Die Regulation von Effektor-T-Zellen ist ein wichtiger Mechanismus zur Kontrolle organspezifischer Entzündungen. Dabei sind regulatorische T-Zellen (Treg) maßgeblich an der Aufrechterhaltung peripherer Immuntoleranz und parenchymaler Immunhomöostase beteiligt. Eine neue Population von humanen, natürlich vorkommenden Treg Zellen wurde durch ihre konstitutive Expression des immuntolerogenen Moleküls HLA-G identifiziert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Mechanismen, durch die CD4+ HLA-Gpos Treg Zellen ihre Zielzellen (autologe HLA-Gneg T-Zellen) modulieren, aufgeklärt. Unter Verwendung eines Suppressionsansatzes in Abwesenheit von antigenpräsentierenden Zellen (APC) wurden T-T-Zell-Interaktionen, die die Proliferation von HLA-Gneg T-Zellen hemmen, demonstriert. Diese Suppression, die durch die Stimulierung des T-Zell-Rezeptors auf HLA-Gpos Treg Zellen verstärkt wurde, war unabhängig vom Zell-Zell-Kontakt. Die HLA-Gneg T-Zellen erlangten nach Entfernung der HLA-Gpos Treg Zellen und einer erneuten Stimulierung ihrer T-Zell- Rezeptoren ihre Fähigkeit zur Proliferation wieder. Dies wies auf die Umkehrbarkeit dieser Suppression hin. Darüber hinaus war die HLA-Gpos Treg-vermittelte Suppression entscheidend von der IL-10- Sekretion, nicht jedoch von TGF-β abhängig. Zusammengefasst beschreibt dieser Teil der Arbeit eine detaillierte Charakterisierung der Mechanismen, wie HLA-Gpos Treg HLA-Gneg TZellen supprimieren. Das tiefere Verständnis der Wirkmechanismen von HLA-Gpos Treg könnte in therapeutischen Strategien verwendet werden, in denen die regulatorische Funktion der T-Zell-Suppression verstärkt oder moduliert werden soll. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die potenzielle Rolle von HLA-Gpos Treg bei der Multiplen Sklerose (MS) untersucht, einer klassischen Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS). Im Gegensatz zu Vergleichspatienten mit nicht-entzündlichen Erkrankungen konnte im Liquor von MS Patienten eine erhöhte Anzahl von HLA-Gpos Treg gefunden werden. Diese aus dem Liquor isolierten HLA-Gpos Treg wiesen phänotypische Merkmale von zentralen Gedächtnis-T-Zellen (CD45RA- CD27+) auf, exprimierten den Aktivierungsmarker ICOS sowie deutlich höhere Level des Chemokinrezeptors (CCR) CCR5 und agierten als starke Suppressoren der autologen CD4+ T-Zellproliferation. Durch Verwendung eines in vitro Modells der humanen Bluthirnschranke konnte demonstriert werden, dass HLA-Gpos Treg eine starke Neigung zur Migration haben, die durch die CCR5- Liganden MIP1α und RANTES, nicht jedoch durch MIP3β (Ligand von CCR7) unterstützt wird. Diese Chemokin-induzierte Migration von HLA-Gpos Treg war auch mit einer Steigerung der suppressiven Kapazität nach Zelltransmigration assoziiert. Im Gegensatz zu CD4+CD25+, FoxP3-exprimierenden Treg zeigten HLA-Gpos Treg von MS-Patienten keine beeinträchtigte Funktionalität. Dies deutet auf eine selektive Rekrutierung von HLA-Gpos Treg zu Entzündungsherden im ZNS und ihre Beteiligung an der Bekämpfung der destruktiven Entzündung hin. Die Ergebnisse dieser Studien tragen zum weitergehenden Verständnis der Rolle und Funktion HLA-Gpos Treg Zellen bei und stellen somit ein wichtiges pathophysiologisches Beispiel „gutartiger“ T-Zell-Entzündung während der ZNS Autoimmunität dar, das sowohl aus pathophysiologischer als auch therapeutischer Sicht interessant ist. / Regulation of effector T cells is an important mechanism to control organ-specific inflammation. Thereby regulatory T cells (Treg cells) are essential for maintaining peripheral immune tolerance and for establishing parenchyma immune homeostasis. A novel population of natural human Treg characterized by the constitutive expression of the immune-tolerogenic human HLA-G molecule has been identified. In the first part of the study, we elucidated the mechanism(s) by which CD4+ HLA-Gpos Treg modulates their cellular targets namely autologous HLA-G negative responder T cells (HLAGneg Tresp). Using a suppression system free of antigen-presenting cells (APC), we demonstrate a T-T cell interaction resulting in suppression of HLA-Gneg Tresp. We could also show that this suppression was independent of cell-cell contact. Importantly, stimulus of T cell receptor (TCR) on HLA-Gpos Treg facilitated their suppressive capacity. We also observed that removal of HLA-Gpos Treg from the established co-cultures could restore the ability of HLA-Gneg Tresp to proliferate upon TCR re-stimulation, indicating that the suppression was reversible. Further, HLA-Gpos Treg–mediated suppression was critically depending on the secretion of IL-10 but not TGF-β. Taken together, this part of the work provides an in-depth characterization of the mechanisms of how HLA-Gpos Treg suppresses T responder cells in direct T-T interactions. Understanding the suppressive mechanism used by HLA-Gpos Treg may help to develop therapeutic strategies to modulate regulatory arms of T-cell suppression. In the second part of this study, the potential role of HLA-Gpos Treg in the pathophysiological process of Multiple Sclerosis (MS), a prototypic autoimmune inflammatory central nervous system (CNS), has been investigated. We found that HLA-Gpos Treg are enriched in the cerebrospinal fluid (CSF) from MS patients, but not in non-inflammatory controls. CSFderived HLA-Gpos Treg showed predominance of central memory (CD45RA-CD27+) phenotype, exhibited markers of activation (ICOS), and had significantly higher expression of the inflammatory chemokine receptor CCR5. Importantly, these cells demonstrated as potent suppressors to autologous CD4+ T-cell proliferation. Using an in vitro model of human blood brain barrier, we showed that HLA-Gpos Treg have a strong propensity to migrate, which could be facilitated by MIP1α and RANTES (ligands of CCR5) but not MIP3β (a ligand of CCR7). The HLA-Gpos Treg migration triggered by chemokines was also associated with a gain of suppressive capacity upon cellular transmigration. In contrast to CD4+CD25+ naturally occurring FoxP3-expressing Treg, HLA-Gpos Treg from patients with MS did not exhibit impaired function, suggesting that HLA-Gpos Treg are selectively recruited to the sites of CNS inflammation in an effort to combat destructive inflammation during MS. Our results contribute to the understanding of the role and function of HLA-Gpos Treg and provide an important example of “beneficial” T-cell inflammation in CNS autoimmunity- interesting both from a patho/-physiological and a therapeutically point of view.

Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die intestinale Immunhomöostase und Limitierung von (Auto)-Immunität. Sie exprimieren den Transkriptionsfaktor Foxp3 und an der Oberfläche die α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25). Im Tiermodell verhindern regulatorische T-Zellen Autoimmunopathien, Transplantatabstoßungen und entzündliche Darmerkrankungen. Da Foxp3+ regulatorische T-Zellen nur äußerst geringe Mengen an Interleukin-2 synthetisieren, sind sie auf eine adäquate Versorgung angewiesen. Konventionelle T-Zellen werden als bedeutende IL-2 Quelle für Treg-Zellen vermutet, doch über die Mechanismen und räumlich-zeitliche Dynamik der Treg-Effektor-Zellinteraktion ist bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden Foxp3+ regulatorische T-Zellen in Mausgeweben analysiert und Zellinteraktionen mit Effektorzellen im Darm charakterisiert. Es wurde ein theoretisches Modell zur Evaluierung von Zell-Zellkontakten erarbeitet und experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass in der Akutphase einer T-Zell-induzierten Kolitis und im Kolon von gesunden Wildtyp-Mäusen Foxp3+ regulatorische T-Zellen an Ki-67+ proliferierenden T-Zellen akkumulieren. Diese Zellinteraktionen sind abhängig von Interleukin-2, da IL-2 defiziente Mäuse keine signifikanten Treg-Effektor-Zellakkumulationen aufweisen. Die Analyse der Genexpression konnte zeigen, dass Ki-67+ Zellen Interleukin-2 produzieren. Lokal sezerniertes Interleukin-2 könnte als Sensor für Entzündungsprozesse chemotaktisch auf Foxp3+ regulatorische T-Zellen wirken und die Akkumulation an proliferierenden, IL-2 produzierenden Effektorzellen bedingen. Dieser Mechanismus könnte einerseits zur lokalen Versorgung mit IL-2 dienen und gleichzeitig regulierend auf Effektorzellen in unmittelbarer Umgebung wirken. Dieser Prozess würde zur Erhaltung von regulatorischen T-Zellen in der Peripherie und zur Sicherung der intestinalen Immunbalance beitragen.

Ein wichtiges Merkmal der normalen Schwangerschaft ist die Toleranz des mütterlichen Immunsystems gegenüber den fremden fetalen Antigenen. Regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) steigen während der frühen Schwangerschaft an und leisten einen entscheidenden Beitrag zur fetalen Toleranz. Allerdings sind die genauen Mechanismen ihres Anstieges und ihrer Wirkungsweise noch weitgehend ungeklärt. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl an Treg-Zellen in der empfänglichen Phase des Estruszyklus in der Maus am höchsten war. Es kann vermutet werden, dass die erhöhte Anzahl an Treg-Zellen zum Zeitpunkt der Insemination eine frühe Erkennung von väterlichen Antigenen begünstigt und somit zur Vorbereitung des mütterlichen Immunsystems auf die Implantation des Embryos beiträgt. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Alloantigene im Ejakulat den frühen Anstieg der Treg-Zellen in der Schwangerschaft bedingen und dass das in der Samenblasenflüssigkeit enthaltene Zytokin TGF-beta die Expansion der Treg-Zellen unterstützt. Diese Ergebnisse befürworten eine Alloantigen-vermittelte Expansion der Treg-Zellen während der frühen Schwangerschaft, die darüber hinaus durch TGF-beta begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ebenfalls belegt werden, dass das Schwangerschaftshormon hCG einen entscheidenden Einfluss auf die Treg-Zellen im Verlauf der Schwangerschaft ausübt. Untersuchungen unter Verwendung von menschlichem Probenmaterial konnten deutlich zeigen, dass hCG die Migration von Treg-Zellen zu Trophoblasten vermittelt und zur Konvertierung von konventionellen T-Zellen in Treg-Zellen beiträgt. Darüber hinaus konnten Versuche im Mausabortmodell zeigen, dass die Applikation von hCG die Expansion und Funktion der Treg-Zellen entscheidend beeinflusst, wodurch das Auftreten von Aborten in Abortweibchen verhindert werden konnte. HCG vermittelt demnach die Generierung, Migration und Funktion der Treg-Zellen und trägt entscheidend zum erfolgreichen Verlauf der Schwangerschaft bei. / Normal pregnancy is characterized by the generation of maternal immune tolerance towards the foreign fetal antigens. Regulatory T cells (Treg cells) have been shown to increase in number during early pregnancy stages and to be essential for the establishment of fetal tolerance. However, the mechanisms and factors supporting their increase and function are not well defined. First investigations showed that Treg cells accumulated in the sexually receptive phase of the murine estrous cycle. Thus, it can be assumed that the accumulation of Treg cells around the time of insemination favours early recognition of paternal antigens and thereby prepares the maternal immune system for the implantation of the blastocyst into the maternal endometrium. Experiments investigating the increase of Treg cells during early pregnancy suggest that alloantigens present in the ejaculate mediated early Treg cell augmentation. Moreover TGF-beta, which represents a major component in the seminal fluid, provoked the proliferation of Treg cells. These results suggest that the early expansion of Treg cells is alloantigen-mediated and that seminal fluid-derived TGF-beta is involved in this expansion. Additionally it has been shown that the pregnancy hormone human Chorionic Gonadotropin (hCG) has an important impact on Treg cells during pregnancy. By using human samples it has been proven that hCG mediates the migration of Treg cells to trophoblast cells and supports the conversion of naïve T cells into Treg cells directly at the fetal-maternal interface. In mice, the application of hCG resulted in an increase in the number and function of Treg cells and thereby prevented abortion in a mouse abortion-prone model. Thus, hCG mediates the generation, migration and function of Treg cells and contributes to a successful pregnancy outcome.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.

Die Mehrzahl der im Thymus generierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen (Treg) besitzt hohe Affinität gegenüber körpereigenen Antigenen. Es ist bekannt, dass T-Zell Rezeptoren (TCR) auf Treg Zellen in der Peripherie zusätzlich auch fremde Antigene verschiedener Pathogene wie Parasiten, Bakterien und Viren erkennen. Wenig ist bekannt über das klonale T-Zell Rezeptor Repertoire dieser Treg Populationen und ihre Beziehung zu CD4+CD25low effektor T-Zellen (Teff) im Menschen. In dieser Studie analysieren wir humane TCR auf expandierten Treg and Teff Zellen mit definierter Antigen Spezifität für Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II restringierte „fremde“ Epitope des Cytomegalovirus (CMV). Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der gleiche TCR Vb-CDR3 Klon in beiden funktionell unterschiedlichen Subpopulationen in vitro dominant expandiert ist. Im Unterschied zu ihren klonal-identischen Teff Gegenspielern, exprimieren die suppressiven Treg Zellen kaum CD127 und IL-2, aber hohe Mengen an IFNg und IL-10. Zusammen mit der signifikant erhöhten FOXP3 Expression, trotz unvollständiger foxp3-DNA Demethylierung, lassen sich die CMV-spezifischen CD4+CD25high Treg Zellen einem induzierten Treg (iTreg) Phänotyp zuordnen mit Ähnlichkeit zum beschriebenen Tr-1 Phänotyp. Darüber hinaus konnten wir die klonale TCR Identität auch in frisch isolierten CD4+CD25low und CD4+CD25high Subpopulationen bestätigen, was die Entstehung von CMV-spezifischen Treg Zellen bereits in vivo nahe legt. Periphere CD25high Treg Zellen supprimieren die anti-virale Immunantwort in Patienten mit häufigen CMV-Reaktivierungen, was auf ihre Bildung als Reaktion chronischer Antigenexposition interpretiert werden kann. Unsere Ergebnisse beweisen erstmals direkt, dass aus dem gleichen humanen T-Zell Klon Teff und Treg Zellen mit identischer Spezifität entstehen können und lassen vermuten, dass die Treg Induktion in der Peripherie durch häufige Antigenexposition vorangetrieben wird. / The majority of thymically arised regulatory CD4+CD25high T cells (Treg) show high affinity to self-antigens. It has been proposed that T-cell receptors (TCR) on Treg cells in the periphery also recognize foreign-antigens from pathogens, such as bacteria and viruses. Studies in mice have shown that peripheral Treg cells can be generated not only from naïve T cells but also from effector T cells (Teff). However, in humans the clonal TCR-repertoire of these Treg populations and their relation to effector CD4+CD25low Teff is not sufficiently known up to date. Here, we analyzed human TCRs derived from expanded Treg and Teff cells with defined specificity to MHC class-II restricted “foreign” epitopes of Cytomegalovirus (CMV). Remarkably, we found that both functionally distinct subsets share the same dominant TCR-CDR3 clones in vitro. In contrast to their Teff counterparts, the Treg cells express low CD127 and IL-2, but high IL-10 upon antigen stimulation. Therefore, together with increased FOXP3 expression, but incomplete foxp3 DNA-demethylation, human CMV-antigen specific Treg cells exhibit an induced phenotype (iTreg) in vitro with similarity to recently described Tr-1 phenotype. Moreover, the clonal identity was confirmed in freshly isolated CD4+CD25low and CD4+CD25high subsets, suggesting their generation occurred already in vivo. Peripheral CD25high Treg cells suppress the anti-viral immune response in patients with frequent CMV-reactivations, implying their development as reaction on chronic antigen-exposure. Our results demonstrate directly for the first time, that the same human T-cell clone can possess the phenotype of Teff and Treg cells with specificity to identical foreign epitopes and suggest that Treg-induction in the periphery is supported by frequent antigen-exposure.

Bei der Aufrechterhaltung des homeostatischen Gleichgewichts und der peripheren Selbst-Toleranz spielen CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) eine wichtige Rolle. In Vorarbeiten wurden Subpopulationen von murinen CD4+ Tregs identifiziert, die sich durch die Expression des Integrins alphaE auszeichnen. Diese alphaE+ Treg Subpopulationen weisen einen Effektor/Memory-ähnlichen Phänotyp auf. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, welche Bedingungen zur Entwicklung von alphaE+ Effektor/Memory Tregs in vivo führen und aus welchen Vorläuferzellen sie entstehen. Dabei zeigte sich, dass es sich bei den alphaE+ Tregs um Effektor/Memory T-Zellen handelt, die unter physiologischen Bedingungen in vivo ein hohes Maß an Zellteilung aufweisen, welche zum Teil abhängig von der bakteriellen Besiedelung des Darms ist. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass alphaE+ Tregs nach oraler, antigen-spezifischer Aktivierung in den darm-assozierten lymphoiden Geweben sowohl aus konventionellen naiven CD4+ T-Zellen, als auch aus thymus-generierten naiven CD4+CD25+ Tregs entstehen können. Zusammenfassend deuten die erzielten Ergebnisse darauf hin, dass das spezifische mukosale Mikroenvironment sowohl die Expansion als auch Konvertierung von Tregs fördert und so eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Homeostase von alphaE+Foxp3+ Tregs spielt. Zudem wurde in dieser Arbeit die Ausbildung von gewebespezifischen Homingrezeptor-Phänotypen von naiven CD4+CD25+ Tregs untersucht. In in vitro Kultur-Systemen zeigte sich, dass selektive Modulation von Tregs, ähnlich wie bei konventionellen T-Zellen, die Induktion von organspezifischen Migrationseigenschaften ermöglicht. So konnte eine effiziente Wanderung von Tregs in den Darm ausgelöst werden. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass die Herstellung von Tregs mit spezifischen Wanderungseigenschaften eine Option für therapeutische Anwendungen in der adoptiven T-Zell Therapie sein könnte. / Regulatory CD4+CD25+ T cells (Tregs) play an important role in immune homeostasis and in the maintenance of self-tolerance. Previously, subsets of murine CD4+ Tregs characterised by expression of the integrin alphaE had been identified. These alphaE+ Treg subsets display an effector/memory-like phenotype. In the present study the circumstances favouring in vivo generation of effector/memory-like alphaE+ Tregs were analysed. The results presented here show that alphaE+ effector/memory-like Treg subsets contain a large fraction of cycling cells under physiologic conditions in healthy mice. This in vivo proliferation depended, at least in part, on intestinal commensal microflora. Furthermore, it was observed that alphaE+ Tregs not only developed by differentiation of naive-like CD4+CD25+ Tregs, but were also generated de novo from naive CD4+ T cells in the gut-associated lymphoid tissue upon oral antigen delivery. Taken together, these results indicate that the mucosal microenvironment favours both expansion and conversion of Tregs and thereby represents an important mechanism for the homeostatic maintenance of alphaE+Foxp3+ Tregs. In addition, susceptibility of naive CD4+CD25+ Tregs to acquire tissue-specific homing receptor phenotypes was investigated. In vitro culture systems demonstrated that Tregs, similarly to conventional T cells, could be configured with organ-selective homing properties allowing efficient targeting into the gut. These results suggest that generation of Tregs with specific homing properties for therapeutic purposes in adoptive T cell therapy might be a feasible option.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden T-Lymphozyten verstärkt als Zielzellen für genetische Modifikationen eingesetzt, mit der Absicht vererbbare oder erworbene Krankheiten zu behandeln. Vor kurzem konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass alloantigen-spezifische, genmodifizierte T-Lymphozyten ein enormes Potential besitzen, als Transport- Systeme für therapeutische Gene in allogene Transplantate zu dienen. Diese T-Lymphozyten migrieren und akkumulieren spezifisch in das allogene Transplantat, in welchem es zu einer lokalen und starken T-Zell aktivierungsabhängigen Expression des Transgens kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential von viralem IL-10 als therapeutisches Transgen untersucht. Dazu wurde zunächst in der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLR) eine Lewis T-Zelllinie spezifisch für Ratten-DA Alloantigene generiert. Während der MLR wurden die Lymphozyten retroviral transduziert, so dass sie vIL-10 stabil exprimieren. Der Zytokin-Level der TvIL-10-Lymphozyten liegt 48h nach der T-Zellaktivierung zwischen 1-2ng/m. Die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten zeigen einen CD4+CD25+ Phänotyp und sezernieren neben vIL-10 auch Ratten IL-10 und IFN-g aber kein IL-4, ähnlich wie T-regulatorische Zellen Typ 1 (Treg1). Zunächst wurden die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten hinsichtlich ihres Potentials untersucht, die alloantigen-spezifische Immunantwort in vitro zu modulieren. Dazu wurden 5% vIL-10 transgener T-Lymphozyten zu einer MLR hinzugegeben. Zuvor wurden die naiven Lewis T-Lymphozyten mit einem Membranfarbstoff markiert, um die Proliferation und die Zytokin-Expression dieser Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontroll-MLRs ohne transgene oder mit EGFP-transgenen Lymphozyten konnte eine signifikante Inhibierung der Proliferation als auch der INF-g Expression von naiven T-Lymphozyten detektiert werden. Trotz dieses großen Potentials in vitro, führte der adoptive Transfer der vIL-10 transgenen Zellen allein oder in Kombination mit Cyclosporin (0,5mg/kg/Tag) nicht zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im allogenen Herztransplantationsmodell. Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von vIL-10 im Transplantat eines starken Abstoßungsmodells nicht zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt. Außerdem kann das in vitro gezeigte regulatorische Potential dieser T-Zellen nicht zwangsläufig auf ihr in vivo Potential übertragen werden. / During last two decades T lymphocytes have become key targets for genetic modification in order to treat inherited or acquired human diseases. Recently, we demonstrated the capacity of allospecific gene-engineered T lymphocytes as a transport shuttle for therapeutic transgenes into allografts. These lymphocytes migrate and accumulate specifically in allografts where alloantigen-driven T cell activation strongly enhances local expression of the gene of interest. In this study, the influence of viral IL-10 as a therapeutic transgene was addressed. Lewis T cell lines specific for DA rat alloantigens were generated in a modified mixed lymphocyte reaction protocol (MLR). During MLR, lymphocytes were genetically modified to express vIL-10 using a retroviral gene expression system. The cytokine level in the supernatant of TvIL-10-lymphocytes varied between 1-2 ng/ml 48h after T-cell activation. Like T regulatory 1 (Treg1) cells, vIL-10 transgenic T lymphocytes express the phenotype CD4+25+ and secrete, in addition to vIL-10, rat IL-10 and IFN-g but no IL-4. First we evaluated the potential of vIL-10 transgenic T cell lines to modulate alloantigen-specific immune responses in vitro. Small numbers of TvIL-10-lymphocytes were added to MLR (less than 5%). Naive cells were stained with membrane dyes to trace proliferation and to analyze cytokine expression. In comparison to control MLR with no transgenic cells or equal numbers of TEGFP-lymphocytes, the proliferation as well as the production of IFN-g of naive responder cells were significantly diminished. Despite this regulatory capacity in vitro, the vIL-10 transgenic T lymphocytes were not able, either alone or in combination with suboptimal cyclosporine (0,5mg/kg/day), to prolong the survival of DA rat cardiac allografts in LEW recipients. These data demonstrate that intragraft IL-10 overexpression is not sufficient to prolong allograft survival in a high-responder strain combination and that the regulatory capacity of T cells in vitro does not predict their in vivo efficiency.

Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation atopischer Erkrankungen. Die Voraussetzungen für eine allergische Reaktionslage werden schon während der intrauterinen Entwicklung geschaffen. Über den Einfluss der intrauterinen Umgebung auf die Tregs zur Geburt ist bisher wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte in der prospektiven Geburtskohorten-Studie LINA (Einfluss von Lebensstil und Umweltfaktoren auf das Allergierisiko Neugeborener) geklärt werden, inwiefern der Immunstatus der werdenden Mutter, eine atopische Familienanamnese sowie Umweltexpositionen während der Schwangerschaft den Immunstatus der Neugeborenen beeinflussen. Ein besonderer Schwerpunkt wurde dabei auf Tregs gelegt. Weiterhin sollte die Relevanz der Tregs zur Geburt für das Allergierisiko im ersten Lebensjahr des Kindes analysiert werden. Die Messung der Anzahl und Funktionalität der Tregs im Blut der werdenden Mutter in der 34. Schwangerschaftswoche und im Nabelschnurblut erfolgte sowohl durchflusszytometrisch in einer Subkohorte (n=24 Mutter-Kind Paare), als auch durch eine methylspezifische qPCR in der gesamten Kohorte der LINA-Studie (n=346 Mutter-Kind Paare). Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten erstmals darauf hin, dass mütterliche Tregs möglicherweise einen regulatorischen Einfluss hinsichtlich der Programmierung des fötalen Immunsystems haben (Hinz et al., Clin Exp Allergy 2010). Die durchflusszytometrische Charakterisierung der Tregs der Mutter-Kind Paare zeigte beim Vergleich der Expression von CD4, CD25, CD127 und FOXP3, dass der Anteil der CD4+CD25high Tregs im Nabelschnurblut deutlich höher war, der Anteil FOXP3 positiver Zellen innerhalb der CD4+CD25high Tregs Population war zur Geburt jedoch signifikant geringer, verglichen mit den werdenden Müttern. Weiterhin war eine geringe Anzahl mütterlicher Tregs während der Schwangerschaft und eine erhöhte Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 mit erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln im Nabelschnurblut verbunden (Hinz et al., 2010). Durch die Quantifizierung der Tregs auf Basis des TSDR-Methylierungsstatus` im FOXP3 Gen, einer spezifischen und zuverlässigen Methode zum Nachweis stabiler Tregs, konnte der Zusammenhang zwischen einer Vielzahl pränataler Faktoren, Tregs zur Geburt und dem Allergierisiko in der gesamten Geburtskohorte geklärt werden (Hinz et al., Allergy 2011). Das männliche Geschlecht des Kindes, die Atopie der Eltern, Rauchen und Desinfektionsmittel-Exposition während der Schwangerschaft sowie eine erhöhte mütterliche Produktion von IFN-γ, IL-13 und IL-17E war mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut assoziiert. Für Kinder mit einer geringeren Treg-Anzahl im Nabelschnurblut war das Risiko für eine atopische Dermatitis und einer Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene im ersten Lebensjahr signifikant höher (Hinz et al., 2011).

Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die intestinale Immunhomöostase und Limitierung von (Auto)-Immunität. Sie exprimieren den Transkriptionsfaktor Foxp3 und an der Oberfläche die α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25). Im Tiermodell verhindern regulatorische T-Zellen Autoimmunopathien, Transplantatabstoßungen und entzündliche Darmerkrankungen. Da Foxp3+ regulatorische T-Zellen nur äußerst geringe Mengen an Interleukin-2 synthetisieren, sind sie auf eine adäquate Versorgung angewiesen. Konventionelle T-Zellen werden als bedeutende IL-2 Quelle für Treg-Zellen vermutet, doch über die Mechanismen und räumlich-zeitliche Dynamik der Treg-Effektor-Zellinteraktion ist bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden Foxp3+ regulatorische T-Zellen in Mausgeweben analysiert und Zellinteraktionen mit Effektorzellen im Darm charakterisiert. Es wurde ein theoretisches Modell zur Evaluierung von Zell-Zellkontakten erarbeitet und experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass in der Akutphase einer T-Zell-induzierten Kolitis und im Kolon von gesunden Wildtyp-Mäusen Foxp3+ regulatorische T-Zellen an Ki-67+ proliferierenden T-Zellen akkumulieren. Diese Zellinteraktionen sind abhängig von Interleukin-2, da IL-2 defiziente Mäuse keine signifikanten Treg-Effektor-Zellakkumulationen aufweisen. Die Analyse der Genexpression konnte zeigen, dass Ki-67+ Zellen Interleukin-2 produzieren. Lokal sezerniertes Interleukin-2 könnte als Sensor für Entzündungsprozesse chemotaktisch auf Foxp3+ regulatorische T-Zellen wirken und die Akkumulation an proliferierenden, IL-2 produzierenden Effektorzellen bedingen. Dieser Mechanismus könnte einerseits zur lokalen Versorgung mit IL-2 dienen und gleichzeitig regulierend auf Effektorzellen in unmittelbarer Umgebung wirken. Dieser Prozess würde zur Erhaltung von regulatorischen T-Zellen in der Peripherie und zur Sicherung der intestinalen Immunbalance beitragen.:Bibliographische Beschreibung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Charakterisierung von intestinalen Foxp3+ regulatorischen T-Zellen 1.2 Mechanismen der Treg-vermittelten Immunregulation 1.3 Zielstellung der Arbeit 2 Publikation Cell-Cell-Neighborhood Relations in Tissue Sections - A Quantitative Model for Tissue Cytometry 3 Appendix A Herleitung des Modellsystems zur Berechnung der zufälligen Kontaktwahrscheinlichkeit 4 Appendix B Automatische Bildanalyse mit CellProfiler 4.1 Einleitung 4.2 Algorithmus der histologischen Bildanalyse mit CellProfiler 4.3 Validierung der Messdaten 4.4 Zusammenfassung 4.5 Detaillierte Darstellung des CellProfiler-Algorithmus 5 Unpublizierte Experimente Die Rolle von Interleukin-2 für die Akkumulation von Foxp3+ Treg-Zellen an Ki-67+ proliferierenden Effektorzellen im Darm 5.1 Einleitung 5.2 Material und Methoden 5.2.1 Mausgewebe 5.2.2 Immunfluoreszenzfärbung 5.2.3 Laser-Mikrodissektion 5.2.4 RNA Isolation, Reverse Transkription, quantitative Real-Time PCR 5.2.5 Sequenzierung 5.3 Ergebnisse 6 Abschließende Diskussion 7 Zusammenfassung der Arbeit Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Lebenslauf Danksagung Literaturverzeichnis