Le canal calcique de type-L CaV1.2 participe au couplage excitation-contraction des cardiomyocytes. Cav1.2 est composé d’une sous-unité principale CaVα1, associée aux sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. Lorsque présente à la membrane, c’est CaVα2δ1 qui est responsable de moduler la densité du courant calcique. Elle ne possède qu’un seul segment transmembranaire présent du côté C-terminal, au niveau de la protéine δ, ce qui en fait une protéine transmembranaire de type I. Certaines protéines qui appartiennent à cette famille doivent être clivées au niveau du site dit « omega », une modification post-traductionnelle nécessaire à leur fonction. Une fois clivées, ces protéines sont retenues à la membrane plasmique par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). Nos études en microscopie confocale montrent que la protéine sauvage est sensible à l’action de la phospholipase C qui clive de manière spécifique les groupements phosphoinositol, ce qui est compatible avec la présence d’une ancre GPI fonctionnelle. De plus, la mutation des résidus formant le site « omega » en isoleucine au niveau des sites G1060 et G1061 prévient l’adressage membranaire de CaVα2δ1 estimé par cytométrie en flux et imagerie confocale, et réduit la modulation des courants calciques mesurés par la méthode du « patch-clamp ». Les mutants G1060I et G1061I sont aussi associés à un changement dans le patron de migration de la partie C-terminale, suggérant un processus protéolytique défecteueux. Les mutations simples des glycines en alanines préservent les propriétés de la protéine mais le double mutant G1060A/G1061A réduit significativement l’expression de CaVα2δ1 à la surface de la cellule et sa modulation sur le canal CaV1.2. Ces données suggèrent fortement que le clivage requiert spécifiquement un résidu Glycine en position 1060 ou 1061 pour produire le clivage protéolytique dominant chez CaVα2δ1, et que cet ancrage GPI est essentiel à la fonction du canal. / Voltage-gated calcium channels CaV1.2 play an essential role in the regulation of cardiac excitability. Functional channels are formed by the CaVα1 subunit and the intracellular CaVβ and the extracellular CaVα2δ1 subunits. CaVα2δ1 are type I transmembrane proteins that undergo a posttranslational modification producing their association at the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. The molecular determinants required for the proteolytic cleavage of the recombinant CaVα2δ1 protein were studied using biochemical, immunocytochemical, fluorescence, and electrophysiological methods. Enzymatic treatment with a phospholipase C specific for the cleavage of phosphatidyl inositol lipids abolished the colocalisation of CaVα2δ1 with a plasma membrane marker as shown using live-cell confocal imaging. Single point mutations G1060I or G1061I in the predicted transmembrane CaVδ domain was shown to significantly reduce the cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging, and to prevent the CaVα2δ1-mediated increase in the peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2 currents. The isoleucine mutations were also associated with a change in the migration pattern of the C-terminal fragments suggesting that proteolytic processing was altered. Single glycine to alanine mutations preserved the protein properties but the double mutant G1060A/G1061A significantly impaired cell surface expression of CaVα2δ1 and its functional regulation of CaV1.2. Altogether our data support a model where one Glycine residue at position 1060 or 1061 is required to produce the dominant proteolytic cleavage of CaVα2δ1 and further suggest that the GPI-anchored form of CaVα2δ1 is essential for channel function.

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L. / L-type CaV1.2 channels play a key role in the excitation-contraction coupling in the heart. They are formed of a pore-forming CaVα1 subunit in complex with the intracellular CaVβ and the disulfur-linked CaVα2δ accessory subunits. CaVα2δ significantly increases peak current densities of CaV1.2. The mechanism underlying this effect is still under study but requires that CaVα2δ be trafficked at the cell surface. CaVα2δ contains 16 putative N-glycosylation sites. A study was carried out to identify the role of N-glycosylation in the trafficking and protein stability of the subunit CaVα2δ. Herein we show that enzymatic removal of N-glycans produced a 50 kDa shift in the mobility of cardiac and recombinant CaVα2δ1 proteins. Simultaneous mutation of the 16 Asn sites was required to fully account for this change in protein mobility. Nonetheless, the mutation of only 6/16 sites was sufficient to 1) significantly reduce the steady-state cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging; 2) accelerate the degradation kinetics estimated from cycloheximide chase assays; and 3) prevent the CaVα2δ1-mediated increase in peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2. Reversing the N348Q and N812Q mutations in the non-operational 6 Asn mutant functionally rescued CaVα2δ1. Single mutation N663Q and double mutations N348Q/ N468Q, N348Q/ N812Q, N468Q/N812Q decreased protein stability/synthesis and abolished steady-state cell surface density as well as upregulation of L-type currents. These results demonstrate that Asn663, and to a lesser extent Asn348, Asn468, and Asn812 contribute to the stability of CaVα2δ1 function and furthermore that N- glycosylation of CaVα2δ1 is essential to produce functional L-type Ca2+ channels.

Transient transfection of mammalian cell lines is an effective approach for recombinant protein production, which can provide milligrams to grams of proteins in two weeks from cloning of the corresponding cDNA. Native glycosylated proteins prepared via this approach can be used for various purposes in molecular biology, immunology or pharmaceutical industry, i.e. initial phase of pre-clinical therapeutic protein research. One of the most used mammalian host cell lines is the human embryonic kidney cell line, that can be easily cultivated and chemically transfected. The amount of proteins produced by transiently transfected human embryonic kidney cells can be enhanced by a whole range of factors, i.e. co-expression or direct addition of acidic fibroblast growth factor to the culture medium, co-expression of cell cycle regulating proteins or anti-apoptotic proteins. Expression plasmid pTW5 was prepared and further modified by gene insertion of aFGF, cell cycle regulator p18, p21 or p27 (cyclin-dependent kinase inhibitors) or apoptosis inhibitor bcl-2 or bcl-x. These plasmids were then used for optimization of HEK293T cell line expression system. The impact of every single regulator and their combinations, including hitherto undescribed effect of combination of cell cycle regulator and anti-apoptotic...

Le Rovabio Excel ™ est un cocktail enzymatique complexe sécrété par le champignon filamenteux Penicillium funiculosum. La société ADISSEO commercialise cet additif alimentaire destiné à la nutrition animale car les principales enzymes qui le constituent dégradent les polymères contenus dans les céréales, tels que les polysaccharides non amylacés. Ainsi, le Rovabio Excel™ permet d’améliorer la digestibilité et d’augmenter la valeur nutritionnelle des matières premières agricoles en réduisant la viscosité du bol alimentaire des animaux. Dans le but d’augmenter sa compétitivité, ADISSEO a fait conduire des études sur cette solution pour la caractériser biochimiquement et optimiser son potentiel xylanolytique.Ces travaux de thèse s’inscrivent dans ces projets industriels et ont poursuivi deux objectifs distincts. Le premier correspondait à l’augmentation de la thermostabilité de la protéine XynB du Rovabio Excel™, pour lui permettre de résister à la granulation. Le second concernait XynA, la protéine majoritaire de la solution multienzymatique, qui a été caractérisée biochimiquement. Les premiers résultats de caractérisation biochimique de XynA ont montré que la protéine était 100 fois plus active sur β-1,4-glucane que sur xylane. Des tests complémentaires sur pNP-cellobiose et pNP-β-D-Lactopyranose ont révélé que XynA était 5,2 fois plus active sur pNP-cellobiose et possédait une activité « exo ». Enfin, l’analyse des produits d’hydrolyse d’oligosaccharides composés de 2 à 5 unités de glucose a confirmé que la protéine XynA était une cellobiohydrolase de type I, très sensible à l’inhibition par le cellobiose (IC50 - C2 = 17,7 µM). L’étude la thermostabilité de XynB a confirmé que cette protéine n’était pas naturellement thermostable. Les résultats des travaux d’ingénierie avec l’ajout d’un pont disulfure pour rigidifier la structure 3D de la protéine n’ont pas été probants. En revanche, la création de protéines chimères à partir de protéines plus thermostables (TfxA de Thermomonospora fusca et XynII de Trichoderma reesei) a permis d’améliorer la stabilité thermodynamique de XynB avec des Tm augmentés de plus de 10°C / The Rovabio Excel™ is a complex enzymatic cocktail secreted by the filamentous fungus Penicillium funiculosum. The ADISSEO company sells it as food additive for animal feed because the main enzymes degrade polymers contained in grains, such as non-starch polysaccharides. Thus, the Rovabio Excel™ improves the digestibility and increases the nutritional value of agricultural raw materials by reducing the viscosity of the diet of animals. In order to increase its competitiveness, ADISSEO did conduct studies on this solution to characterize it biochemically and maximize its xylanolytic potential.This thesis takes part of this industrial project and have pursued two distinct objectives. The first corresponds to the increase in the thermostability of the protein XynB from the Rovabio Excel™, to enable it to resist at the granulation process. The second was XynA, the major protein of the multienzyme solution, which was characterized biochemically.Initial results of biochemical characterization of XynA showed that the protein was 100 times more active on β-1,4-glucan on xylan. Additional tests on pNP-cellobiose and pNP-β-D-Lactopyranose revealed that XynA was 5.2 times more active on pNP-cellobiose and possess an "exo-acting" activity. Finally, the analysis of products from oligosaccharides hydrolysis, composed of 2 to 5 units of glucose, confirmed that the protein XynA was a type I cellobiohydrolase, very sensitive to inhibition by cellobiose (IC50-C2 = 17.7 µM).The thermostability of XynB study has confirmed that this protein was not thermostable naturally. The results of the engineering work with the addition of a disulfide bridge to rigidify the 3D structure of the protein were not conclusive. However, the creation of chimeric proteins with more thermostable proteins (TfxA from Thermomonospora fusca and XynII from Trichoderma reesei) has improved the thermodynamic stability of XynB with Tm increased by more than 10°C

6 Abstract Transcription factors play a key role in the management of cell growth and differ- entiation and their deregulation is associated with many cancers. TEAD proteins utilise highly conserved DNA binding domain to recognise specific DNA sequences. This domain could facilitate new drug design and development. The goal of this master thesis includes recombinant preparation of DNA binding domain of transcriptional factor TEAD4 extended by a part of an unstruc- tured variable sequence, which connects this domain with transactivation domain. Purification steps include affinity chromatography followed by size exclusion chro- matography. The characterization of produced protein was performed by mass spectrometry and finally, native gel electrophoresis was used to prove the ability of the produced protein to bind DNA. During purification steps, a fragmentation from C-terminus was observed. Based on analysis of the mass spectra, three most represented forms of produced protein were described all of which were fragmented. The most abundant form (55%) consisted of amino acids 30-131 from TEAD4 protein. Second most abun- dant form (18%) consisted of amino acids 30-144 and the third form consisted of amino acids 30-81. Native gel electrophoresis verified the ability to bind DNA, the efficiency was however lower...