The goal of the thesis was to characterize transcriptional profiles of in vivo and in vitro derived embryos during bovine minor and major embryonic genome activation and to identify mRNA transcripts newly synthesized during these stages. In our first work we have concentrated on the study of minor genome activation at the 4-cell stage of embryo. Using SSH, we have identified 31 amplicons homologous with already identified genes. We have selected 5 of these for detailed study of their expression during the whole period of preimplantation development: centromere protein, 350/400 kDa (CENPF, mitosin), splicing factor arginine/serine-rich 3 (SRFS3), high mobility group nucleosomal binding domain 2 (HMGN2) protein and eukaryotic translation initiation factors EIF4A2 a EIF4E. All these genes play an important role in the early embryo development. SRFS3 is the first described gene with an important function in preimplantation development, which is expressed already during bovine minor genome activation, and its transcription is α-amanitin sensitive during this period. We have selected CENPF gene for a more thorough study. By silencing its expression by the injection of CENPF dsRNA into the zygote, we have studied its function throughout the whole preimplantation development of bovine embryo....

Le virus ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1), peut être considéré comme un des agents infectieux majeur affectant les élevages d’huîtres creuses, Crassostrea gigas, en France. Des différences de sensibilité à l’infection ont également été observées au sein de cette espèce. Des travaux précédents suggèrent un lien entre la base génétique et la survie des animaux face à l’infection. Dans ce contexte, l’objectif principal du travail de thèse était de mieux comprendre les interactions entre l’huître creuse et OsHV-1, et plus particulièrement, les bases moléculaires du cycle viral. Nos résultats montre que le virus est capable de se répliquer chez l’hôte quel que soit son stade de développement, et sa sensibilité. Cependant, la cinétique de multiplication est plus rapide chez des individus sensibles comparés aux moins sensibles. Il apparaît également que chez les individus survivants, le virus ne soit plus détectable après une phase de réplication active. Cette observation laisse suspecter (i) une rémission avec une élimination du virus ou (ii) une persistance du virus sans symptômes détectables. Ces résultats mettent en lumière la possibilité du virus de circuler au sein des individus survivants. Ces individus peuvent excréter des particules virales et intervenir ainsi dans le processus d’infection en milieu naturel. L’ensemble de ces résultats représentent une premier contribution à la compréhension du cycle d’ OsHV-1 chez l’huître creuse, plus particulièrement au niveau moléculaire. / In France, Ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1), can be considered one of the major infectious agents in Pacific oysters, Crassostrea gigas. Susceptibility differences to infection were observed in this species. Previous work suggested that the genetic basis and the survival animals to infection were related. In this context, the main objective of this thesis was to understand the interactions between oysters and OsHV-1, in particular, the molecular basis of the viral cycle. Our results shows that the virus is able to replicate in the host regardless of its stage of development or its susceptible. However, multiplication kinetic is faster in susceptible individuals compared to less susceptible individuals. After a active replication, it would appear that the virus is no detectable in survival individuals. This observation suggests (i) a remission with elimination of the virus or (ii) a virus persistence without detectable symptoms. These results highlight the ability of the virus circulating in the host without causing mortality. These individuals can excrete viral particles and interfere with the infection process in field. All these results represent a first contribution to the understanding of OsHV-1 cycle in Pacific oysters, particularly at the molecular level.

Devido à sua múltipla utilidade, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é amplamente cultivada em mais de 127 países tropicais e subtropicais. No Brasil, a cultura apresentou expansão em área plantada nos últimos anos em virtude da crescente demanda por biocombustíveis. Porém, a produção de mudas sadias tende a ser um fator limitante a este aumento de demanda, já que diversas doenças são transmitidas por toletes contaminados. Dentre estas, destaca-se o raquitismo da soqueira (RSD), causado pela bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) (KAO e DAMANN, 1980). De acordo com a literatura, a transmissão de Lxx se dá através de toletes contaminados e/ou instrumentos de corte, não havendo relatos sobre sua transmissão por sementes. Desta forma, seu controle se baseia no princípio da exclusão, através do uso de toletes tratados termicamente como fonte de material propagativo. Porém, não se conhece o efeito do tratamento no título de Lxx, uma vez que os relatos de eficiência da termoterapia baseiam-se em avaliações qualitativas. Em face destas informações, este estudo objetivou avaliar a transmissão de Leifsonia xyli subsp. xyli por sementes e também quantificar o efeito da termoterapia no título de Lxx em duas variedades de cana-de-açúcar através da PCR quantitativa em tempo real. No ensaio de transmissão via sementes, a bactéria foi detectada em altas incidências (>87%) em plantas de 90 dias oriundas de sementes coletadas de plantas infectadas e em quantidades estimadas superiores a 51 células por 100ng de DNA total de sementes. Além disso, aos 270 dias após o plantio, a bactéria foi isolada de 6 plantas. A identidade das colônias foi comprovada através de PCR convencional utilizando primers específicos para Lxx. Dois ensaios foram conduzidos para quantificar o efeito da termoterapia na população bacteriana. O título de Lxx foi determinado em folhas de plantas de duas variedades de cana-deaçúcar oriundas de toletes tratados termicamente ou não aos 90 dias após o plantio. O título inicial presente nos colmos utilizados como fonte de toletes interferiu na eficiência do tratamento, que reduziu a população bacteriana somente no ensaio onde os colmos apresentaram elevado título bacteriano inicial. Além disso, 70 e 55% das plantas oriundas de toletes tratados termicamente no primeiro e no segundo ensaio, respectivamente, apresentavam células de Lxx, porém em menores quantidades quando comparadas a plantas oriundas de toletes não tratados. Com isso, conclui-se que Lxx é transmitida em elevada frequência via sementes e a termoterapia, embora não tenha efeito erradicante pronunciado, é capaz de reduzir o título bacteriano no tecido vegetal. / Due to its multiple uses, sugarcane (Saccharum spp.) is widely cultivated in more than 127 tropical and subtropical countries. In Brazil, sugarcane cropping has increased in recent years because of the growing demand for biofuels. However, the production of healthy seedlings tends to be a limiting factor to this increase, since contaminated setts transmit many diseases. Among these, the Ratoon Stunting Disease (RSD) is a major disease caused by the fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) (KAO and DAMANN, 1980). According to the literature, the transmission of Lxx occurs through contaminated setts and/or cutting tools, but there are no reports of its transmission by seeds. Therefore, its control is based on the principle of exclusion using heat-treated setts as source of propagative material. However, the quantitative effect of the treatment on the bacterial titer is not known, since reports of thermotherapy efficiency are based on qualitative assessments. This study aimed to evaluate the transmission of Leifsonia xyli subsp. xyli by seeds and to quantify the effect of thermotherapy on Lxx in two sugarcane varieties using real-time quantitative PCR. In the test of disease transmission by seeds, the bacterium was detected in high incidences (>87%) in 90-day old plants generated from seeds collected from infected plants in quantities exceeding 51 cells per 100ng of total DNA of seeds. In addition, at 270 days after planting, the bacterium was isolated from six plants. The colony identity was confirmed by conventional PCR using Lxx-specific primers. Two trials were conducted to quantify thermotherapy effect on bacterial population. Lxx titers were determined 90 days after planting in plant leaves of two sugarcane varieties originated from setts subjected or not to heat-treatment. The initial bacterial titer in the stalks affected the treatment efficiency, which significantly reduced Lxx titers only in the trial where the stalks presented high initial bacterial levels. Moreover, 70 and 55% of the plants originated from heat-treated setts in the first and second tests, respectively, were infected with Lxx, cells; however, in smaller amounts compared to plants from untreated setts. Thus, it is concluded that Lxx is transmitted in high frequency by seeds and that the thermo treatment, although not efficient as an eradicating treatment, reduces the bacterial population in the plant tissue.

A diarréia neonatal é o principal problema sanitário que acomete os bezerros nas primeiras semanas de vida, causando grandes prejuízos devido à morbidade, mortalidade, custos com tratamento e atraso no desenvolvimento. Os rotavírus são os mais importantes agentes virais causadores de gastroenterites em crianças e diarreia em diferentes espécies animais. Além do seu impacto econômico na produção animal, os bovinos podem atuar como reservatórios da diversidade genética e antigênica para humanos. Assim, o diagnóstico deste agente é fundamental para o desenvolvimento de medidas profiláticas mais especificas visando o seu controle. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de PCR em Tempo Real para a detecção de rotavírus bovinos em sistema Taqman® tendo como alvo, a proteína não-estrutural 5 (NSP5). Para isso, 113 amostras de fezes bovinas foram coletadas de reabanhos do estado de São Paulo, e previamente testadas por PCR convencional. Para a padronização da PCR em Tempo Real, a estirpe padrão foi clonada, gerando um plasmídeo com 3x1010 cópias/reação. Como controle exógeno foi utilizado β-actina. O limite de detecção foi determinado por diluições seriadas na base 10, detectando até 6x101 cópias/µl. A curva padrão da PCR em Temo Real para a detecção do segmento codificador da proteína NSP5 teve como resultados, uma eficiência de 100,47%; com slope igual a -3,18 e R2 de 1,0. De um total de 113 amostras testadas pela PCR convencional 63 delas (55,7%) foram consideradas positivas para rotavírus. Dessas mesmas amostras testadas, 5 não amplificaram para β-actina e não foram incluídas nas análises posteriores. Para a PCR em Tempo Real o limite de detecção foi considerado o valor de 6x101 cópias/reação, sendo definido o ponto de corte o ciclo (Ct) de número 36 para o teste com a amostra viral a partir do DNA ligado em vetor plasmidial. Considerando-se o ponto de corte de 60 (6x101) cópias/reação, das 108 amostras testadas, 63 (58,3%) foram consideradas positivas ao teste. O valor de concordância obtido através do teste Kappa, a um intervalo de confiança de 95%, a partir dos resultados gerados entre os testes de PCR convencional e PCR em foi de 0.279 (baixa concordância). Os resultados obtidos nesse estudo demonstrou que o teste foi eficiente podendo ser utilizado para um diagnóstico rápido e eficiente do rotavirus do grupo A, aumentando assim o repertório dos testes já estabelecidos / Neonatal diarrhea is the main health problem affecting the calves in the first weeks of life, causing major losses due to morbidity, mortality, treatment costs and delayed development. Rotaviruses are the most important causative agents of viral gastroenteritis in children and in different animal species. In addition to its economic impact on livestock, cattle can act as reservoirs for genetic and antigenic diversity for human samples. Therefore, the diagnosis of this agent is critical to the development of more specific preventive measures for their control. The objective of this work is to develop a method of PCR for rotavirus detection in cattle using TaqMan® system targeting the 5 nonstructural protein (NSP5). For this, 113 samples of cattle feces were collected from farms of São Paulo, and previously tested by convencional PCR. To PCR standardization, the standard sample was cloned, generating plasmid 3x1010 copies/reaction. The β-actin was usede as exogenous control. The limit of detection was determined by serial dilutions, to detect 6 x101 copies/µl. The standard curve of PCR to encoding segment detection NSP5 protein had as a result, an efficiency of 108.5%; with slope equal to -3.18 and R2 equal 1.. From a total of 113 samples tested by conventional PCR 63 (55.7%) were positive for rotavirus. From these samples 5 not amplifyed for β-actin gene and were not included in subsequent analyzes. For detection limit of Real-Time PCR was considered the amount of 6x101 copies / reaction, the cut-off being defined cycle (Ct) number 36 to the test with a viral sample from the DNA ligated into plasmid vector. Considering the cut-off 60 (6x101) copies/reaction of the 108 samples tested, 63 (58.3%) were positive to the test. The correlation value obtained by the Kappa test, at a 95% confidence interval, based on results generated between the conventional and PCR testing PCR was 0.279 (low agreement). The results of this study demonstrated that the probe can be efficiently used for a fast and efficient diagnosis of rotavirus of group A, thereby enhancing the repertoire of the established tests

Fusobacterium nucleatum é uma espécie bacteriana Gram-negativa, anaeróbia estrita e uma das espécies frequentemente encontradas nas infecções primárias do sistema de canais radiculares. Esta espécie tem grande importância na formação de biofilmes por ser uma ponte de união entre espécies que não são capazes de interagir. Os micro-organismos constituintes de biofilmes trocam material genético, aumentando a tolerancia dos mesmos e é quase impossível um isolado clínico ter os genes totalmente iguais à cepa padrão de coleções de cultura como da ATCC (American Type Culture Colection). O presente estudo investigou a espécie bacteriana anaeróbia Fusobacterium nucleatum isolada de canais radiculares, comparando-a com sua cepa de referência. Foi feito a comparação da suscetibilidade microbiana in vitro por meio de cultura microbiológica pelo método do E-test, com as cepas em crescimento planctônico e em biofilme. Também foi definido um protocolo de Purificação de RNA para esta espécie em ambas as condições de crescimento. As cepas clínicas de F. nucelatum foram isoladas por meio da cultura microbiológica de 23 pacientes que apresentavam dentes com infecção primária e periodontite apical visível em radiografia. Foi feito isolamento e identificação da espécie por série bioquímica com testes comerciais (Sistema Api, Bio-Meriéux, França) e PCR convencional, sendo no total 4 isolados clínicos investigados. Foi verificada a suscetibilidade antimicrobiana dos seguintes antibióticos: Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Ampicilina, Azitromicina, Clindamicina, Eritromicina e Metronidazol. O protocolo para purificação de RNA foi feito com microesferas de zircônia, dispositivo bead beater, kit comercial RNeasy (Qiagen) e transcrição para DNA complementar (cDNA). A qualidade da purificação foi testada quanto a sua capacidade de amplificação pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) utilizando primer para o gene 16s RNA específico para F. nucelatum. Todas as cepas testadas foram 100% suscetíveis a Amoxicilina + ácido clavulânico, Ampicilina, Azitromicina, Clindamicina e Metronidazol. Ambos os tipos de crescimento bacteriano demonstraram resistência somente à eritromicina. O protocolo proposto para a purificação do RNA de F. nucelatum dos isolados em crescimento planctônico e em biofilme foi eficaz. A média do rendimento do RNA das amostras para as bactérias em crescimento planctônico foi de 514,2 ng/μL (DP ± 397,7) e para as amostras em biofilme foi de 377,1 ng/μL (DP± 144,1). Os valores encontrados sugerem uma boa qualidade de RNA, livre de contaminação por proteínas. Todas as cepas de Fusobacterium nucleatum isoladas de canais radiculares, assim como a cepa ATCC foram suscetíveis aos antibióticos testados, com exceção do antibiótico eritromicina em ambos os tipos de crescimento bacteriano. As bactérias em biofilme apresentaram aumento na tolerância frente aos agentes antimicrobianos, com diferença estatística. O protocolo estabelecido para a purificação do RNA de cepas de Fusobacterium nucleatum cultivadas em fase planctônica e em biofilmes teve êxito com amplificação por qPCR. / Fusobacterium nucleatum is a Gram-negative bacterial species, strict anaerobic and one of the species often found in primary infection of the root canal system. This species has great importance in biofilm formation to be a union bridge between species which are not able to act alone. The constituent microorganisms of the biofilm exchange each tother genetic material, increasing the strength of them. It is almost impossible for a clinical isolate have genes totally equal to a standard strain, such as strains of culture collections like ATCC (American Type Culture Collection). The present study investigated anaerobic bacterial species Fusobacterium nucleatum isolated from root canals, comparing them to the ATCC strain. The microbial in vitro susceptibility of biofilm and planktonic growth of the strains was compared by means of microbiological culture and the E-test method, with the antibiotics Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanic acid, Ampicillin, Azithromycin, Clindamycin, Eritromycin and Metronidazole.. Also, a RNA Purification protocol for the strains under the same growth conditions was defined. Clinical isolates were obtained by microbiological samples of patients with teeth with pulp necrosis and apical periodontitis visible on radiographs. The species isolation and identification were performed using commercial biochemical tests (Sistema Api, Bio-Meriéux, France) and conventional PCR, obtaining four clinical isolates. The protocol for RNA purification was done with zirconia beads, bead beater device and commercial kit RNeasy (Qiagen) and transcribed into complementary DNA (cDNA). The quality of purification was tested for its ability of amplification by real time polymerase chain reaction (qPCR) using primer for the gene 16s RNA specific for F. nucleatum. All tested trains were 100% susceptible to amoxicillin + clavulanic acid, ampicillin, azithromycin, clindamycin and metronidazole. Both types of bacterial growth showed resistance to Erythromycin. Bacteria in biofilm showed a decrease in susceptibility to all antibiotics, but without statistical difference. The protocol proposed for the purification of RNA of F. nucleatum was effective, in the planktonic and the biofilm growth. The average yield of RNA samples for bacteria in planktonic growth was 514.2 ng /μL (SD ± 397.7) and the samples in biofilm was 377.1 ng / μL (SD ± 144.1). These found values suggest a good quality of RNA, free of protein contamination. The established protocol for the purification of the RNA of the Fusobacterium nucleatum strains, grown in biofilm and planktonic phase, had successfully amplified by qPCR.

As tonsilas palatinas e adenoides são órgãos linfoides epiteliais do trato respiratório superior, onde ocorre o primeiro contato entre antígenos inalados e células de defesa do hospedeiro. O tecido adenoamigdaliano está em contato constante com uma grande diversidade de bactérias e vírus, que se reflete na elevada taxa de detecção de patógenos bacterianos e virais nesses tecidos, mesmo que saudáveis. Infecções crônicas ou repetidas nas mucosas dos tecidos linfoides podem desencadear o desenvolvimento de um estado inflamatório crônico e a presença de hiperplasia tecidual. Esse estado está associado com inúmeras complicações como rinussinusites de repetição, ronco, obstrução nasal, disfunção da tuba auditiva, apnéia obstrutiva do sono, otite média, alterações do desenvolvimento facial, desenvolvimento comportamental. Por isso, este trabalho tem como objetivo principal analisar co-detecções das principais bactérias da microbiota respiratória humana (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophylus influenzae, Moraxella catahrralis e Pseudomonas aeruginosa) de pacientes com e sem adenoamigdalite crônica através da técnica de PCR em tempo real. Tivemos como principal bactéria detectada em nosso estudo H. influenzae, que foi encontrada em altos níveis na amígdala e adenoide. Já nas secreções, a bactéria de maior frequência encontrada foi S. pneumoniae. Os resultados de comparação entre os 2 grupos (pacientes com a doença e sem a mesma) não foram estatisticamente significantes, porém não menos importante, mostrando que os principais agentes comensais que colonizam o trato aéreo superior (Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae e Moraxella catahrralis) sao elevados em ambos os grupos, e que provavelmente não são fundamentais na fisiopatogenia da hipertrofia adenoamigdaliana/tonsilites de repetição. Como conclusão podemos observar que as bactérias H. influenzae, M. catarrhalis e S. pneumoniae tiveram altas frequências de detecção em amígadalas, adenoides e lavados nasofaríngeo de crianças sem hipertrofia tonsilar e sintomatologia de infecção respiratória. Além disso, não houve maiores frequências de detecção de bactérias presentes na microbiota em pacientes com hipertrofia tonsilar do que em controles e diferentemente das demais bactérias, houve concordância moderada ou boa nas detecções de M. catarrhalis e H. influenzae entre adenoide e amígdada de indivíduos sem sintomas respiratórios. / The tonsils and adenoids are lymphoid epithelial organs of the upper respiratory tract, where the first contact between inhaled antigens and host defense cells occurs. In fact, the adenoid and tonsillar tissue is in constant contact with a wide variety of bacteria and viruses, which is reflected in the high rate of detection of bacterial and viral pathogens in these tissues, even if healthy. Chronic or recurrent infections of mucosal lymphoid tissues may trigger the development of a chronic inflammatory condition and the presence of tissue hyperplasia. This condition is associated with numerous complications such as rinussinusites repeat, snoring, nasal congestion, Eustachian tube dysfunction, obstructive sleep apnea, otitis media, abnormal facial development, behavioral development. Therefore, this study aims to analyze co-detections of the major human respiratory microbiota bacteria (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catahrralis and Pseudomonas aeruginosa) in patients with and without chronic adenoamigdalite using the technique of real time PCR. We had the main bacteria detected in our study H. influenzae, which was found in high levels in the amygdala and adenoids. Already in the secretions, the bacterium most frequently found was S. pneumoniae. In conclusion we can see that the bacteria H. influenzae, M. catarrhalis, and S. pneumoniae had high frequency of detection in amígadalas, adenoids and nasopharyngeal washed children without tonsillar hypertrophy and symptoms of respiratory infection. In addition, there were no major frequency detection of bacteria present in the microbiota in patients with tonsillar hypertrophy than in controls, and unlike the other bacteria, there was moderate to good agreement in the detection of M. catarrhalis and H. influenzae between adenoid and amígdada of individuals without respiratory symptoms.

A floresta plantada de eucalipto representa a maior porcentagem entre as florestas plantadas no Brasil, principalmente para a producao de papel e celulose. Porem, durante todo o seu desenvolvimento, o eucalipto sofre o ataque de diferentes patogenos, e entre eles esta o fungo Puccinia psidii causador da ferrugem, principal doenca do eucalipto em regioes tropicais. Assim, com o intuito de estudar alguns mecanismos de defesa da planta contra a infeccao do fungo, este trabalho visou analisar a expressao genica de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo e a atividade das mesmas; e o proteoma de clones de eucalipto resistentes e suscetiveis, ao longo do processo de infeccao, colonizacao e multiplicacao do fungo nas plantas. Foi possivel observar diferencas na expressao dos genes em todos os horarios estudados, principalmente as 24 horas apos inoculacao com o fungo. Alem disso, com a analise do proteoma pode-se observar algumas proteinas de grande relevancia para este trabalho, como algumas relacionadas a estresse oxidativo e a resposta de defesa da planta. / The eucalyptus planted forest represents the major percentage among all planted forests in Brazil, mainly for the production of paper and cellulose. However, during its development, the eucalyptus can be attacked by a large number of different pathogens, like the fungus Puccinia psidii, the causer of the eucalyptus rust, main disease that affects the eucalyptus in tropical regions. Thus, in order to study some plant defense mechanisms against the infection of the fungus, this study aimed to analyse the gene expression of some enzymes related to oxidative stress and their activities, and the proteome of resistant and susceptible eucalyptus clones, during the process of infection, colonization and multiplication of the fungus in the plant. We could observe differences in the gene expression at all times studied, mostly at 24 hours after inoculation with the fungus. Besides, with the proteome analysis we could find the very relevant proteins for this study, for instance some proteins related to the oxidative stress and to the plant defense response.

A significativa prevalência da infecção pelo HTLV-1/2 no Brasil tornou compulsória a triagem sorológica em bancos de sangue desde 1993. A realização de um diagnóstico eficaz e seguro desta infecção tem importância no correto aconselhamento dos pacientes, bem como na adoção de medidas preventivas em relação à transmissão do HTLV-1/2. Entretanto, a ineficiência dos testes confirmatórios disponíveis somado ao alto custo, são fatores limitantes para a conclusão segura do status clínico do paciente. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, padronizar e validar uma plataforma molecular (NAT) multiplex utilizando a metodologia de PCR em tempo real para o diagnóstico confirmatório e discriminatório da infecção pelo HTLV-1/2. Para tanto, foi padronizada a PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas de hidrólise (TaqMan®) e a região gênica viral pol foi utilizada como alvo dessas reações. As reações foram otimizadas e validadas em amostras de DNA de controles positivos e negativos, amostras de DNA obtidas a partir do sangue total de indivíduos infectados pelo HTLV-1/2, candidatos à doação de sangue e de pacientes infectados por outras viroses (HIV, HBV e HCV). Após a padronização, a plataforma molecular foi validada em relação aos seguintes parâmetros: sensibilidade analítica, sensibilidade diagnóstica, especificidade analítica, especificidade diagnóstica, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LoD) foi de 3,85 cópias/reação para HTLV-1 e 10,88 cópias/reação para HTLV-2. Para a especificidade, não foi observada reação cruzada com os vírus HAV, HBV, HCV, HIV-1 e HIV-2 e B19V obtidos a partir de um painel de referência viral e nem com amostras de indivíduos portadores de HIV, HBV ou HCV. A sensibilidade diagnóstica foi de 94,6% para HTLV-1 e 78,6% para HTLV-2. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de até 0,475%. A metodologia desenvolvida é uma ferramenta simples, de baixo custo, sensível e altamente específica, portanto, adequada para detecção e discriminação da infecção por este retrovírus. A padronização desta plataforma tem um importante impacto no fortalecimento da capacitação tecnológica nacional. Além disso, propõe seu uso no algoritmo diagnóstico, o qual permitirá a conclusão segura do diagnóstico do HTLV-1/2. / The significant prevalence of HTLV-1/2 infection in Brazil has turned the serological testing for this virus mandatory in national blood banks since 1993. The performance of efficient and safe diagnosis of this infection has importance on the correct counseling of the patients and the prevention of the transfusion/hemoderivatives transmitted HTLV-1/2 infection. However, the inefficiency of the available confirmatory tests combined with their high cost present limiting factors for adequate conclusions over the clinical status of the patient. A safe diagnosis of the HTLV-1/2 infection is of crucial importance for the correct counseling of the patients and prevention of the transmission of the infection by blood transfusions, breastfeeding and solid organ transplantations. Therefore, the objective of this study was to develop, optimize and validate a molecular multiplex platform (NAT) utilizing the real-time PCR methodology for confirmatory and discriminatory diagnosis of the HTLV-1/2 infection. DNA samples obtained from HTLV-1/2 positive patients, blood donor candidates, and HIV, HBV and HCV infected patients were used in this study. The real-time PCR was optimized using the TaqMan® system (hydrolysis probes) and the pol gene was a target for real-time amplification. After optimization, the molecular platform was validated by analysis of the analytic and diagnostic sensitivity, analytic and diagnostic specificity, precision, and robustness. The detection limit (LoD) of the test was 3.85 copies/reaction for HTLV-1 and 10.88 copies/reaction for HTLV-2. Evaluation of the specificity did not demonstrate cross reaction with human viruses like HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2 and B19V obtained from a diagnostic panel and also with samples obtained from HIV, HBV or HCV positive individuals. The diagnostic sensitivity was 94.6% for HTLV-1 and 78.6% for HTLV-2. The estimated variation coefficient of the precision analysis was not more than 0.475%. Therefore, this methodology presents simple, inexpensive, sensitive and highly specific test, and can be used adequately for the detection and discrimination of this retroviral infection. The optimization of this molecular platform have important impact on the improvement of the technologic capability and it can be used for the definition of a national diagnostic algorithm which will permit a safe conclusion of the HTLV-1/2 diagnosis.

O cultivo de células humanas para fins experimentais e terapêuticos se firmou como um dos pilares da biologia celular e tem se tornado uma prática laboratorial cada vez mais disseminada. Associada a esse processo está a contaminação por microrganismos, dentre os quais se destacam as bactérias do gênero Mycoplasma spp., os quais são os contaminantes detectados com maior frequência in vitro. Um dos pontos críticos no processo de garantia da qualidade, pureza e segurança para uso destas células é a adoção de uma metodologia analítica, para detecção de Mycoplasma spp., que seja simples e de rápida execução, com sensibilidade e especificidade adequada e economicamente viável. O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma plataforma molecular (PCR em tempo real) para detecção de Mycoplasma spp. em culturas celulares. Para tanto, foram testados diversos conjuntos de primers (gene 16S rDNA) dentre os quais um foi selecionado para a plataforma molecular. Foram utilizadas amostras de DNA obtidas a partir do sobrenadante de cultura. A PCR em tempo real in house foi padronizada utilizando o intercalante fluorescente de DNA dupla fita BRYT Green® e produziu um fragmento de 270 pares de bases. A temperatura de melting para as amostras positivas foi definida no intervalo de 81 a 84°C. A plataforma molecular foi validada por meio dos parâmetros sensibilidade analítica e diagnóstica, especificidade analítica, potencial de arraste, precisão e robustez. O limite de detecção do teste (LOD) foi de 5 cópias/5 ?L. Para a especificidade, foi observada reação cruzada com bactérias de relação filogenética próxima e com DNA de célula humana. A sensibilidade diagnóstica foi de 100%. Não foi houve contaminação por arraste. O coeficiente de variação encontrado no parâmetro precisão foi de 0,64% e 1,80% para a avaliação intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente. O coeficiente de variação da análise robustez foi de 5,42%. Ao comparar a plataforma molecular com o teste comercial, observou-se que 29,85% (n=40) das amostras apresentaram resultados falso-negativos pelo teste comercial. Determinou-se ainda que a PCR em tempo real in house foi mais sensível do que o teste comercial. A análise por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de estruturas sugestivas de espécies de Mycoplasma spp. na superfície das células. A análise filogenética permitiu a classificação das espécies encontradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram propor o algoritmo para aplicação de um método de detecção simples e rápido para Mycoplasma spp.; e fazer deste uma ferramenta para o controle de qualidade das células cultivadas, garantindo a eficiência destas células para uso em pesquisa e maior segurança para uso em terapia celular. / The culture of human cells for experimental and therapeutic purposes has been consolidated as one of the foundations of cell biology and has increasingly become a widely used laboratory practice. The contamination by microorganisms is associated with this process, among them we can highlight bacteria of the genus Mycoplasma spp., which are contaminants more frequently detected in vitro. One of the critical points in the process of assuring quality, purity, and safety for the use of these cells is the adoption of an analytical methodology for the detection of mycoplasma that is simple and fast to conduct, with proper sensitivity and specificity and that is also economically viable. The objective of this work was to develop a molecular platform (real time PCR) for the detection of mycoplasmas in cell cultures. Therefore, we tested several sets of primers (16S rDNA gene), among them one was selected for the molecular platform. DNA samples used were obtained from the culture supernatant. In house real time PCR was standardized using BRYT Green® double-stranded DNA intercalating fluorescent and produced a fragment of 270 pair bases. The melting temperature for the positive samples was set in the range 81 to 84°C. The molecular platform was validated through the parameters: analytical and diagnostic sensitivity, analytical specificity, carry-over contamination, precision and robustness. The limit of detection of the test (LOD) was 5 copies/5 ?L. For specificity, it was observed a cross reaction with bacteria of close phylogenetic relationship and with human cell DNA. Diagnostic sensitivity was 100%. There was no carry-over contamination. The coefficient of variation was found in the precision values of 0.64% and 1.80% for intra-assay and inter-assay assessment, respectively. The variance coefficient of the robustness analysis was 5.42%. By comparing the molecular platform with the commercial test, we observed that 29.85% (n=40) of the samples showed false negative results by the commercial test. It has been determined further that the real-time PCR in house was more sensitive than the commercial test. The analysis by scanning electron microscopy demonstrated the presence of suggestive structures of Mycoplasma spp. species in the surface of cells. Phylogenetic analysis allowed the classification of the species found. The results obtained in this work allowed us to propose the algorithm for application of a simple and fast method for mycoplasma detection and making from this tool for quality control for cultured cells, assuring the efficiency of these cells for use in research and greater safety for use in cell therapy more safety to patients subjected to cell therapy.

Respiratory diseases in cattle can cause economic losses due to the decreased dairy and meat production. Virus is the main reason for these diseases. Symptoms can be fever, cough and nasal discharge.     Influenza are a group of viruses belonged in the Ortomyxoviridae family. The big influenza groups are influenza A, B and C. The viruses can cause respiratory signs, and mammals can be affected. Recently a new influenza virus was found in the United States. The influenza virus was found in swine, but the natural host was later considered to be cattle. The virus was named influenza D. Different studies worldwide have confirmed the virus in a variety of regions. Antibodies have also been reported.     In this study, virologic and serologic methods were used to detect if influenza D circulates among cattle in Sweden. The serologic method performed was indirect ELISA. Serum and milk samples were investigated in the ELISA method. For the virologic detection a real-time RT-PCR was made, with a variety of study material.     Antibodies against influenza D were found in both serum and milk samples. No virus was found in the real-time RT-PCR. In Sweden the animal keeping is different compared to several other nations. For instance, the conditions of health and hygiene are better in Sweden, this may be an important cause of a system more resistant against spreading of infections. Influenza D could be more common in Sweden, but in that case further researches are needed to determine the prevalence.