COSTA, Arinice de Menezes. Estudo do mecanismo de ação citotóxica de naftoquinonas sintéticas análogas do lapachol. 2012. 77 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-18T12:53:39Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_amcosta.pdf: 1261591 bytes, checksum: cb70244764d2c30a04fab04291c4bf53 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-18T12:54:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_amcosta.pdf: 1261591 bytes, checksum: cb70244764d2c30a04fab04291c4bf53 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-18T12:54:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_amcosta.pdf: 1261591 bytes, checksum: cb70244764d2c30a04fab04291c4bf53 (MD5) Previous issue date: 2012 / The lapachol, one naphthoquinone natural, and its derivatives synthetic have demonstrated, in recent years, important actions cytotoxic against several lineages of tumor cells, well as signifier antitumoral activity against some tumors. Thus, the objective this work was to evaluate the mechanisms of action cytotoxic in cells HL-60 of two naphthoquinones synthetic analogous of lapachol (compounds 1 and 2). Initially was investigated at antiproliferative activity these naphthoquinones after a incubation period of 72 hours in leukemic cells (HL-60) and peripheral blood mononucleated cells (PBMC) where was observed that these naphthoquinones were active for these lines with IC50 of 12 µM , 2.3 µM and 4.3 µM for the lapachol, compound 1 and compound 2, respectively in cells HL-60 and 13.7 µM and 34.0 µM for compound 1 and 2 in cells PBMC, respectively. The antiproliferative activity in cells HL-60 after 24 hours incubation was evaluated with and without co-treatment with the antioxidant n-acetylcysteine (NAC). Thus, IC50 without NAC after 24 hours of exposure to lapachol, compound 1 and compound 2 was 42.9 µM, 2.7 µM and 4.3 µM, respectively. Have IC50 with NAC (5 µM) after 24 hours of exposure to lapachol, compound 1 and compound 2 was 180.0 µM, 46.0 µM and 18.0 µM, respectively. Studies done in HL-60 cells indicated that the lapachol and its two analogues induce cell death by apoptosis and necrosis, as shown by morphological changes evaluated through the use of staining May-Grünwald-Giemsa. In trials realisados by flow cytometry was revealed that these compounds promote the generation of reactive oxygen species (ROS) 18.86%, 13.31% and 39.11% respectively for the lapachol (82 µM) and compounds 1 and 2 (3,5 µM) and 40.94% and 60.49% for the compounds 1 and 2 (7.0 µM), respectively. The lapachol (82 µM) and the compounds 1 and 2 (3.5 µM) decreased the number of cells with intact membrane 26.51%, 34.78% and 29.58% respectively and the compounds 1 and 2 (7, 0 µM) decreased 75.3% and 71.1%, respectively. The DNA fragmentation promoted by such compounds was observed starting from 3 hours of exposure being more intense after 24 hours of exposure to tested compounds. The lapachol and the compounds 1 and 2 also promoted the activation of caspases related to intrinsic pathway of cell death. Furthermore, showed induce the synthesis of DNA strands. All cytotoxic effects were abolished when the compounds 1 and 2 were co-incubated with the NAC, showing thus the participation ROS in cytotoxicity these naphthoquinones. / O lapachol, uma naftoquinona natural, e seus derivados sintéticos têm demonstrado, nos últimos anos, importantes ações citotóxicas contra varias linhagens de células tumorais, assim como significante atividade antitumoral contra alguns tumores. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o mecanismos de ação citotoxica em células HL-60 de duas naftoquinonas sintéticas análogas do lapachol (compostos 1 e 2). Inicialmente foi investigado a atividade antiproliferativa dessas naftoquinonas após um período de incubação de 72h em células leucêmicas (HL-60) e células mononucleadas do sangue periférico (CMSP) onde foi observado que essas naftoquinonas mostraram-se ativas para estas linhagens com CI50 de 12 µM, 2,3 µM e 4,3 µM para o lapachol, composto 1 e composto 2, respectivamente em células HL-60 e 13,7 µM e 34,0 µM para o composto 1 e 2 em células CMSP, respectivamente. A atividade antiproliferativa em células HL-60 após 24 horas de incubação foi avaliada com e sem co-tratamento com o antioxidante n-acetilcisteína (NAC). Assim, a CI50 sem NAC após 24 horas de exposição ao lapachol, composto 1 e composto 2 foi de 42,9 μM, 2,7 µM e 4,3 µM , respectivamente. Já CI50 com NAC (5 µM) após 24 horas de exposição ao lapachol, composto 1 e composto 2 foi de 180,0 μM, 46,0 µM e 18,0 µM , respectivamente. Estudos feitos em células HL-60 indicaram que o lapachol e seus dois análogos induzem morte celular por apoptose e necrose, como mostrado pelas mudanças morfológicas avaliadas através do uso de coloração May-Grünwald-Giemsa. Nos ensaios realisados por citometria de fluxo foi revelado que estes compostos promovem a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) 18,86%, 13,31% e 39,11% respectivamente para o lapachol (82 µM) e compostos 1 e 2 (3,5 µM) e 40,94% e 60,49% para os compostos 1 e 2 (7,0 µM), respectivamente. O lapachol (82 µM) e os compostos 1 e 2 (3,5 µM) diminuíram o número de células com membrana íntegra 26,51%, 34,78% e 29,58% respectivamente e os compostos 1 e 2 (7,0 µM) diminuíram 75,3% e 71,1%, respectivamente. A fragmentação do DNA promovida por esses compostos foi observada a partir de 3 horas de exposição sendo mais intensa após 24 horas de exposição aos compostos testados. O lapachol e os compostos 1 e 2 também promoveram a ativação de caspases relacionadas com a via intrínseca de morte celular. Além disso, mostraram induzir a quebra de fitas de DNA. Todos os efeitos citotóxicos foram abolidos quando os compostos 1 e 2 foram co-incubados com o NAC, mostrando, dessa forma, a participação de EROs na citotóxicidade destas naftoquinonas.

CAVALCANTI, Bruno Coêlho. Avaliação in vitro do potencial citotóxico de derivados arilaminados nor-ß-lapachônicos : estudos de mecanismo de ação. 2010. 171 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-24T15:59:29Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-30T14:17:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T14:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_bccavalcanti.pdf: 2020949 bytes, checksum: c9344957598760434a28f59fbd863a7a (MD5) Previous issue date: 2010 / The search for new cytotoxic derivatives of nor-β-lapachone is part of a growing and continuous search for new active compounds. The present study aimed to evaluate the cytotoxic potential of four arylamino-nor-β-lapachone derivatives (1-4) and the probable mechanism involved in the cytotoxicity of these compounds. Among the tested derivatives, only three of them (1, 3 and 4) and the precursor molecule elicited a significant antiproliferative effects in all human tumor cell lines used in the study. In experiments with peripheral blood mononuclear cells (PBMC), nor-β-lapachone did not induce cytotoxicity, however its derivatives showed antiproliferative effects whose intensity ranged from moderate to weak, with IC50 values equal to 5.02 µM (1), 12.02 µM (3) and 10.65 µM (4). Moreover, all the compounds showed no hemolytic effects (EC50> 219.29 µM). Nor-β-lapachone and its derivatives (1, 3 and 4) induced apoptosis (mitochondrial pathway) in HL-60 cells, based upon morphological and flow cytometric analysis, and interference on HL-60 cell cycle progression, only at the highest concentration (4 µM). Compounds exposure induced intracellular ROS generation, as well as DNA strand breaks in HL-60 (NQO1−) and DU-145 (NQO1+) cell lines. The co-administration of GSH reduced the cellular sensibility to the toxic effects of the studied compounds. Unlike cells pre-treated with BH (glutathione depletor agent), cells pre-exposed to antioxidants agents (NAC or KI) showed low production of free radicals. On the other hand, dicoumarol (NQO1 inhibitor) prevented the ROS formation and DNA strand breaks only in DU-145 cells, indicating that these compounds can be metabolized by other reductases than NQO1. The DNA damage induced by nor-β-lapachone and its derivatives (1, 3 and 4) in DU-145 cells were partially repaired after 24 h, which agrees with the data of unscheduled DNA synthesis. In addition, all active compounds interfere with DNA repair processes of DNA damage induced by MMS, indicating that this action contributes to compounds cytotoxic effects. All active compounds inhibited the proliferation rate of S. cerevisiae strains defective in the expression of DNA topoisomerases (Top1Δ, Top3Δ and Top1ΔTop3Δ) more pronounced than that observed in wild type strain (BY4741), suggesting that the interference on topoisomerases activities may contributes to the cytotoxicity of active compounds. Genotoxicity and mutagenicity studies with Chinese hamster lung fibroblast cell line (V79), showed that all cytotoxic compounds promoted DNA strand breaks, DNA bases oxidation and micronucleus formation in a concentration (10 µM) far higher than needed to induce the same events in tumor cells. Strengthening the ROS contribution on the mutagenic events, the pre-treatment with NAC prevented the formation of micronucleated cells and reduced the V79 cell sensibility to the cytotoxic effects of the studied compounds. These findings underscore the antitumor properties of nor-β-lapachone and its arylamino derivatives and they can be considered as prototypes for the development of new anticancer agents. / A busca por novos derivados citotóxicos da nor-β-lapachona é parte de uma crescente e contínua busca por novos compostos ativos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de quatro derivados arilaminos (1-4) da nor-β-lapachona e os prováveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade da nor-β-lapachona e de seus derivados. Três derivados (1, 3 e 4) e seu precursor apresentaram elevado potencial citotóxico sobre todas as linhagens celulares tumorais humanas utilizadas. Em estudos com células não tumorais (CMSP), a nor-β-lapachona não induziu citotoxicidade, porém seus derivados apresentaram efeitos antiproliferativos, cuja intensidade variou de moderado a fraco com valores de CI50 iguais a 5,02 µM (1), 12,02 µM (3) e 10,65 µM (4). Além disso, os compostos não apresentaram efeitos hemolíticos (EC50 > 219,29 µM). Tanto a nor-β-lapachona quanto seus derivados (1, 3 e 4) induziram apoptose (via mitocondrial) em células HL-60, como observado através dos ensaios de análises morfológicas e de citometria de fluxo, e distúrbios sobre a progressão do ciclo celular de células HL-60, apenas na maior concentração (4 µM). O tratamento com os compostos induziu a formação de EROS, assim como quebras das fitas da molécula de DNA em células HL-60 (NQO1−) e DU-145 (NQO1+). A co-administração de GSH reduziu a sensibilidade celular aos efeitos tóxicos dos compostos estudados, e o pré-tratamento com agentes antioxidantes (NAC e IK) reduziu drasticamente a produção de radicais livres, o mesmo não ocorrendo com culturas pré-tratadas com BH (agente depletor de GSH). Porém, o dicumarol (inibidor de NQO1) preveniu a formação de EROS e os efeitos genotóxicos apenas na linhagem DU-145, indicando que esses compostos possam ser metabolizados por outras redutases que não a NQO1. As lesões ao DNA de células DU-145 promovidas pela nor-β-lapachona e seus derivados (1, 3 e 4) foram, parcialmente, reparadas após um período de tempo de 24 horas, o que corrobora com a síntese não programada de DNA detectada após a exposição a esses compostos. Além disso, todos os compostos ativos interferiram sobre os processos de reparo dos danos ao DNA induzidos pelo MMS, o que indica que a interferência sobre esses processos contribui para seus efeitos citotóxicos. A nor-β-lapachona e seus derivados arilaminos (1, 3 e 4) inibiram a taxa de proliferação de cepas de S. cerevisiae defectivas na expressão de topoisomerases (Top1Δ, Top3Δ e Top1ΔTop3Δ) de maneira mais pronunciada do que observado na cepa selvagem (BY4741), indicando que a interferência sobre a atividade das topoisomerases influencia, de algum modo, a citotoxicidade desses compostos. Nos estudos de genotoxicidade e mutagenicidade com fibroblastos de pulmão de hamster chinês (linhagem V79), todos os compostos citotóxicos promoveram quebras nas fitas de DNA, oxidação de bases nitrogenadas e indução de micronúcleos, em concentração (10 µM) muito superior do que as necessárias para induzir os mesmos eventos em células tumorais. Reforçando a participação de EROS sobre os eventos mutagênicos, o pré-tratamento com NAC preveniu a formação de células micronucleadas e reduziu a sensibilidade celular aos efeitos tóxicos dos compostos estudados. Esses resultados ressaltam as propriedades antitumorais da nor-β-lapachona e seus derivados arilaminos e que eles podem ser considerados como protótipos para o desenvolvimento de novos agentes anticâncer.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Metalúrgica e de Materiais. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-04-12T19:15:01Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-12T19:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoEstresseOxidativo.pdf: 1980670 bytes, checksum: 2712926e3f6121cef3cc34dcc87aa1fc (MD5) Previous issue date: 2016 / O Mayaro virus (MAYV) é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Em humanos, o MAYV causa a Febre Mayaro, doença que apresenta sintomas parecidos com a dengue e outras arboviroses, com exceção das artralgias e artrites persistentes, que são sintomas característicos da infecção pelos Alphavirus. Embora a Febre Mayaro seja importante em termos de saúde pública, os mecanismos que contribuem para a sua patogênese ainda são pouco elucidados. Neste contexto, trabalhos da literatura têm demostrado que o estresse oxidativo pode contribuir para a patogênese de muitos vírus. O estresse oxidativo é um estado de desregulação da sinalização e do controle redox, onde ocorre um desequilíbrio entre a produção de "Espécies Reactivas de Oxigênio" (EROs) e ação do sistema de defesa antioxidante, levando a danos celulares. Os principais antioxidantes enzimáticos são a Superóxido Dismutase (SOD) e Catalase (CAT), e entre os não-enzimáticos, a Glutationa (GSH). Assim, uma vez que são poucos os trabalhos na literatura pautando a patogênese do MAYV e que o estresse oxidativo pode ser fator chave no estabelecimento/progressão de uma variedade de doenças virais, a proposta desse trabalho foi investigar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo MAYV, e se esse evento está relacionado à produção exacerbada de EROs e/ou a alteração nas defesas antioxidantes. Para tal, macrófagos foram utilizados desde que são importantes células envolvidas no estabelecimento da artrite induzida por alfavírus. Macrófagos murinos J774 foram infectados com uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 e em diferentes horas pós infecção (hpi) foram avaliados parâmetros oxidantes e antioxidantes nas células. A infecção aumentou a produção de EROs, a atividade da SOD e expressão das enzimas SOD e CAT, mas reduziu o conteúdo de Glutationa total. Níveis aumentados de Malondialdeído (MDA), um biomarcador de peroxidação lipídica, foram encontrados em células infectadas com o MAYV. Ainda, em células infectadas, a expressão do RNAm da citocina Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α) aumentou nos tempos iniciais após a infecção. Seguida a maior indução de TNF-α, observamos também em células infectadas pelo MAYV um aumento na expressão gênica da Mataloproteinase de Matriz 3 (MMP-3), cujo papel no dano articular já foi observado na infecção por outros alfavírus. Juntos, nossos resultados sugerem que uma alteração no status redox após infecção pelo MAYV leva as células ao estresse oxidativo e seus efeitos deletérios para a células hospedeiras. Estes resultados apontam para novas abordagens na compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese da infecção pelo MAYV. ______________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : Mayaro virus (MAYV) is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. In human beings, the MAYV causes the Mayaro Fever, disease that presents symptoms similar to the dengue and others arboviruses, with an exception of the persistent arthralgia and arthritis, which are characteristic symptoms of the infection caused by the Alphavirus. Although the Mayaro Fever is more important in terms of public health, the mechanisms that contribute of the pathogenesis are still unknown. In this context, studies have shown that oxidative stress may contribute to the pathogenesis of many virus. The oxidative stress is a state of deregulation of the redox signaling and control, where there is an imbalance between the production of “reactive oxygen species" (ROS) and action of the antioxidant defense systems, leading to cellular damage. The main enzymatic antioxidant are the Superoxide Dismutase (SOD), and Catalase (CAT), and among the non-enzyme, the Glutathione (GSH). Therefore, there is little information regarding the pathogenic characteristics of MAYV, and considering that the oxidative stress may be a key factor in the establishment/progression of a variety of viral diseases, the purpose of this study was to examine the involvement of oxidative stress in infection by MAYV. We also analyzed if this event is related to the excessive production of ROS and/or changes in antioxidant defenses. Macrophages were used once that they are important cells involved in the establishment of the alphavirus-induced arthritis. The murine macrophages were infected with a multiplicity of infection (moi) of 5 and at different times post infection (pi) were evaluated parameters oxidants and antioxidants. The infection increased the production of ROS, the activity of SOD and expression of SOD and CAT, but decreased the content of total glutathione. In cells infected with MAYV, were found elevated levels of Malondialdehyde (MDA), a biomarker of lipid peroxidation. In addition, in infected cells, the expression of mRNA of cytokine Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) increased in the inicial hours pi. We also observed in infected cells by MAYV an increased in the gene expression that matrix metalloproteinase 3 (MMP-3), which role in the articular damage has been already observed in the infection by others Alphavirus. Our results suggest that an alteration in the redox status after the infection by MAYV leads the cells to the oxidative stress and its effects deleterious for the host cells. These results show new approaches in the comprehension of mechanisms involved in the pathogenesis of the infection by the MAYV.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial. / Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

As nitrorredutases compreendem uma família de proteínas conservadas evolutivamente e originalmente identificadas em eubactérias. São enzimas capazes de catalisar a redução do grupo nitro e utilizam FMN (flavina mononucleotideo) ou FAD (flavina adenina dinucleotídeo oxidado) como grupo prostético e NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) ou NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido) como agentes redutores. As nitrorredutases podem ser encontradas em bactérias e em menor extensão em eucariotos. Dois subgrupos de nitrorredutases foram caracterizados em bactérias: oxigênio-insensível ou tipo I e oxigênio-sensível ou tipo II. Na levedura Saccharomyces cerevisiae duas prováveis nitrorredutases, Frm2p/Hbn1p foram identificadas. Em relação às enzimas pertencentes à família das nitrorredutases não se tem conhecimento sobre a sua função biológica, bem como em relação à sua posição filogenética. Tendo isso em vista, o objetivo deste trabalho é esclarecer a possível função das proteínas Frm2 e Hbn1 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao estresse oxidativo, bem como determinar a posição filogenética e a sua presença em outros organismos procariotos e eucariotos. Os resultados da análise filogenética mostram que bactérias possuem seqüências similares a Frm2p/Hbn1p (denominadas Nr1Ap) que formam um clado distinto dentro da família Frm2p/Hbn1p. Análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA) e modelagem tri-dimensional foram realizadas para comparar regiões conservadas entre proteínas Nr1Ap e Frm2p/Hbn1p. A nitrorredutase Frm2p possivelmente esteja atuando na via de sinalização lipídica, enquanto a função da Hbn1p é desconhecida. Entretanto, alguns estudos têm indicado que as nitrorredutases podem estar envolvidas na resposta a estresse oxidativo. Com o objetivo de esclarecer a função de Frm2p e Hbn1p, foi avaliada a sensibilidade de linhagens de levedura proficientes e deficientes em ambas proteínas ao estresse oxidativo, investigando a competência respiratória, as atividades de enzimas antioxidantes, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a peroxidação lipídica. Os resultados mostram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e Nnitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de EROs e peroxidação lipídica quando expostas a estes agentes geradores de superóxido nas linhagens frm2 , hbn1 e frm2 hbn1 . Ainda podemos observar elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de EROs e peroxidação lipídica quando expostas aos agentes geradores de peróxidos H2O2 e t-BOOH. Isso sugere que a ausência da Frm2p é o fator responsável por estas alterações vistas. Portanto, neste trabalho foi mostrada a influência das nitrorredutases Frm2 e Hbn1 na resposta ao estresse oxidativo em S. cerevisiae, pela modulação da atividade das enzimas antioxidantes, SOD, CAT e GPx, bem como do conteúdo de GSH. Adicionalmente também foi constatado que as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p provavelmente não atuam na metabolização de nitrocompostos. Estes resultados são consistentes com os dados encontrados na análise filogenética, que apontam estas proteínas como constituindo uma nova família de prováveis nitrorredutases ainda não caracterizada, encontrada em bactérias e fungos. / The nitroreductase family comprises a group of FMN (flavine mononucleotide) ou FAD (flavine adenine dinucleotíde oxidade)-dependent enzymes able to metabolize nitrosubstituted compounds using the reducing power of NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfate reduzide) or NADH (nicotinamide adenine dinucleotide reduzide). The nitroreductases can be found within bacterial species and, in a less extend, in eukaryotes. Two types of nitroreductase subgroups were characterized in bacteria: oxygen-insensitive or type I and oxygen sensitive or type II. In the yeast Saccharomyces cerevisiae two putative nitroreductase proteins, Frm2p and Hbn1p, were described. A feature of the nitroreductase family is our lack of knowledge about its biological function and evolutionary history. Taking into account these considerations, the purpose of this work was to elucidate the possible participation of these enzymes in response to oxidative stress as well as to determine the phylogenetic position of Frm2p and Hbn1p and the presence of homologous sequences in other prokaryotic and eukaryotic species. In order to obtain data about the phylogenetic position of Frm2p/Hbn1p, we performed an in-depth phylogenetic analysis of these proteins. The phylogenetic analysis of these proteins showed that bacterial cells have a Frm2p/Hbn1p-like sequences (termed NrlAp) which form a distinct clade within the fungal Frm2p/Hbn1p family. Hydrophobic cluster analysis (HCA) and three-dimensional protein modeling allowed us to compare conserved regions among NrlAp and Frm2/Hbn1p proteins. While Frm2p appears to act in the lipid signaling pathway, the function of Hbn1p is unknown. However, some works suggests a possible involvement from the nitroreductases in response the stress oxidative. In order to elucidate the functions of Frm2p and Hbn1p, we evaluate the sensitivity of proficient and deficient yeast strains for both proteins for oxidative stress, considering the respiratory competence, antioxidant enzyme activities, intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation. The results showed a weaker basal activity of superoxide dismutase (SOD) and higher sensitivity for 4-nitroquinoline-oxide (4-NQO) and NNitrosodiethylamine (NDEA), induction of petites, ROS production and lipid peroxidation when exposed the these superoxide generating agents. The results showed a higher basal activity of catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and reduced glutathione (GSH) content in the single and double mutant strains frm2 and frm2 hbn1 . These strains were less ROS-producing and lipid peroxidation when exposed to peroxides-generating agents H2O2 and t-BOOH. Thus, the absence of Frm2p may be the event responsible for these alterations. Considering the data gathered in this work, we showed the influence of nitroreductases Frm2p and Hbn1p in response to oxidative stress in S. cerevisae yeast by modulation of antioxidant enzymes activities, such as SOD, CAT, GPx and GSH content. Additionally, it was showed that the nitroreductases Frm2p and Hbn1p are not envolved in the activation of nitrocompounds. Theses results are consistent with those found in the filogenetic analysis that indicated that theses proteins belong to the new bacterial and fungal Frm2p/Hbn1p nitroreductase-like family.

MASULLO, L, F, Avaliação do estresse oxidativo em mulheres diagnosticadas com hipotireoidismo primário. 2017. 76 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-04-24T13:26:02Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_lfmasullo.pdf: 1370113 bytes, checksum: dcfd93f496ba61f155aaee5e8531ba1a (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-04-24T13:26:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_lfmasullo.pdf: 1370113 bytes, checksum: dcfd93f496ba61f155aaee5e8531ba1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T13:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_lfmasullo.pdf: 1370113 bytes, checksum: dcfd93f496ba61f155aaee5e8531ba1a (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / Thyroid hormones regulate the body metabolism, with changes in cellular oxygen usage profile. As a result, there may be production of reactive oxygen species that induce oxidative stress and cellular dysfunction in various tissues. The study aims to evaluate the levels of oxidative stress in women diagnosed with primary hypothyroidism. The study included 25 female patients from the Endocrinology Clinic of the University Hospital Walter Cantídio (HUWC) in Fortaleza, Ceará, with primary hypothyroidism. Blood samples of patients were collected in the hypothyroid condition and euthyroid. We evaluated the thyroid hormone function, biochemical and haematological profile of patients, beyond the parameters of oxidative stress from measurements of malondialdehyde, nitrite/nitrate, superoxide dismutase and catalase. We observed a significant reduction of total cholesterol, HDL, LDL and triglycerides and leukocytes after correction of hypothyroidism. In relation to oxidative stress, there was a significant reduction of catalase activity (50,12 ±12,75 vs 63,77 ± 23,8 atv/min; p = 0.03) when we compared two moments. There was no change in nitrite / nitrate concentration (p = 0.18), malonaldehyde (p = 0.67) and superoxide dismutase activity (p = 0.93) when we analyzed the whole group. There was no significant difference in the concentration of malonaldehyde in both situations (P = 0.67). The concentration of nitrite / nitrate was increased in cases of hypothyroidism with metabolic syndrome (34.07 ± 10.89 Vs 30.12 ± 10.12, p = 0.03). These data suggest that hypothyroidism alters oxidative stress, and catalase activity is the most sensitive marker. When hypothyroidism occurs with metabolic syndrome, NO levels increase, suggesting different mechanisms in oxidative stress in these two clinical conditions. / Os hormônios tireoidianos regulam o metabolismo corporal, com mudança no perfil de utilização de oxigênio celular. Como consequência, pode ocorrer a produção de espécies reativas de oxigênio que induzem o estresse oxidativo e disfunções celulares em diversos tecidos. O estudo tem como objetivo avaliar os níveis de estresse oxidativo em mulheres diagnosticadas com hipotireoidismo primário. Participaram do estudo 25 pacientes do sexo feminino, atendidas no ambulatório de Endocrinologia do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) em Fortaleza-Ceará, com hipotireoidismo primário. As amostras de sangue dos pacientes foram coletadas na condição de hipotireoidismo e em eutireoidismo. Avaliou-se a função hormonal tireoideana, o perfil bioquímico e hematológico dos pacientes, além dos parâmetros do estresse oxidativo a partir das dosagens de malonaldeído, nitrito/nitrato, catalase e superóxido dismutase. Observamos redução significativa do colesterol total, LDL e triglicérideos após a correção do hipotireoidismo. Em relação ao estresse oxidativo, houve aumento da atividade da catalase (50,25 ± 12,75 vs 63,77 ± 23,8 atv/min; p = 0,03) quando comparamos os dois momentos. Não houve alteração no nitrito/nitrato (p=0,18), malonaldeído (p=0,67) e na atividade da superóxido dismutase (p=0,93) quando analisamos o grupo inteiro. A concentração de nitrito/nitrato estava aumentada nos casos de hipotireoidismo com síndrome metabólica (34,07 ± 10,89 vs 30,12 ±10,12; p=0,03). Esses dados sugerem que o hipotireoidismo altera o estresse oxidativo, sendo que a atividade da catalase é o marcador mais sensível. Quando o hipotireoidismo está associado à síndrome metabólica, os níveis de NO aumentam, o que sugere mecanismos diferentes no estresse oxidativo nessas duas condições clínicas.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / A tolerância ao lipopolissacarídeo (LPS) ocorre quando animais e células expostas ao LPS tornam-se hiporesponsivas a uma subseqüente dose de LPS. Acredita-se que esse mecanismo esteja envolvido na diminuição da resposta celular observada em pacientes com sepse grave e choque séptico. O objetivo do estudo foi avaliar a indução da tolerância em monócitos de voluntários sadios, em sangue total, após a exposição in vitro ao LPS, medido pela detecção de citocina intracelular e espécies reativas de oxigênio (EROs). Material e métodos: As células do sangue periférico foram condicionadas com pequenas dses de LPS por 18h e desafiadas com diferentes agonistas dos Toll-like receptors (lipopeptídeo ativador de macrófagos (MALP-2), flagelina e LPS) e bactérias gram-negativa (Pseudomonas aeruginosa) e gram-positiva (Staphylococcus aureus) mortas por calor ou condicionadas com pequenas doses de MALP-2 por 18h e desafiadas com MALP-2 ou LPS. Para detecção da interleucina-6 (IL-6) intracelular, amostras de sangue total foram estimuladas por 6h. Os monócitos foram identificados pelos parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral e positividade para CD14. As amostras foram marcadas para a verificação da produção de IL-6 intracelular nos monócitos por citometria de fluxo. Para indução de EROs, o sangue total foi estimulado por 30 minutos com LPS, P. aeruginosa, S. aureus. A produção de espécies reativas de oxigênio foi medida por citometria de fluxo pela detecção do 2’,7’ diclorofluoresceína-diacetato. Resultados: O condicionamento com doses crescentes de LPS resultou em menor detecção de IL-6 intracelular nos monócitos após desafio com LPS. Efeito similar foi observado com MALP-2, P. aerugionosa, S. aureus, mas não com a flagelina. O condicionamento com MALP-2 e desafio com MALP-2 ou LPS não resultou em menor detecção de IL- 6 intracelular nos monócitos. O condicionamento com 15ng/mL de LPS, por outro lado, resultou numa produção de EROs preservada ou aumentada nos monócitos após o desafio com LPS, P. aeruginosa, S. aureus. Conclusão: O fenômeno da tolerância envolve uma regulação complexa, na qual a produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-6, está diminuída, enquanto a produção de EROS está preservada ou até aumentada. / Tolerance to lipopolyssacharide (LPS) occurs when animals or cells exposed to LPS become hyporesponsive to a subsequent challenge of LPS. This mechanism is believed to be involved in the down-regulation of cellular responses observed in patients with severe sepsis and septic shock. The aim of this investigation was to evaluate the induction of tolerance in monocytes of healthy volunteers, in whole blood, after LPS-exposition in vitro, assessed by intracellular cytokine detection and reactive oxygen species (ROS) generation. Material and Methods: Peripheral blood cells were conditioned with small doses of LPS for 18h and challenged with different agonists of Toll like receptors (Macrophage-activating lipopeptide-2 (MALP-2), Flagellin and LPS) and whole gram-negative (Pseudomonas aeruginosa) and gram-positive (Staphylococcus aureus) killed bacteria or conditioned with small doses of MALP-2 for 18h and challenged with MALP-2 or LPS. For detection of intracellular interleukin-6 (IL-6) samples of whole blood were stimulated for 6h. Monocytes were identified by forward scatter and side scatter parameters and CD14 positive staining. The samples were stained to verify the intracellular production of IL-6 on monocytes by flow cytometry. For induction of ROS, whole blood was stimulated for 30 minutes with LPS, P. aeruginosa and S. aureus. ROS production was measured by flow cytometry, using 2’,7’- dichlorfluorescein-diacetate detection. Results: The conditioning with increasing doses of LPS resulted in lower intracellular detection of IL-6 in monocytes after the challenge with LPS. Similar effect was observed with MALP-2, P. aeruginosa, and S. aureus, but not with Flagellin. The conditioning with MALP-2 and challenge with MALP-2 or LPS did not result in lower intracellular detection of IL-6 in monocytes. LPS conditioning with 15ng/mL of LPS, on the other hand, resulted in preserved or increased production of ROS in monocytes after challenge with LPS, P. aeruginosa and S. aureus. Conclusion: The phenomenon of tolerance involves a complex regulation, in which the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-6 is diminished, whereas the production of ROS is preserved or even increased. / BV UNIFESP: Teses e dissertações