Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.

Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten. In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend. 42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert. In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist. / The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites. In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background. 42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis. In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.

Die Toxoplasmose ist eine Infektionskrankheit, die durch den Parasiten Toxoplasma gondii verursacht wird. Während eine Infektion bei den meisten immunkompetenten Menschen asymptomatisch abläuft, kann bei einer Primärinfektion in der Schwangerschaft der Parasit auf den Föten übergehen und zu einem Abort oder zu schweren Erkrankungen dessen führen.Eine pränatale Therapie soll eine Übertragung verhindern oder klinische Auswirkungen beim Kind mindern. Um die Effektivität der in Deutschland durchgeführten Therapie beurteilen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine retrospektive Untersuchung von 685 schwangeren Frauen durchgeführt, deren serologische Befunde auf eine Primärinfektion hindeuteten. In Folge dieser Studie konnte gezeigt werden, dass eine innerhalb von vier Wochen nach Infektion eingeleitete antiparasitäre Therapie das Risiko für die Ausprägung von klinisch-manifesten Erkrankungen des Kindes mindert.Um valide epidemiologische Untersuchungen durchführen zu können ist eine zuverlässige Diagnostik unabdingbar. Hierfür ist von Bedeutung, dass T. gondii ein intrazellulärer Parasit ist, welcher in drei verschiedenen Stadien vorkommt: als Oozysten, Tachy- und Bradyzoiten. Bei einer akuten Infektion sind vorwiegend sich schnell vermehrende Tachyzoiten vorhanden, während bei einer chronischen Infektion Bradyzoiten-enthaltene Zysten dominieren. Es wird davon ausgegangen, dass jedes Parasitenstadium spezifische Antigene exprimiert.Im Zuge dieser Arbeit sollten daher diagnostische Marker identifiziert werden, die eine Differenzierung zwischen einer akuten und einer chronischen Infektion erlauben. Über 2D-Gelelektrophoresen und Massenspektrometrie konnten dabei u. a. die Proteine GRA1, GRA7, ROP9, MIC5 und SUB1 als Marker für eine akute Infektion ermittelt werden. Diese, sowie sieben weitere Proteine, wurden rekombinant in E. coli hergestellt und in einem Lineblot-Verfahren an Humanseren auf ihre diagnostischen Eigenschaften untersucht.Durch den Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen rGRA1, rGRA2 und rGRA6 konnte eine Toxoplasma-Infektion in bis zu 100 % erkannt werden. Eine Diskriminierung des Infektionsstadiums war allerdings nicht möglich. Eine akute Infektion ließ sich jedoch durch den Nachweis von rSUB1- und rGRA6-spezifischen IgG- und IgA Antikörper mit einer Wahrscheinlichkeit von bis zu 92 % von einer chronischen Infektion unterscheiden.Des Weiteren wurden mit Hilfe des Lineblot-Verfahrens untersucht, ob die rekombinanten Antigene auch Potenzial hatten eine der häufigsten klinisch-manifesten Erkrankungen - die okuläre Toxoplasmose (Retinochorioiditis) - zu identifizieren. Dabei konnten durch den Nachweis GRA2-spezifischer IgA- und BAG1-spezifischer IgG-Antikörper signifikante Unterschiede bei Patienten mit einer Retinochorioiditis im Vergleich zu T. gondii infizierten Patienten ohne okuläre Läsionen festgestellt werden.Um festzustellen, ob der Lineblot-Assay unter der Verwendung rekombinanter Antigene auch in der Veterinärmedizin eingesetzt werden kann, wurden Verlaufseren von Hühnern, Puten und Schweinen untersucht, die experimentell mit Oozysten oder Tachyzoiten infiziert worden waren. Dabei zeigten die Tiere, in Abhängigkeit von dem getesteten Antigen, eine teilweise Infektionsdosis- und Infektionsart-abhängige Antikörper-Kinetik.In der Zusammenschau können die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zur Verbesserung der Diagnostik und Therapie der Toxoplasmose insbesondere in der Schwangerschaft beitragen.

Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.:Inhaltsverzeichnis Bibliografische Darstellung V Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis IX Tabellenverzeichnis X Formelverzeichnis XII 1 Einleitung 1 1.1 West-Nil-Virus: Relevanz und epidemiologische Aspekte 1 1.2 Virale Struktur und Replikation 3 1.3 West-Nil-Virus-Erkrankung: Prädiktion, Pathogenese und Krankheitsbild 7 1.4 Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 9 1.5 Zielstellung 12 2 Materialien 13 2.1 Versuchstiere, Bakterien-, Hefe- und Virusstämme 13 2.2 Vektoren und Oligonukleotide 13 2.3 Reagenzsysteme, Standards und Enzyme 15 2.4 Antikörper 16 2.5 Feinchemikalien und Reagenzien 16 2.6 Puffer und Lösungen 19 2.7 Nährmedien 20 2.8 Verbrauchsmaterialien und Technische Ausstattung 21 3 Methoden 25 3.1 Molekularbiologische Methoden 25 3.1.1 Reverse Transkription 25 3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25 3.1.3 DNA-Sequenzierung 28 3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 28 3.1.5 DNA-Reinigung 29 3.1.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 29 3.1.7 Restriktionsverdau 29 3.1.8 Ligation 30 3.2 Arbeiten mit E. coli 31 3.2.1 Kultivierung und Lagerung 31 3.2.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 31 3.2.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen 31 3.2.4 Plasmidpräparation aus E. coli 31 3.2.5 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 32 3.3 Arbeiten mit P. pastoris 32 3.3.1 Kultivierung und Lagerung 32 3.3.2 Herstellung kompetenter P. pastoris-Zellen 32 3.3.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente P. pastoris-Zellen 33 3.3.4 Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris 33 3.4 Biochemische Methoden 34 3.4.1 Proteinextraktion aus Bakterienzellen 34 3.4.2 Proteinextraktion aus Hefezellen 35 3.4.3 Proteinfällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 35 3.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 35 3.4.5 Silberfärbung 37 3.4.6 Western Blot 37 3.4.7 Reinigung der rekombinanten Polypeptide aus Proteingemischen 38 3.4.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 40 3.4.9 Spaltung von MBP-Fusionsproteinen 40 3.4.10 Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) 41 3.4.11 Immunisierung der Balb/c-Mäuse 42 3.4.12 Indirekter ELISA 43 3.4.13 Bestimmung des murinen Antikörpertiters 44 3.4.14 Nachweis humaner Antikörper im Testserum 45 4 Ergebnisse 46 4.1 Definition der ausgewählten Strukturproteinsequenzen 46 4.2 Expression der rekombinanten Polypeptide prM, Cnat und Cme in P. pastoris 47 4.2.1 Klonierung der Expressionsplasmide 47 4.2.2 Transformation von Pichia pastoris 49 4.2.3 Expression der Zielpeptide in P. pastoris 51 4.3 Expression von Cnat und Cme in E. coli 56 4.3.1 Klonierung der Expressionsplasmide 56 4.3.2 Transformation von E. coli 58 4.3.3 Expression der WNV-Sequenzen Cnat und Cme als Fusionsproteine 59 4.3.4 Spaltung der Fusionsproteine mittels Faktor Xa 62 4.3.5 Isolierung der Zielpeptide Cnat und Cme 63 4.4 Untersuchung der Immunogenität der rekombinanten WNV-Polypeptide 66 4.4.1 Immunisierung von Versuchstieren mit rekombinanten WNV-Polypeptiden 66 4.4.2 Analyse der murinen Seren mittels ELISA 66 4.4.3 Erweiterte Analyse des rekombinanten prM-Polypeptids mit Humanseren 67 4.4.4 Erweiterte Analyse der murinen prM-Seren im IFT 69 4.5 Prüfung der rekombinanten Peptidantigene auf ihre Verwendbarkeit in einem WNV-spezifischen Testsystem 69 4.5.1 Untersuchung der humanen Seren S2-S42 mittels ELISA 69 4.5.2 Einsatz von Cnat und MBP-Cme als Antigene zur Untersuchung der humanen Seren S2-S42 im ELISA 70 5 Diskussion 72 5.1 Expression von prM, Cnat und Cme in P. pastoris 73 5.2 Expression von Cnat und Cme in E. coli 77 5.3 Analyse der Immunogenität von prM, Cnat und MBP-Cme 79 5.4 Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA für die Detektion WNV-spezifischer Antikörper in humanen Serumproben 84 6 Zusammenfassung 90 7 Literaturverzeichnis 94 8 Anhang 104 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XIV Danksagung XV Lebenslauf XVI