH-Nettosekretion der Clamping+SnMP-Tiere unterstüzt. Die Gabe von SnMP hatte auf die nicht geclampte Niere bei den Sham-Tieren keinen Einfluss auf die Nierenfunktion. Dies zeigt, dass die Hämoxygenase-1 eine Schutzfunktion der Niere darstellt. / In pathologic situation like ischemia, it is standard of knowledge, that there is an exprimation of heme oxygenase-1 in the kidney. In studies, it is assumed, that heme oxygenase-1 has a protective function on the kidney. To validate this hypothesis we did an animal testet research in rats (n=101). We induced a reproducible acute ischemic renal failure with clampin of the renal arteries. In some of the rats we gave SnMP after the clamping to inhibit the function of heme oxygenase. The rats were randomized in 5 groups (day-0, Clamping+SnMP, Clamping+NaCl, Sham+SnMP, Sham+NaCl). On the first postoperative day we could messure a significant decline of the Inulin/PAH-Clearance in Clamping+SnMP-rats in comparison with Clamping+NaCl-rats. Parallel there was an elevation of urea/cratinine and a declined PAH-net-secretion in Clamping+SnMP-rats. The injection of SnMP in non-clamping-rats in the sham group had no effect on renal function. This study proofs that hame oxygenase-1 has a protective function in ischemic renal failure

Summary: In the present work, two important negative regulators of T cell responses in rats were examined. At the molecular level, rat CTLA-4, a receptor important for deactivating T cell responses, was examined for the expression pattern and in vitro functions. For this purpose, anti-rat CTLA-4 mAbs were generated. Consistent with the studies in mice and humans, rat CTLA-4 was detectable only in CD25+CD4+ regulatory T cells in unstimulated rats, and was upregulated in all activated T cells. Cross-linking rat CTLA-4 led to the deactivation of anti-TCR- and anti-CD28 stimulated (costimulation) T cell responses such as reduction in activation marker expression, proliferation, and cytokine IL-2 production. Although T cells stimulated with the superagonistic anti-CD28 antibody alone without TCR engagement also increased their CTLA-4 expression, a delayed kinetics of CTLA-4 upregulation was found in cells stimulated in this way. The physiological relevance of this finding needs further investigation. At the cellular level, rat CD25+CD4+ regulatory T cells were examined here in detail. Using rat anti-CTLA-4 mAbs, the phenotype of CD25+CD4+ regulatory T cells was investigated. Identical to the mouse and human Treg phenotype, rat CD25+CD4+ T cells constitutively expressed CTLA-4, were predominantly CD45RC low, and expressed high level of CD62L (L-selectin). CD25+CD4+ cells proliferated poorly and were unable to produce IL-2 upon engagement of the TCR and CD28. Furthermore, rat CD25+CD4+ cells produced high amounts of anti-inflammatory cytokine IL-10 upon stimulation. Importantly, freshly isolated CD25+CD4+ T cells from naïve rats exhibited suppressor activities in the in vitro suppressor assays. In vitro, CD25+CD4+ regulatory T cells proliferated vigorously upon superagonistic anti-CD28 stimulation and became very potent suppressor cells. In vivo, a single injection of CD28 superagonist into rats induced transient accumulation and activation of CD25+CD4+ regulatory T cells. These findings suggest firstly that efficient expansion of CD25+CD4+ cells without losing their suppressive effects (even enhance their suppressive activities) can be achieved with the superagonistic anti- CD28 antibody in vitro. Secondly, the induction of disproportional expansion of CD25+CD4+ cells by a single injection of superagonistic anti-CD28 antibody in vivo implies that superagonistic anti-CD28 antibody may be a promising candidate in treating autoimmune diseases by causing a transient increase of activated CD25+CD4+ T cells and thus tipping ongoing autoimmune responses toward selftolerance. / Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurden zwei wichtige negative Regulatoren von T Zellantworten in der Ratte untersucht. Auf molekularer Ebene wurde Ratten-CTLA-4, ein für die Deaktivierung von T-Zellimmunantworten wichtiger Rezeptor, hinsichtlich seines Expressionsmusters und seiner in vitro Funktionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen Ratten-CTLA-4 erzeugt. In Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen in Mensch und Maus war CTLA-4 konstitutiv nur in CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen exprimiert, nach Stimulierung war es in allen aktivierten T-Zellen nachweisbar. Kreuzvernetzung von CTLA-4 führte zur Inhibition von mit anti-TCR- und anti-CD28-Antikörpern stimulierten (Kostimulation) TZellantworten, insbesondere zur Verminderung der Expression von Aktivierungsmarkern, der Proliferation und der Produktion von IL-2. Obwohl T-Zellen mit superagonistischem Anti-CD28-Antikörper ohne T-Zellrezeptor stimulation ihre CTLA-4-Expression ebenfalls steigerten, wurde eine verzögerte Kinetik für die Hochregulation von CTLA-4 in diesen Zellen festgestellt. Die physiologische Bedeutung dieses Befundes bedarf noch weiterer Untersuchungen. Auf zellulärer Ebene wurden CD25+CD4+ regulatorische T-Zellen detailliert analysiert. Der Phänotyp CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen wurde charakterisiert. Wie in Mensch und Maus exprimierten die regulatorischen T-Zellen der Ratte konstitutiv CTLA-4, in größerem Umfang CD62L (L-Selectin), aber nur wenig CD45RC. CD25+CD4+ Zellen proliferierten nach Stimulation von CD28 und T-Zellrezeptor nur schwach und produzierten kein IL-2, im Gegensatz dazu aber große Mengen an IL-10. Hervorzuheben ist, dass für frisch isolierte CD25+CD4+ T-Zellen aus naiven Ratten Suppressoraktivität durch in vitro-Suppressionsassays nachgewiesen werden konnte. In vitro proliferierten CD25+CD4+ regulatorische T-Zellen nach superagonistischer anti-CD28-Stimulation äußerst stark und wurden zu potenten Suppressorzellen. Eine einzelne Injektion von superagonistischem Anti-CD28-Antikörper resultierte in einer transienten Akkumulation von CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen in vivo und induzierte deren Aktivierung. Diese Ergebnisse weisen zum einen darauf hin, dass eine effiziente Expansion von CD25+CD4+ Zellen ohne Verlust ihrer supprimierenden Effekte durch superagonistischen Anti-CD28-Antikörper in vitro erzielt werden kann. Zum anderen läßt die Induktion einer disproportionalen Expansion von CD25+CD4+ Zellen durch eine einzige Injektion des CD28-Superagonisten den Schluss zu, dass dieser Antikörper ein vielversprechender Kandidat zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten sein könnte, der über eine transiente Zunahme von aktivierten CD25+CD4+ T-Zellen eine bestehende Autoimmunantwort hin zur Selbsttoleranz lenkt.

Zusammenfassung NKT Zellen wurden ursprünglich über die gleichzeitige Expresion eines T-Zellantigenrezeptors (TZR) und den NK-Zellmarkern NKRP1A im Menschen bzw. NK1.1. (NKRP1C) in der Maus definiert. In Mensch und Maus exprimieren die meisten NKT Zellen CD1d restringierte TZR mit charakteristischen Genumlagerungen- Va24JaQ/Vb11 im Menschen und Va14Ja18/Vb8.2 in der Maus. Den NKT Zellen werden außerdem wichtige Funktionen in der „first line defence“ und der Immunregulation zugesprochen. Gegenstand der Doktorarbeit war die Charakterisierung eines hypothetischen Gegenstückes in der Ratte. In der Maus wurden rund 30% der intrahepatischen Lymphozyten (IHL) und 3% der Milzlymphozyten als CD1d restringierte NK T Zellen identifiziert und konnten mittels a-GalCer beladenen Maus-CD1d Tetramer visualisiert werden. Wie in der Maus wurden in der Ratte NKRP1A+TZR+ Zellen vorwiegend in der Leber gefunden, waren aber fünfmal weniger häufig. F344 Ratten NKT Zellen waren darüber hinaus im Gegensatz zu den CD4+ oder CD4-CD8- Maus NKT Zellen meistens CD8 positiv und banden kein mCD1d Tetramer. Da in der menschlichen Leber CD1d-restringierte Va24JQ+ T Zellen ebenfalls viel seltener als in der Maus sind, scheint es nun möglich, daß der Phänotyp der Ratten NKT Zellen eher dem des Menschen als dem der Maus entspricht. Ein Test der Fähigkeit von F344 Leber- und Milzlymphozyten nach Kultur mit a-GalCer Cytokine zu produzieren, ergab ähnlich wie in der Maus eine Produktion von IL-4 und IFN-g;. Aus diesem Grund kann eine fehlende Reaktivität von Ratten NKT Zellen für a-GalCer nicht der Grund für eine fehlende mCD1d Tetramerbindung sein. Um die Reaktivität der NKRP1A+TZR+ Rattenzellen auf a-GalCer besser zu verstehen, wurde der Ratten TZR analysiert. RT-PCR von Leberlymphozyten mit Va14-spezifischen Primern und die Analyse der klonierten PCR Produkte ergab ein viel schwächeres Signal für Ratten als für Maus cDNA. Darüber hinaus zeigten Sequenzanalysen, daß das Va14 auch mit anderen J als dem für TCRinv typischem Ja18 rearrangiert war. Die niedrige Anzahl von Va14Ja18 „in frame“ Umlagerungen legt Nahe, daß nur ein kleiner Anteil der Leber-lymphozyten CD1d restringierte NKT Zellen sind. Maus und humane NKT Zellen erkennen durch CD1d-b2m Komplexe präsentiertes a-GalCer und reagieren mit Aktivierung, Proliferation und Cytokinproduktion. Um die Fähigkeit von Maus und Ratten-CD1d a-GalCer zu präsentieren, zu testen, wurde das CD1d Molekül der Ratte kloniert. Sequenzanlyse und funktionelle Tests bestätigten die strukturelle und funktionelle Homologie des CD1d beider Spezies. Gleichzeitig wurde zur Analyse der Reaktivität von NKRP1A+TZR+ Zellen auf a-GalCer ein Ratten Va14+ invarianter TZR kloniert und in einem TZR- T-Zellhybridom (BWr/mCD28) exprimiert. Zellen die transgenen Ratten Va14+TZR und CD28 exprimierten, sezernierten IL-2 nach Stimulation mit aTZR/CD3 Antikörper aber zeigten keine Spezifität für a-GalCer. Die fehlende Reaktivität für a-GalCer und die fehlende Bindung von mCD1-a-GalCer Tetramer waren wahrscheinlich durch Aminosäuresubstitionen insbesondere an Position 71 (51 nach IMGT Nomenklatur) der klonierten TZRa Kette begründet. Eine „Umkehrung“ dieser Änderung wurde mittels molekularbiologischer Techniken durchgeführt aber Expression dieses TZR auf BWr/mCD28 wurde nicht erreicht. Im Gegensatz zum invarianten Va14+ Ratten TZR war der Maus Va14+ TZR voll funktional und spezifisch für mCD1d Tetramer. KT12 Hybridom und Maus TZRinv exprimierende BWr/mCD28 Zellen wurden sowohl durch Ratten als durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer aktiviert. Dasselbe galt für TZR, die eine Maus Va14 TZR Kette und eine Ratten Vb8.4 TZR Kette enthielten. Im Gegensatz hierzu antworteten Linien mit mVa14 und Ratten Vb8.2 nur auf durch Ratten und nicht auf durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer und banden nahezu kein mCD1d Tetramer. Dies legt Nahe, daß Keimbahn kodierte der b-Kettenbereiche (CDR2 oder CDR4) speziesspezifische Bereiche des CD1d erkennen. Weiterhin wurde gefunden, das die Zytokinsekretion der Zellinien durch CD80 spezifische monoklonale Antikörper inhibiert wurde, was eine wichtige Rolle der CD80-CD28 Interaktion bei der Aktivierung dieser Zellen nahelegt. Um zu sehen ob NKT Zellen auch in anderen Rattenstämmen als F344 existieren, wurde Häufigkeit und Funktion von NKRP1A+TZR+ Zellen in F344 und LEW Ratten miteinander verglichen. F344 und LEW, zwei Rattenstämme die unterschiedliche CD1d Allele tragen, zeigten in der Analyse mit einem neu generierten rCD1d spezifischen monoklonalen Antikörper nur geringe Unterschiede in der Expressionsstärke. Hingegen, unterschieden sich beide Stämme in der Reaktivität für a-GalCer. NKRP1A+ Zellen waren in der LEW Ratte weniger häufig als in der F344 Ratte und antworteten in vitro nicht auf a-GalCer oder sein Analogon OCH. Ein Resultat, das insbesodere angesichts der besonderen Empfänglichkeit von LEW Ratten für experimentell induzierte organspezifische Autoimmunerkrankungen von besonderem Interesse ist. Zusammgefasst kann gesagt werden, daß das Maus und Ratten CD1d/TZRinv NKT Zellsystem hohe strukturelle und funktionale Homologie aufweist, aber daß es wie im Menschen weniger invariante NKT Zellen in der Ratte als in der Maus gibt. TZR transgene Zelllinien wiesen ein speziesspezifisches Muster in der a-GalCer Erkennung auf, das für die Analyse von CDd/TZR-Kontaktbereichen von großem Nutzen sein wird. Dasselbe gilt für den Ratten und Maus-CD1d-spezifischen monoklonalen Antikörper, der im Rahmen der Studie generiert wurde. Dieser kann bei der Charakterisierung der CD1d Proteinexpression in verschiedenen Geweben und der besseren funktionellen Charakterisierung von CD1d restringierten T Zellen der Ratte eingesetzt werden. / Summary: Originally, NKT cells have been defined by their expression of T-cell receptor (TCR) and NK cell markers NKRP1A in human and NK1.1 (NKRP1C) in mouse. Most of these cells express CD1d-restricted TCR with a characteristic rearrangement- Va24JaQ/Vb11 in human and Va14Ja18/Vb8.2 in mouse, and have been implicated in playing an important role in first line defence and immunoregulation. The subject of this thesis was the characterisation of the hypothetical rat NKT cell population. In the mouse system, CD1d-restricted NK1.1+ T cells represented around 30% of intrahepatic and around 3% of splenic lymphocytes and could be visualised by staining with a-GalCer-loaded mouse CD1d tetramer. Rat NKRP1A+TCR+ cells, similar to mouse NKT cells, were predominantly expressed in the liver. However, their frequency was around 5 fold lower than the frequency of mouse intrahepatic lymphocytes. F344 rat NKT cells, in contrast to mouse CD4+ or DN NK1.1+ T lymphocytes, were of CD8 rather than CD4 phenotype, and did not bind to mCD1d-a-GalCer-tetramer. Since human hepatic CD1d-restricted Va24JQ+ T cells are not as frequent as their mouse counterparts and may express CD8- a marker not expressed by mouse CD1d-restricted cells, it is possible that the phenotype of F344 rat NKT cells corresponds more to the phenotype of human than mouse NKT cells. Similar to mouse NKT cells, F344 rat liver- and spleen-derived lymphocytes were able to produce IL-4 and IFN-g; when stimulated with the synthetic ligand a-GalCer in vitro. Therefore, the lack of binding of rat lymphocytes to mouse CD1d tetramer could not be due to their inability to respond to a-GalCer. To better characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, the rat invariant TCR was analysed. RT-PCR of liver lymphocytes with Va14-specific primers and subsequent cloning revealed a much weaker PCR signal for rat lymphocyte cDNA than for mouse cDNA. Furthermore the analysis of rat AV14JA18 sequences showed that the rat Va14+TCR invariant could be rearranged not only with AJ18 but also with other AJ segments. The low number of clones with in frame Va14Ja18 rearrangement could suggest that only a small proportion of liver lymphocytes were CD1d restricted NKT cells. Mouse and human NKT cells are able to recognise a-GalCer presented by the CD1d-b2 microglobulin complex, leading to their activation, proliferation and cytokine secretion. In order to compare the capacity of mouse and rat CD1d to present a-GalCer, rat CD1d was cloned. Sequence analysis and functional tests in vitro confirmed the structural and functional homology of rat CD1d with mouse CD1d. In parallel, to characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, rat Va14+TCR invariant was cloned and expressed in the TCR- T cell hybridoma BWr/mCD28. Rat Va14TCR+CD28+ transgenic cells secreted IL-2 upon aTCR/CD3 antibody stimulation, but were not specific for a-GalCer. Such cells were also negative in staining with mCD1d-a-GalCer tetramer. The lack of reactivity to a-GalCer and the lack of binding to mouse tetramer were probably caused by amino acid alterations, particularly at position 72 (51 according to IMTG nomenclature) of cloned rat TCRinv. Reversal of these “alterations” using molecular biology techniques was performed but the expression of this TCR on the surface of BWr/mCD28 cells could not be achieved. In contrast to rat TCRinv, mouse Va14+TCR was fully functional and was specific for mouse CD1d tetramer. KT12 hybridoma and BWr/mCD28 cells expressing mouse TCRinv, when stimulated with a-GalCer presented by primary CD1d+ cells or rCD1d transgenic cell lines, produced IL-2 in an Ag- and CD1d-dependent manner. Transgenic lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.4 responded to a-GalCer presented by rat and mouse CD1d, and bound mCD1 tetramer. By contrast, cell lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.2 responded only to a-GalCer presented by rCD1d and bound weakly to mCD1d tetramer. This suggests that germ line encoded regions of the b-chain (CDR2 or CDR4) bind to species-specific determinants of CD1d. The cytokine secretion of the cell lines was inhibited by anti-CD80 mAb, indicating the importance of CD80-CD28 costimulation in their activation. To check whether rat NKT cells may exist in other rat strains, the frequency and functions of NKRP1A+TCR+ in F344 and LEW rat were compared. F344 and LEW, two rat strains expressing different allelic CD1d forms, varied slightly in the level of CD1d expression, as assessed by staining with a newly generated CD1d specific monoclonal antibody. By contrast, these rat strains differed in terms of a-GalCer recognition. NKRP1A+TCR+ cells were less frequent in LEW than in F344 rats, and did not respond to a-GalCer or the analogue OCH in vitro, a result which is of special interest considering the susceptibility of LEW but not F344 rats to experimentally induced organ specific autoimmune diseases. In summary, the rat and mouse CD1d-invariant TCR systems show a high degree of structural and functional homology, but it seems that invariant NKT cells in rat, similar to such cells in human, occur at lower frequency than in mice. TCR transgenic cell line species-specific patterns of CD1d a-GalCer reactivity will provide a valuable tool for the mapping of CD1d/TCR contacts. Also monoclonal antibodies specific for rat and mouse CD1d, generated in this study, provide valuable tools to determine CD1d protein expression in various rat tissues and will help to better characterise functions of CD1d-restricted rat T cells.

Die EAE ist eine Autoimmunerkrankung im Modell der Ratte. Sie ist eine inflammatorische , hauptsächlich durch CD4+ T-Zellen vermittelte Erkrankung des ZNS. In der Arbeit wurde die Interaktion von MHC, Peptid und TCR, welche typisch für diese Erkrankung sind, näher charakterisiert. / The EAE is an autoimmun desease in the model of the rat. It is characterized by inflammation of the CNS, mediated mainly by CD4+ T-cells. This work characterizes further the relevant interaction of MHC, peptid and TCR, typical found in the EAE.

Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann. / Somatostatin is a regulatory peptid, which affects a multiplicity of biological processes within the body. The effects of Somatostatin are mediated by a family of five G-protein-coupled receptors, which act on several downstream signaltransduction pathways either in a G-protein-dependent way or probably in a G-protein-independent manner via intracellular interacting proteins. The somatostatin receptor subtype 4 (SSTR4) is mainly expressed in brain, where it inhibits the excitatory neurotransmission. In addition, excitatory effects of SSTR4 have also been published. In order to examine the subtype specific signalling of SSTR4, I tried to identify intracellular proteins which interact directly with the SSTR4 and affect its physiological effects. Using the yeast two-hybrid system I identified three possible interaction partners for SSTR4, which were however classified as non-specific in subsequent experiments. In a second approach two proteins which interact with SSTR4 could be identified by affinity-chromatography. Both proteins PSD-95 and PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa and 93kDa) were precipitated specifically with an immobilized peptid that contains the nine C-terminal amino acids of SSTR4. The interaction of the SSTR4 with PSD-95 was further characterized. In a binding experiment with recombinant proteins I could show that the interaction is mediated by the 1st and 2nd PDZ-domain of PSD-95. In human embryonic kidney cells (HEK293) which stably express SSTR4, PSD-95 could be coprecipitated with the receptor. After coexpression of PSD-95 and SSTR4 both proteins are partially colocalized at the plasma membrane. The majority of the PSD-95 however shows a diffuse cytoplasmic distribution. The in vivo interaction was proven by immunohistochemistry on cultivated hippocampal neurons and by coimmunoprecipitation of both proteins from rat brain lysates. The interaction of PSD-95 with SSTR4 affected neither the agonist induced internalisation of the receptor in HEK293 cells, nor the coupling of the receptor to a G-protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel in oocytes obtained from the african clawed frog Xenopus laevis. By the interaction with PSD-95, SSTR4 is brought into physical proximity to certain target proteins which mediate the effects of somatostatin. Thus the interaction probably allows an integration of SSTR4 into the postsynaptic complex of PSD-95 and glutamergic receptors, where SSTR4 could regulate the glutamat-mediated excitatory signaltransduction.

Die Alzheimer’sche Erkrankung ist eine neurodegenerative Erkrankung des Gehirns. Um geeignete Medikamente für die Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung zu finden, werden experimentelle Modellsysteme zur Erforschung von Substanzkandidaten verwendet. Ein solches experimentelles System ist die hippocampale Langzeitpotenzierung (LTP), welche ein anerkanntes in vitro Modell für die Erforschung der zugrundeliegenden zellulären Prozesse der Gedächtnisbildung ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung und Validierung von LTP in hippocampalen Hirnschnitten der Ratte um gedächtnissteigernde Substanzen zur potentiellen Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung zu charakterisieren. Dazu wurde zunächst ein Messsystem zur parallelen Charakterisierung mehrerer Schnitte aufgebaut, das Messungen bis zu sieben Stunden erlaubt (Kapitel 2). Dann wurden unterschiedliche Protokolle etabliert um Früh- und Spätphasen-LTP zu generieren. Dabei würde Frühphasen-LTP konzeptionell eher mit dem Kurzzeitgedächtnis einhergehen, während Spätphasen-LTP dem Langzeitgedächtnis gleichkommen würde (Kapitel 3). Da in Alzheimer-Patienten hauptsächlich ein Defizit cholinerger und glutamaterger Neurone vorliegt, wurden die validierten LTP Formen benutzt, um solche Substanzen zu analysieren, die potentiell cholinerge und/oder glutamaterge neuronale Funktion erhöhen. Die Effekte zweier ausschließlich cholinerge Funktion erhöhender Substanzen wurden analysiert: Der α4β2 nicotinische Acetylcholin-Rezeptor Agonist TC-1827 (Kapitel 4) und der Acetylcholinesterase-Inhibitor Donepezil (Kapitel 5). Beide Substanzen erhöhten Frühphasen-LTP, aber hatten keinen Effekt auf Spätphasen-LTP. Desweiteren wurden zwei Substanzen getestet, die ausschließlich mit glutamaterger Funktion interferieren: Der metabotrope Glutamatrezeptor 5 positiv allosterische Modulator ADX-47273 (Kapitel 3) und der Phosphodiesterase (PDE) 9A-Inhibitor BAY 73-6691 (Kapitel 5). ADX-47273 erhöhte Spätphasen-LTP, aber hatte keinen Effekt auf Frühphasen-LTP, wohingegen BAY 73-6691 eine erhöhende Wirkung auf beide LTP Formen aufwies und sogar Früh- in Spätphasen-LTP umwandelte. Die gleichen Effekte, wie bei dem PDE9A-Inhibitor, konnten auch mit dem partiellen α7 nicotinische Acetylcholin-Rezeptor Agonisten SSR180711 (Kapitel 4) demonstriert werden. SSR180711 wirkt sowohl auf cholinerge, als auch auf glutamaterge neuronale Funktion. Dann wurde die Fähigkeit der Substanzen überprüft, durch lösliche Aβ Oligomere verschlechtertes LTP zu verbessern (Kapitel 6). Lösliche Aβ Oligomere, auch als amyloid-β derived diffusible ligands (ADDLs) bezeichnet, werden zurzeit als eine mutmaßliche Ursache der Alzheimer’schen Erkrankung angesehen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass ADDLs Früh- und Spätphasen-LTP in verschiedenem Ausmaß vermindern. Donepezil und TC-1827 konnten die durch ADDLs induzierten Defizite bei Frühphasen-LTP geringfügig wiederherstellen, aber sie hatten keinen Einfluss auf das durch ADDLs verschlechterte Spätphasen-LTP. Im Gegensatz dazu, konnten sowohl SSR180711 als auch BAY 73-6691 ein durch ADDLs verschlechtertes Früh- und Spätphasen-LTP komplett wiederherstellen. ADX-47273 hatte keinen positiven Effekt auf Frühphasen-LTP, welches durch ADDLs verschlechtert worden war, konnte aber ein durch ADDLs verschlechtertes Spätphasen-LTP teilweise wiederherstellen. Somit wurde der vorherige Befund der Arbeit bestätigt: Substanzen, welche die glutamaterge Funktion verbessern, scheinen nicht nur wirksamer im Bezug auf LTP-Erhöhung zu sein als Substanzen die ausschließlich cholinerge Funktion erhöhen, sondern sie sind auch in der Lage, durch lösliche Aβ Oligomere verursachte Defizite bei LTP zu verbessern. Aus einem präklinischen Blickwinkel und basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit weisen demnach Substanzen, die glutamaterge Funktionen verbessern, ein hohes therapeutisches Potential als alternative Ansätze bezüglich kognitiver Defizite auf. Möglicherweise könnten sie sogar wirksamere Ansätze für die symptomatische Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung darstellen, als derzeitige Behandlungen, die ausschließlich cholinerge Funktion verbessern. / Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease of the brain. Today AD is the most common form of dementia in elderly people. It is clinically characterized by a progressive loss of memory and later on a decline in higher cognitive functions. The pathological hallmarks of AD, consistently demonstrated in brain tissue of patients, are extracellular amyloid-β (Aβ plaques, intracellular neurofibrillary tangles of tau protein and a profound loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses and ultimatively neurons. Estimates foresee that more than 80 million individuals will be affected by the disease by 2040 due to population aging worldwide underlining the high medical need for this disease. In order to find suitable drugs for the treatment of AD, experimental model systems are utilized to explore potential drug candidates. Such an experimental system is hippocampal long-term potentiation (LTP), which is widely accepted as an in vitro model of cellular processes fundamentally involved in memory formation. The present thesis focuses on the establishment and validation of LTP in rat hippocampal slices to characterize memory enhancing drugs as a potential treatment of AD. First, a multi-slice recording system was set up enabling stable measurements of LTP for up to seven hours from several slices simultaneously (chapter 2). Then, distinct protocols to induce early and late CA1 LTP, resembling short-term and long-term memory, were established. They were validated by addressing the hallmarks accepted for these forms of LTP: protein-synthesis independence and NMDA receptor dependence without contribution of L-VDCCs for early LTP, as opposed to protein-synthesis and NMDA / L-VDCCs dependence for late LTP (chapter 3). As in AD patients a loss of mainly cholinergic and glutamatergic synapses is obvious, these validated forms of LTP were used to study drugs potentially being able to enhance cholinergic and/or glutamatergic neuronal functions. The effects of two drugs exclusively interfering with cholinergic function on LTP were tested: the α4β2 nicotinic acetylcholinergic receptor agonist TC-1827 (chapter 4) and the acetylcholine esterase inhibitor donepezil (chapter 5). Both drugs were found to increase early LTP, but to not affect late LTP. Furthermore, two drugs exclusively interfering with glutamatergic function were analyzed: the metabotropic glutamate 5 receptor postive allosteric modulator ADX-47273 (chapter 3) and the phosphodiesterase (PDE) 9A inhibitor BAY 73-6691 (chapter 5). ADX-47273 increased late LTP, but had no effect on early LTP, whereas BAY 73-6691 showed enhancing effects on both early and late LTP and even transformed early into late LTP. The same effects like for the PDE9A inhibitor were observed for the α7 nicotinic acetylcholinergic receptor partial agonist SSR180711 (chapter 4), which interferes with both, cholinergic and glutamatergic function. Thus, drugs facilitating glutamatergic function or both glutamatergic and cholinergic function seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function. To evaluate whether this finding also proves true for experimental circumstances mimicking decreased cognitive function together with pathophysiology in AD patients, the ability of the drugs to ameliorate LTP impaired by soluble Aβ oligomer was analyzed (chapter 6). Soluble Aβ oligomers, also referred to as amyloid-β derived diffusible ligands (ADDLs), are thought to a putative cause of AD. Here, they were demonstrated to impair early and late LTP to different extents by exclusively targeting NMDA receptors and/or their signaling. These results further contribute to the hypothesis that soluble Aβ oligomers cause synaptic dysfunction which might lead to cognitive decline seen in AD patients. Regarding drug effects, donepezil and TC-1827 slightly restored ADDLs induced impairment of early LTP, but had no effect on late LTP impaired by ADDLs. In contrast, both, SSR180711 and BAY 73-6691 completely rescued early as well as late LTP impaired by ADDLs. ADX-47273 had no restoring effect on ADDLs induced early LTP impairment, but partially restored late LTP impaired by ADDLs. Thus, the earlier finding of the present thesis was confirmed: drugs facilitating glutamatergic function not only seem to be more efficacious in enhancing LTP than drugs facilitating solely cholinergic function, but are also superior in ameliorating soluble Aβ oligomer induced LTP deficits. Therefore, from a preclinical perspective and based on the results of the present thesis, drugs interfering with glutamatergic function seem to have a high therapeutic potential as alternative treatment concerning cognitive deficits. Probably, they represent more efficacious approaches for the symptomatic treatment of AD than current treatments solely facilitating cholinergic function.

The aim of this thesis was to develop an in vitro model (IVR) of the rat lung for the purpose of investigating the deposition of drug particles in the rat airways. The model attempted to account for the affect of drug product characteristics and physiological parameters on deposition in the lungs. In addition, the model outputs were compared with in vivo lung deposition results from live rats and in silico predictions using published computer model of lung deposition in pre-clinical species. Initial work focussed on developing an aerosol exposure system capable of dosing small rodent to a range of airborne test materials. The system consists of two main parts; a fluidised bed aerosol generator and connection of the generator output to a nose only exposure chamber capable of accommodating 12 small animals in a single layer. In addition, an aerodynamic particle spectrometer (APS) was installed for continuously measuring the size distribution and airborne concentration of aerosol particles generated in the exposure chamber. System validation showed acceptable degree of variation of the test material tested, Fluorescent Microspheres (FMS) throughout the exposure chamber (CV < 15.0%). Particle size (MMAD ± GSD) using the APS was shown to be stable throughout the exposure periods. The IVR model developed in this project was based on a number of euthanased (n=7), female Sprague-Dawley rats (weight: 372 ± 56 g), which underwent high-resolution micro-CT scans. The physical model consisted of five sub sections; Extra-Thoracic region containing the snout and nasophyarynx, trachea-bronchial region containing the trachea, bronchi, and bronchioles. All sections of the model were attached to one another in numerical order and housed within a containment unit. At the rear end of the cast, a flexible diaphragm was attached in order to collect the fraction of inhaled particles exiting the TB section and possibly reaching the lung, referred to as the Post-TB section. A study was conducted to assess the influence of inhalation parameters such as the breathing frequency and tidal volume on total and regional dose distribution using FMS as test material. The major finding of this study was the demonstration of the model sensitivity to changes in breathing parameters especially respiratory frequency, where the data showed increased deposition in the peripheral regions of the model with decreased respiratory frequency. Other studies assessed the effect of particle characteristics on deposition on the IVR model, such as particle size, dose increase and formulation changes. The results assessing particle size effect showed a slightly higher deposition levels for the 4µm sized particles versus 2µm sized particles in the head region; 90.8 ± 3.6% and 88.2 ± 6.6%. However, this difference did not reach statistical significance (P> 0.05) probably due to the polydispersity of aerosolised FMS particles. In addition, the regional deposition analysis showed an increased lung peripheral deposition with the smaller particles. In addition, the model was shown to be sensitive to changes in formulation composition mediated by inclusion of MgSt. The next stage of work was to validate the model in terms of comparison with lung deposition for in vivo rats. For lung deposition comparison, the absolute amount deposited in the IVR lung model (expressed as µg/kg) was shown to have a reasonably strong correlation with in vivo lung concentration measures (µg/kg); R2= 0.66, P < 0.05. Compounds were predicted well and within 2-folds of the measured lung deposition values. However, knowing the variability in biological systems and the multiple components required to estimate lung doses, predictions within 2-fold of the measured values would seem reasonable In terms of comparison with in silico model predictions using MPPD, similar deposition levels were noted between the two models, particularly when the data was expressed as percentage of total particles inhaled. The data showed the highest deposition levels were noted in the head region (> 80%) and less than 5.0% deposition for the peripheral lung fractions. With regards to using the IVR model to assess the relationship between dose, particle size and efficacy, an in vivo study using FP with different particle sizes (2.0 and 4.0 µm) but same doses ( 100 and 1000 µg/kg). This study demonstrated that exposure of rat to FP powder resulted in a dose-dependent inhibition of neutrophils in BAL fluids. However, a clear difference in neutrophils suppression was demonstrated for equivalent doses but different particle sizes of FP, where the smaller FP particles (2.0 µm) induced a greater level of neutrophils suppression in comparison with larger FP particles (4.0 µm). In addition, a reasonably good correlation for the relationship between lung deposition in the IVR model and a neutrophils suppression level was demonstrated. Furthermore this data support the hypothesis that regional deposition is an important determinant in efficacy. Therefore, this suggests that the IVR model may be a useful as a tool to describe in vivo efficacy with in vitro data. However, further studies should be conducted to evaluate the validity of this model and relationship. The IVR model has a number of important limitations. First, the model is based on scans up to generation four of the rat respiratory tract as this represented the limits of the micro-CT scanning technology at the time of this study. Therefore deposition in the deeper region of the lung may not be reflected precisely in the IVR model. Second, the regional deposition data generated using the model tended to show an overestimation of deposition in head region and an underestimation of deposition in the peripheral regions of the lung, in comparison with in vivo lung deposition data. Third, the current model does not take into account lung clearance. However, the amount of the drug present in the in vivo lungs is dependent on numerous physiological processes such as dissolution, passive or active absorption into the systemic circulation, binding to lung tissue and mucociliary clearance. Consequently, the results generated using this IVR model for drug molecules with high lung clearance rate should be treated with some caution. Future work extending this research could go in a number of directions. In this research, a representative model of the rat respiratory tract was constructed from analysis of imaging data from a number of euthanised Sprague-Dawley rats. This model represented the “average respiratory tract” in terms of dimensions of Sprague-Dawley rats. However, there is considerable variability in the airway dimensions between rats. This variability encompasses a number of factors such as the strains of rats, sex and age, and disease state. Thus, it may be possible to produce a small number of airway models to represent small and large rats and scaled to represent the extrathoracic and peripheral regions based on literature reports of their dimensions in different rat populations. This approach will then enable the effect of intersubject airway dimensions for different rat populations on aerosol deposition to be thoroughly examined. In addition, due to the limitation of the micro-CT technology used to construct the physical IVR model, detailed morphology only up to generation 4 were captured. However, recent advances in MRI technology, such as the use of in situ-MRI based scanning technology have enabled rat airway morphometry to be extended to 16 airway generation. This coupled with improvements in the resolutions of rapid-prototyping process means it may be possible to construct a rat model that reflects the in vivo lung morphology more accurately, and thus enable greater understanding of the link between aerosol deposition and airway geometry. In conclusion, a model cast of the rat lung was developed and validated to allow the deposition of inhaled particles in the rat lung to be investigated. The model may be used to estimate the lung concentration in vivo rats in preference to exposure concentration measurements based on filter samples which have been shown to be a poor indicator of the lung concentration immediately after exposure. In addition, the model has the potential to be used along with live rats in an inhalation rig in pulmonary pharmaceutics research and may facilitate in development of inhaled formulations to target specific regions within the lung as well as screening of inhaled drugs in preclinical setting. / Das Ziel dieser Arbeit war es, ein in vitro Modell (IVR) der Rattenlunge für die Untersuchung der Deposition von Wirkstoffpartikeln in den Atemwegen der Ratte zu entwickeln. Das Modell sollte dabei den Einfluss der Arzneistoffeigenschaften und physiologischer Parameter auf die pulmonale Deposition berücksichtigen. Darüber hinaus wurden die Modellergebnisse mit in vivo Daten aus Versuchen mit Ratten und in silico Vorhersagen eines etablierten Computermodells der Partikeldeposition in präklinischen Spezies verglichen. Erste Arbeiten konzentrierten sich auf die Entwicklung eines Aerosol-Expositionssystems, das in der Lage war, kleine Nagetiere einer Reihe von inhalativ verabreichten Testmaterialien auszusetzen. Das System bestand aus zwei Hauptteilen, einem Wirbelbett-Aerosolgenerator und einer Verabreichungskammer, die eine nasale Partikelexposition und –inhalation („Nose only Inhalation“) bei 12 Kleintieren auf einer Etage ermöglichte. Darüber hinaus wurde ein aerodynamisches Partikelspektrometer (APS) zur kontinuierlichen Messung der Größenverteilung und Konzentration der erzeugten Aerosolpartikel eingebaut. Die Systemvalidierung zeigte einen akzeptablen Grad der Variabilität des Testmaterials, Fluoreszenz-Mikrosphären (FMS), in der gesamten Expositionskammer (VK < 15,0%). Es konnte gezeigt werden, dass die aerodynamische Partikelgröße (MMAD ± GSD) der APS über die Expositionszeiten konstant blieb. Das IVR-Modell, das in diesem Projekt entwickelt wurde, basierte auf einer Anzahl euthanasierter, weiblicher Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 372 ± 56 g), die hochauf¬lösenden Mikro-CT-Scans unterzogen wurden. Das physikalische Modell gliederte sich in fünf Teilabschnitte, dem extrathorakalen Bereich bestehend aus der Schnauze und dem Nasopharynx, und dem tracheo-bronchialen Bereich (TB), der die Luftröhre, Bronchien und Bronchiolen umfasste. Alle Abschnitte des Modells wurden miteinander in numerische Reihenfolge gebracht und innerhalb einer Behältereinheit untergebracht. Am hinteren Ende des Gusses wurde eine flexible Membran angebracht, um den Anteil der inhalierten Partikel, der den TB-Abschnitt verlässt und möglicherweise die Lunge erreicht, zu sammeln. Dieses wurde als Post-TB-Anteil bezeichnet. Eine Untersuchung sollte zeigen, welchen Einfluss Inhalationsparameter wie die Atem¬frequenz und –volumen auf die gesamte und regionale Dosisverteilung der FMS als Test¬material hatten. Das wichtigste Ergebnis dieser Studie war der Nachweis, dass das Modell empfindlich gegenüber Änderungen in der Respirationsparameter, vor allem der Atem¬frequenz, war. Die Daten zeigten, dass es unter verminderter Atemfrequenz zu einer verstärkten Partikeldeposition in den peripheren Modellbereichen kam. In weiteren Versuchsansätzen wurden die Wirkung von Partikeleigenschaften, wie Partikelgröße, Dosiserhöhung und Formulierungsänderungen auf die Deposition in dem IVR-Modell ermittelt. Die Ergebnisse der Untersuchung des Partikelgrößeneffektes zeigten eine etwas höhere Deposition der 4 µm großen Partikel, verglichen mit den 2 µm Partikeln, im Kopfbereich, 90,8 ± 3,6% bzw. 88,2 ± 6,6%. Allerdings war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (P > 0,05), wahrscheinlich aufgrund der Polydispersität der FMS-Aerosolpartikel. Darüber hinaus zeigte die Analyse der regionalen Verteilung eine erhöhte periphere Lungendeposition bei kleineren Partikeln. Zudem war das Modell empfindlich gegenüber Veränderungen in der Formulierungszusammensetzung durch Zugabe von Magnesium¬stearat. In nächsten Schritt sollte das Modell in Bezug auf den Vergleich mit der Lungendeposition bei Ratten in vivo validiert werden. Es zeigte sich, dass die absolut im IVR-Lungenmodell deponierte Menge (ausgedrückt in µg/kg) eine annehmbar starke Korrelation mit in vivo Daten (µg/kg) aufwies; R2 = 0,66, p < 0,05. Substanzen konnten gut innerhalb des 2-fachen Bereiches der gemessenen Lungendepositionsrate vorhergesagt werden. Angesichts der bekannt hohen Variabilität in biologischen Systemen und der Komplexität der Schätzung der Lungendeposition erscheinen Schwankungen der Vorhersagen innerhalb des 2-fachen Bereiches der tatsächlichen Werte akzeptabel. Der Vergleich der in silico Vorhersagen mit den IVR-Resultaten zeigte ähnliche Depositions¬raten in beiden Modellen, insbesondere dann, wenn die Daten als Prozentsatz der insgesamt inhalierten Partikel ausgedrückt wurden. Die höchste Deposition fand im Kopfbereich (> 80%) statt und weniger als 5,0 % der Partikel erreichte den peripheren Lungenbereich. Das IVR-Modell wurde nachfolgend auch in einer in vivo Studie mit Fluticasonpropionat (FP) eingesetzt, um die Beziehung zwischen der Dosis, Partikelgröße und Wirksamkeit unterschiedlicher Teilchengrößen (2,0 und 4,0 µm) bei gleichen Dosen (100 und 1000 µg/kg) zu beurteilen. Diese Studie zeigte eine dosisabhängige Hemmung der Neutrophilen in der bronchoalveolären Lavage. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der Neutrophilensuppression unter äquivalenten Dosen unterschiedlicher Partikelgrößen beobachtet. Kleinere Partikel (2,0 µm) von FP hemmten die Neutrophilen stärker als die größeren FP-Partikel (4,0 µm). Darüber hinaus konnte eine recht gute Korrelation zwischen der Lungendepositionsrate im IVR-Modell und der Neutrophilensuppression gezeigt werden. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass die regionale Deposition eine wichtige Determinante der Wirksamkeit ist. Die Ergebnisse legen die mögliche Eignung des IVR-Modells als Hilfsmittel zur Beschreibung der in vivo Effektivität, ausgehend von in vitro Daten, nahe. Allerdings sollten weitere Studien durchgeführt werden, um die Valididtät dieses Modells und der gefundenen Beziehung zu bestätigen. Das IVR-Modell hat eine Reihe von wichtigen Einschränkungen. Erstens basiert das Modell auf Scans lediglich bis zu vierten Generation der Atemwege, was zum Zeitpunkt dieser Studie die Grenze der Mikro-CT-Scan-Technik darstellte. Daher wird in dem IVR-Modell eine Deposition in tieferen Bereichen der Lunge nicht präzise beschrieben. Zweitens zeigten die regionalen Depositionsdaten, die unter Verwendung des Modells ermittelt wurden, im Vergleich zu in vivo Ergebnissen eine Überschätzung der Deposition im Kopfbereich und eine Unterschätzung der Deposition in den peripheren Regionen der Lunge. Drittens berücksichtigt das Modell nicht die Clearance des Arzneistoffes. Die Arzneistoffkonzentration in der Lunge hängt in vivo von zahlreichen physiologischen Prozessen ab, wie Auflösung, aktive und passive Absorption in den systemischen Kreislauf, die Bindung an das Lungengewebe und mukoziliäre Clearance. Daher sollten die Ergebnisse, die unter Verwendung dieses IVR-Modells gewonnen werden, für Wirkstoff¬moleküle mit hoher Clearance-Rate mit einer gewissen Vorsicht behandelt werden. Zukünftige weiterführende Arbeiten könnten in eine Reihe von Richtungen gehen. In der vorliegenden Untersuchung wurde ein repräsentatives Modell des Rattenrespirationstraktes aus der Analyse der Bilddaten mehrerer anästhesierter Sprague-Dawley-Ratten erstellt. Dieses Modell repräsentiert die "durchschnittlichen Atemwege " in Bezug auf Abmessungen der Sprague-Dawley-Ratten. Es gibt jedoch eine beträchtliche Variabilität basierend auf einer Reihe von Faktoren wie den Rattenstamm, Geschlecht, Alter und Krankheitszustand. Es wäre möglich, mehrere verschiedene Atemwegsmodelle zu erstellen, um kleine und große Ratten zu repräsentieren. Es könnten, basierend auf Literaturangaben, die extra¬thorakalen und peripheren Regionen in ihren Abmessungen skaliert werden, um verschiedenen Rattenpopulationen zu repräsentieren. Dieser Ansatz würde dann die detaillierte Untersuchung des Einflusses interindividueller Unterschiede der Atemwegs¬dimensionen verschiedener Rattenpopulationen auf die Aerosoldeposition ermöglichen. Aufgrund der Beschränkung der Mikro-CT-Technologie, die eingesetzt wurde, um das IVR-Modell zu erstellen, konnte eine detaillierte Morphologie nur bis zur vierten Atemwegs¬generation abgebildet werden. Jüngste Fortschritte in der MRI-Technologie, wie die in situ MRI-Scan-Technologie, ermöglichen die Erfassung der Atemwegsmorphometrie bis zu 16 Atemwegsgenerationen. Dieser Ansatz, in Verbindung mit Verbesserungen in den räumlichen Auflösungen der „Rapid-Prototyping“-Verfahren, könnte die Konstruktion eines Rattenmodells ermöglichen, das die in vivo Lungenmorphologie genauer widerspiegelt, und so zu einem besseren Verständnis für den Zusammenhang zwischen Aerosoldeposition und Atemwegsgeometrie führen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit ein Modellguss der Rattenlunge entwickelt und validiert wurde, um die Untersuchung der Deposition von inhalierten Partikel in der Rattenlunge zu ermöglichen. Das Modell kann verwendet werden, um die in vivo Lungenkonzentrationen von Arzneistoffen in Ratten abzuschätzen. Es bietet Vorteile gegenüber der Expositionsabschätzung auf der Basis von Filterproben, die ein schlechter Indikator der Lungenkonzentrationen unmittelbar nach der Exposition sind. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, zusammen mit lebenden Ratten in einer Inhalationskammer in der Forschung verwendet zu werden und könnte in der Entwicklung von inhalativen Formulierungen erleichtern, die in bestimmten Regionen innerhalb der Lunge deponiert werden sollen. Darüber hinaus ermöglicht das Modell ein Screening inhalativ verabreichter Arzneistoffe in der präklinischen Phase.

In der vorgelegten Studie wurde Modafinil hinsichtlich seiner möglichen antidepressiven und kognitionsverbessernden Wirkung in einem akuten prädiktiven tierexperimentellen Test mit Ratten, dem Forced Swim Test (FST), sowie in einem kognitiven Test zur gerichteten Aufmerksamkeit in der sozialen Diskriminierung (SND), sowie in einem Depressionsmodell der Ratte getestet. Bei der akuten Gabe von Modafinil zeigte sich im FST bei naiven Ratten eine vergleichbare Wirkung mit typischen Antidepressiva, die sich in einer verkürzten immobilen Zeit im Wasserbassin ausdrückte, während durch die akute Administration von Modafinil sich das Diskriminierungsverhalten gesunder Ratten nicht änderte. Zur Induktion depressionsartigen Verhaltens wurde ein 14-tägiges Restrained Stress-Protokoll verwendet. Der FST diente zum Nachweis der depressionsartigen Verhaltensmuster. Gestresste und ungestresste Tiere wurden akut und subchronisch mit Modafinil bzw. Placebo behandelt, um damit die Reversibilität depressionsähnlicher Verhaltensänderungen durch Modafinil zu untersuchen. Das Medikament verbesserte signifikant die depressionsartigen Verhaltensveränderungen und die Aufmerksamkeitsleistung im FST und SND. Mittels Mikrodialyse wurde gezeigt, dass Modafinil die Dopamin-Konzentration im kortikolimbischen System erhöht, so dass dies zu den beobachteten Effekten beitragen könnte. Die vorliegenden Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass Modafinil antidepressiv-ähnliche und kognitionsverbessernde Wirkungen besitzt und damit eine mögliche Alternative bei der adjuvanten Behandlung menschlicher Depression sein könnte. In weiteren Studien gilt es zu klären, in wie weit die hier gewonnenen Ergebnisse auf die klinische Situation übertragbar sind.