Das West-Nil-Virus (WNV) ist eine Zoonose mit weltweit zunehmender Verbreitung. Natürliches Reservoir dieses Flavivirus sind Vögel, aber auch Säugetiere wie z.B. Menschen können infiziert werden. In einigen Fällen führt eine WNV-Infektion zu schweren neurologischen Erkrankungen. Infolgedessen werden effektive und biologisch sichere Impfstrategien gegen dieses Virus benötigt. Eine Alternative zu herkömmlichen Impfmethoden beschreibt die DNA-Immunisierung. In dieser Arbeit wurde ein potentieller DNA-Impfstoff gegen das WNV hergestellt. Die Immunisierung des DNA-Vektors induzierte starke zelluläre und humorale Immunantworten in Mäusen. Zudem waren die Tiere gegen eine WNV-Infektion geschützt. Zusätzliche Impfungen mit rekombinantem WNV-Protein führten zu einer weiteren Steigerung der Immunogenität des DNA-Impfstoffkandidaten. Des Weiteren sollte der nicht-virale Gentransfer im Allgemeinen optimiert werden. Ein neu entwickeltes Transportsystem für Plasmid-DNA, bestehend aus natürlichen Histonextrakten und Polyethylenimin, resultierte in einer verbesserten Proteinexpression in in vitro transfizierten Zellen und wurde von diesen sehr gut toleriert. Daher wäre diese Strategie auch für zukünftige DNA-Impftechniken denkbar. Der Einfluss von WNV auf die Expression zellulärer miRNAs in Wirtszellen wurde bisher noch nicht untersucht. Dennoch könnten auf diese Weise potentielle molekulare Biomarker für eine frühe WNV-Diagnose identifiziert werden. Mittels Microarray-Technik wurde die Expression zellulärer miRNAs analysiert. Verschiedene miRNA-Spezies waren infolge einer WNV-Infektion leicht herunter- bzw. hochreguliert und stellen mögliche diagnostische Biomarker für das Virus dar.

In Regionen, in denen verschiedene Flaviviren zirkulieren, wird die Diagnostik des West-Nil-Virus (WNV) oft durch Kreuzreaktionen erschwert. Einer dieser Staaten ist der Sudan, in welchem neben dem WNV auch Dengue-Viren (DENV) endemisch sind. Ziel dieser Arbeit war es, die WNV-Seroprävalenz im Sudan unter Ausschluss von Kreuzreaktionen mit Dengue-Viren oder dem Zika-Virus zu ermitteln. Zudem sollte bei Probanden mit früherer DENV-Infektion der Anteil an WNV-neutralisierenden Seren bestimmt werden. Serumproben von Patienten mit Fieber aus den sudanesischen Regionen Kassala, Nord-Kordofan und Red Sea State wurden vor Beginn dieser Arbeit mittels ELISA auf DENV-Antikörper untersucht. Seren ohne DENV-Antikörper (N = 106) und eine mit den Probanden dieser Gruppe hinsichtlich Herkunft, Alter und Geschlecht übereinstimmende zweite Personengruppe mit DENV-Antikörpern (N = 108) wurden ausgewählt. In allen Serumproben wurden mittels Mikroneutralisationstest sowohl die Häufigkeit WNV-neutralisierender Antikörper als auch deren Titer bestimmt. In der Gruppe der Seren ohne DENV-Antikörper neutralisierten 30,2% das WNV. Diese wurden in weiteren Neutralisationstests auf DENV- und ZIKV-neutralisierende Antikörper untersucht. 18,9% dieser Serumproben wiesen ausschließlich Antikörper gegen das WNV auf, sodass die ermittelte Seroprävalenz zwischen 18,9% und 30,2% lag. Die Seroprävalenz stieg mit zunehmendem Alter der Testpersonen an. Männer und Frauen waren gleichermaßen betroffen. Der Anteil der DENV-positiven Seren, die das WNV neutralisierten, betrug 83,3%. Diese Seren zeigten höhere WNV-Neutralisationstiter als die DENV-negativen Proben. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass ein erheblicher Anteil der Probanden eine serologisch nachgewiesene WNV-Infektion hatte. Im Vergleich dazu wies die große Mehrheit der Personen mit zurückliegender DENV-Infektion WNV-neutralisierende Antikörper auf. Es sind weitere Studien erforderlich, um klinische Fälle von WNV-Infektionen zu identifizieren und um herauszufinden, ob Personen mit kreuzneutralisierenden Antikörpern vor WNV-Infektionen geschützt sind.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Charakterisierung, Verwandtschaft und Übertragung des West Nil Virus 1.2 Klinische Symptomatik einer West-Nil-Virus-Infektion 1.3 Verbreitung und Ausbrüche 1.4 Situation im Sudan 1.5 Serologische Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 2 Aufgabenstellung 3 Materialien und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien und Reagenzien 3.1.2 Enzyme und Farbstoffe 3.1.3 Nährmedien 3.1.4 Puffer 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Kits 3.1.7 Virusstämme 3.1.8 Zellen 3.1.9 Patientenproben 3.1.10 Software und Programme 3.1.11 Technische Geräte und Materialien 3.2 Methoden 3.2.1 Kriterien zur Auswahl der Probanden 3.2.2 Zellkultivierung 3.2.3 Zellzählung 3.2.4 Mikroneutralisationstest 3.2.4.1 Screening 3.2.4.2 Antikörpertiter-Test 3.2.4.3 Interpretation 3.2.5 ELISA zum Nachweis Virus-infizierter Zellen 3.2.6 Bewertung der Ergebnisse 3.3 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl der Seren 4.2 Anteil der WNV-NT-positiven Probanden 4.3 Anteil der DENV- und ZIKV-NT-positiven Probanden 4.4 Vergleich der WNV-Seroprävalenz in Gruppe 1 und Gruppe 2 4.5 Charakteristika der WNV-NT-positiven Probanden 4.6 WNV-Antikörpertiter 5 Diskussion 5.1 Seroprävalenz des West-Nil-Virus 5.2 Assoziation zwischen zurückliegenden DENV-Infektionen und WNV-neutralisierenden Antikörpern 5.3 Häufigkeit von WNV-Infektionen in Kassala und Nord-Kordofan 5.4 Zusammenhang zwischen dem Alter und Geschlecht der Probanden und dem Anteil WNV-neutralisierender Antikörper 5.5 Methodenbeurteilung 5.6 Bedeutung der Untersuchungsergebnisse 6 Zusammenfassung der Arbeit 7 Literaturverzeichnis 8 Abbildungsverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis 10 Formelverzeichnis 11 Selbstständigkeitserklärung 12 Lebenslauf 13 Danksagung

In den letzten Jahren erreichten viele neue (emerging) Viren Europa, die zum Teil (z.T.) zoonotisch auf den Menschen übertragbar sind. So musste man sich mit Geflügel- und Schweinegrippe, Blauzungenkrankheit, Infektiöser Anämie der Einhufer oder auch SARS (severe acute respiratory syndrome) auseinandersetzen. Bedingt durch verschiedene Faktoren, wie Klimawandel oder zunehmende Globalisierung und damit einhergehendem Verkehr zwischen den Kontinenten verbesserten sich auch die Bedingungen für die Virusverbreitung, so dass viele für Deutschland untypische Krankheitserreger auch hier auftraten. Das West-Nil-Virus (WNV) ist in Europa bereits endemisch verbreitet und könnte somit eine besondere Gefahr für Deutschland darstellen. Es ist ein bekannter Zoonose-Erreger, und sein Eintrag und die rasche Verbreitung des Virus in Amerika 1999 zeigten wie gefährlich neue Viren in naiven Populationen sein können. Über die Verbreitung des Virus in Deutschland gibt es nur wenige Studien z.B. des Robert-Koch-Instituts (LINKE et al. 2007a) und des Friedrich-Loeffler-Instituts (SEIDOWSKI et al. 2010), wobei in keiner Studie tote Vögel als Untersuchungsmaterial genutzt wurden. Da das WNV in Amerika mit einem auffälligen Vogelsterben einherging, ist es naheliegend, den Virusnachweis zuerst bei toten Vögeln zu erbringen.

Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.

Das West-Nil-Virus (WNV) ist eine Zoonose mit weltweit zunehmender Verbreitung. Natürliches Reservoir dieses Flavivirus sind Vögel, aber auch Säugetiere wie z.B. Menschen können infiziert werden. In einigen Fällen führt eine WNV-Infektion zu schweren neurologischen Erkrankungen. Infolgedessen werden effektive und biologisch sichere Impfstrategien gegen dieses Virus benötigt. Eine Alternative zu herkömmlichen Impfmethoden beschreibt die DNA-Immunisierung. In dieser Arbeit wurde ein potentieller DNA-Impfstoff gegen das WNV hergestellt. Die Immunisierung des DNA-Vektors induzierte starke zelluläre und humorale Immunantworten in Mäusen. Zudem waren die Tiere gegen eine WNV-Infektion geschützt. Zusätzliche Impfungen mit rekombinantem WNV-Protein führten zu einer weiteren Steigerung der Immunogenität des DNA-Impfstoffkandidaten. Des Weiteren sollte der nicht-virale Gentransfer im Allgemeinen optimiert werden. Ein neu entwickeltes Transportsystem für Plasmid-DNA, bestehend aus natürlichen Histonextrakten und Polyethylenimin, resultierte in einer verbesserten Proteinexpression in in vitro transfizierten Zellen und wurde von diesen sehr gut toleriert. Daher wäre diese Strategie auch für zukünftige DNA-Impftechniken denkbar. Der Einfluss von WNV auf die Expression zellulärer miRNAs in Wirtszellen wurde bisher noch nicht untersucht. Dennoch könnten auf diese Weise potentielle molekulare Biomarker für eine frühe WNV-Diagnose identifiziert werden. Mittels Microarray-Technik wurde die Expression zellulärer miRNAs analysiert. Verschiedene miRNA-Spezies waren infolge einer WNV-Infektion leicht herunter- bzw. hochreguliert und stellen mögliche diagnostische Biomarker für das Virus dar.

In den letzten Jahren erreichten viele neue (emerging) Viren Europa, die zum Teil (z.T.) zoonotisch auf den Menschen übertragbar sind. So musste man sich mit Geflügel- und Schweinegrippe, Blauzungenkrankheit, Infektiöser Anämie der Einhufer oder auch SARS (severe acute respiratory syndrome) auseinandersetzen. Bedingt durch verschiedene Faktoren, wie Klimawandel oder zunehmende Globalisierung und damit einhergehendem Verkehr zwischen den Kontinenten verbesserten sich auch die Bedingungen für die Virusverbreitung, so dass viele für Deutschland untypische Krankheitserreger auch hier auftraten. Das West-Nil-Virus (WNV) ist in Europa bereits endemisch verbreitet und könnte somit eine besondere Gefahr für Deutschland darstellen. Es ist ein bekannter Zoonose-Erreger, und sein Eintrag und die rasche Verbreitung des Virus in Amerika 1999 zeigten wie gefährlich neue Viren in naiven Populationen sein können. Über die Verbreitung des Virus in Deutschland gibt es nur wenige Studien z.B. des Robert-Koch-Instituts (LINKE et al. 2007a) und des Friedrich-Loeffler-Instituts (SEIDOWSKI et al. 2010), wobei in keiner Studie tote Vögel als Untersuchungsmaterial genutzt wurden. Da das WNV in Amerika mit einem auffälligen Vogelsterben einherging, ist es naheliegend, den Virusnachweis zuerst bei toten Vögeln zu erbringen.

Grundlage der vorliegenden Arbeit ist die Überlegung, dass eine Möglichkeit, die Spezifität der bisher angewendeten Verfahren zur West-Nil-Virus-Diagnostik zu verbessern, in der Anwendung rekombinanter WNV-spezifischer Antigene besteht. Die unter anderem auf bioinformatischen Methoden basierende Identifikation von potenziellen B-Zell-Epitopen und Auswahl entsprechender Sequenzabschnitte richtete sich dabei gezielt auf immunogene Bereiche, die innerhalb der Gruppe der Flaviviren einen ausreichenden Sequenzunterschied zu allen weiteren sequenzverwandten Erregern, zusammengefasst im Japanische Enzephalitis-Serokomplex, boten. Drei ausgewählte Bereiche innerhalb der Strukturproteinsequenz, bezeichnet als prM, Cnat und Cme, sollten mit Hilfe des Expressionssystems Pichia pastoris bzw. Escherichia coli rekombinant exprimiert werden. Nach Erarbeitung optimaler Expressionsbedingungen folgte die affinitätschromatografische Reinigung der im weiteren Verlauf zur Immunisierung von Balb/c-Mäusen eingesetzten Polypeptide. Die gewonnenen Seren der nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen geimpften Mäuse wurden im Anschluss immunologisch untersucht. Es zeigte sich, dass die rekombinanten Derivate des Capsid-Proteins eine deutliche Serokonversion hervorriefen. Analysen der mit Cnat und MBP-Cme immunisierten Mausseren wiesen vorhandene peptidspezifische sowie virusspezifische Antikörper nach. Der Einsatz dieser gewonnenen Peptidantigene im indirekten ELISA-Testsystem zur Detektion WNV-spezifischer Antikörper unter Verwendung humaner WNV-IgG-positiver Serumproben zeigte positive Resultate. Im Gegensatz hierzu führte die Immunisierung mit prM lediglich zu einer unspezifischen murinen Antikörperbildung. Die Unterscheidung zwischen WNV-positiven und WNV negativen Humanseren war unter Verwendung des rekombinanten Antigens prM nicht möglich. Im Ergebnis zeigten zwei der drei in dieser Arbeit rekombinant erstellten Strukturproteinabschnitte ihr immunologisches Potenzial in der Generierung muriner WNV spezifischer Antikörper. Zudem konnte mit der Expression der WNV-spezifischen C Protein Antigene ein Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA-Testsystems zur Detektion WNV-bedingter Humaninfektionen geleistet werden.:Inhaltsverzeichnis Bibliografische Darstellung V Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis IX Tabellenverzeichnis X Formelverzeichnis XII 1 Einleitung 1 1.1 West-Nil-Virus: Relevanz und epidemiologische Aspekte 1 1.2 Virale Struktur und Replikation 3 1.3 West-Nil-Virus-Erkrankung: Prädiktion, Pathogenese und Krankheitsbild 7 1.4 Diagnostik von West-Nil-Virus-Infektionen 9 1.5 Zielstellung 12 2 Materialien 13 2.1 Versuchstiere, Bakterien-, Hefe- und Virusstämme 13 2.2 Vektoren und Oligonukleotide 13 2.3 Reagenzsysteme, Standards und Enzyme 15 2.4 Antikörper 16 2.5 Feinchemikalien und Reagenzien 16 2.6 Puffer und Lösungen 19 2.7 Nährmedien 20 2.8 Verbrauchsmaterialien und Technische Ausstattung 21 3 Methoden 25 3.1 Molekularbiologische Methoden 25 3.1.1 Reverse Transkription 25 3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25 3.1.3 DNA-Sequenzierung 28 3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese 28 3.1.5 DNA-Reinigung 29 3.1.6 Bestimmung der DNA-Konzentration 29 3.1.7 Restriktionsverdau 29 3.1.8 Ligation 30 3.2 Arbeiten mit E. coli 31 3.2.1 Kultivierung und Lagerung 31 3.2.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 31 3.2.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli-Zellen 31 3.2.4 Plasmidpräparation aus E. coli 31 3.2.5 Expression rekombinanter Proteine in E. coli 32 3.3 Arbeiten mit P. pastoris 32 3.3.1 Kultivierung und Lagerung 32 3.3.2 Herstellung kompetenter P. pastoris-Zellen 32 3.3.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente P. pastoris-Zellen 33 3.3.4 Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris 33 3.4 Biochemische Methoden 34 3.4.1 Proteinextraktion aus Bakterienzellen 34 3.4.2 Proteinextraktion aus Hefezellen 35 3.4.3 Proteinfällung mittels Trichloressigsäure (TCA) 35 3.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 35 3.4.5 Silberfärbung 37 3.4.6 Western Blot 37 3.4.7 Reinigung der rekombinanten Polypeptide aus Proteingemischen 38 3.4.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 40 3.4.9 Spaltung von MBP-Fusionsproteinen 40 3.4.10 Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) 41 3.4.11 Immunisierung der Balb/c-Mäuse 42 3.4.12 Indirekter ELISA 43 3.4.13 Bestimmung des murinen Antikörpertiters 44 3.4.14 Nachweis humaner Antikörper im Testserum 45 4 Ergebnisse 46 4.1 Definition der ausgewählten Strukturproteinsequenzen 46 4.2 Expression der rekombinanten Polypeptide prM, Cnat und Cme in P. pastoris 47 4.2.1 Klonierung der Expressionsplasmide 47 4.2.2 Transformation von Pichia pastoris 49 4.2.3 Expression der Zielpeptide in P. pastoris 51 4.3 Expression von Cnat und Cme in E. coli 56 4.3.1 Klonierung der Expressionsplasmide 56 4.3.2 Transformation von E. coli 58 4.3.3 Expression der WNV-Sequenzen Cnat und Cme als Fusionsproteine 59 4.3.4 Spaltung der Fusionsproteine mittels Faktor Xa 62 4.3.5 Isolierung der Zielpeptide Cnat und Cme 63 4.4 Untersuchung der Immunogenität der rekombinanten WNV-Polypeptide 66 4.4.1 Immunisierung von Versuchstieren mit rekombinanten WNV-Polypeptiden 66 4.4.2 Analyse der murinen Seren mittels ELISA 66 4.4.3 Erweiterte Analyse des rekombinanten prM-Polypeptids mit Humanseren 67 4.4.4 Erweiterte Analyse der murinen prM-Seren im IFT 69 4.5 Prüfung der rekombinanten Peptidantigene auf ihre Verwendbarkeit in einem WNV-spezifischen Testsystem 69 4.5.1 Untersuchung der humanen Seren S2-S42 mittels ELISA 69 4.5.2 Einsatz von Cnat und MBP-Cme als Antigene zur Untersuchung der humanen Seren S2-S42 im ELISA 70 5 Diskussion 72 5.1 Expression von prM, Cnat und Cme in P. pastoris 73 5.2 Expression von Cnat und Cme in E. coli 77 5.3 Analyse der Immunogenität von prM, Cnat und MBP-Cme 79 5.4 Beitrag zur Etablierung eines indirekten ELISA für die Detektion WNV-spezifischer Antikörper in humanen Serumproben 84 6 Zusammenfassung 90 7 Literaturverzeichnis 94 8 Anhang 104 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XIV Danksagung XV Lebenslauf XVI

Einleitung: Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein Arbovirus (engl.: arthropod-borne virus) aus der Familie der Flaviviridae. Vorrangig wird das WNV in einem Vogel-Stechmücken-Vogel-Zyklus übertragen, allerdings können auch Pferde und Menschen als Fehlwirte infiziert werden (CHANCEY et al. 2015). Bei etwa 8–10 % der infizierten Equiden kommt es zum Auftreten neurologischer Symptome mit teils schweren und fatalen Krankheitsverläufen (BUNNING et al. 2004). Im Jahr 2018 wurden die ersten zwei equinen WNV-Infektionen in Deutschland nachgewiesen (ZIEGLER et al. 2019). Alle seither gemeldeten equinen WNV-Infektionen konzentrieren sich auf den mitteldeutschen Raum (TSIS 2022). Informationen zur Seroprävalenz der WNV-Infektionen in der hiesigen Pferdepopulation existieren jedoch nicht. Ziele der Untersuchung: Anhand einer Querschnittsstudie sollte die Seroprävalenz equiner WNV-Infektionen in einem Gebiet mit erwarteter Viruszirkulation bestimmt werden. Darüber hinaus sollte die Seroprävalenz in Landkreisen mit gemeldeten equinen Infektionen (Fall-Landkreisen, LK) und solchen ohne bisher registrierte equine WNV-Infektionen (Kontroll-LK) verglichen werden. In einem zweiten Studienteil sollten anhand der Erhebung pferde- und betriebsspezifischer Daten sowie Informationen zum individuellen und betrieblichen Mückenmanagement Risikofaktoren für eine WNV-Infektion von Pferden in Mitteldeutschland ermittelt werden. Tiere, Material und Methoden: Im Jahr 2020 wurde ein Studiengebiet mit neun Landkreisen (LK) aus drei Bundesländern definiert. In sechs Fall-LK wurden in den Jahren 2018/2019 equine WNV-Infektionen registriert, während in drei Kontroll-LK keine registrierten Fälle vorlagen. Pferdehalter mit fünf und mehr gemeldeten Equiden wurden zur freiwilligen Teilnahme an der Studie eingeladen. Eingeschlossen wurden klinisch gesunde Pferde, die mindestens 12 Monate alt, nicht gegen das WNV geimpft und dauerhaft in der Region gehalten wurden. Alle Seren wurden in einem kompetitiven ELISA (cELISA) auf flavivirenspezifische Antikörper untersucht. Um akute Infektionen zu detektieren, wurden alle reaktiven Seren (positiv und fraglich) weiterhin auf das Vorliegen von IgM-Antikörper untersucht. Verifiziert wurden die cELISA-reaktiven Seren im Neutralisationstest (VNT). Analysiert wurde neben WNV auch das mit ihm serologisch eng verwandte Usutu-Virus (USUV) und das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV). Für die Risikofaktorenanalyse wurden epidemiologische Daten in Form eines Fragebogens für alle teilnehmenden Pferde erhoben und statistisch mittels Logistischer Regression ausgewertet. Ergebnisse: Zwischen September und November 2020 wurden 940 Pferde aus 127 Betrieben beprobt. Insgesamt 106 Seren waren im cELISA reaktiv; hiervon wurden bei sechs Pferden IgM-Antikörper festgestellt. Im VNT zeigten 54/106 Pferden neutralisierende Antikörper gegen das WNV, 35/106 Pferden Antikörper gegen das FSMEV und 8/106 Seren neutralisierten das USUV. Die WNV-Seroprävalenz lag auf Pferde-Ebene bei 5,8 % und auf Betriebsebene bei 21,3 %, In den Fall-LK war die Seroprävalenz mit 7,2 % signifikant höher als in den Kontroll-LK mit 2,7 %. Seropositive Pferde konnten in allen sechs Fall-LK, und in zwei der drei Kontroll-LK ermittelt werden. Das Regressionsmodell zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Seropositivität für sechs Variablen. Der Typus Pony und eine zunehmende WNV-Impfdichte im Betrieb verringerten die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität, während die Haltung in einem Fall-LK, 24h Zugang zum Auslauf, die Existenz eines Unterstandes im Auslauf und die Verwendung einer Fliegendecke die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität erhöhten. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse bestätigen eine WNV-Zirkulation in Mitteldeutschland mit einer Seroprävalenz von 5,8 % in der lokalen Pferdepopulation. Neben dem WNV zirkulieren mit FSMEV und USUV mindestens zwei weitere eng verwandte Flaviviren in der Region, wovon die durch das FMEV ausgelöste FSME als Differentialdiagnose für Erkrankungen mit neurologischen Erscheinungsformen in Betracht gezogen werden sollte. In Bezug auf die Risikofaktoren bleibt fraglich, ob Ponys einem reduzierten Risiko der Infektion unterliegen. Die Haltung in Landkreisen mit bereits registrierten equinen WNV-Infektionen sowie ein permanenter Zugang zum Auslauf in der insektenreichen Zeit von April bis November steigert das Risiko einer WNV-Infektion für Pferde.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das West-Nil-Virus 2.1.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.1.2 Übertragung 2.1.3 Epidemiologie 2.1.4 Pathogenese und Pathologie 2.1.5 Immunologie 2.1.6 Diagnostik 2.1.7 Klinische Symptomatik 2.1.8 Therapie und Prophylaxe 2.1.9 Tierseuchenrechtliche Regelung equiner WNV-Infektionen 2.2 Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus 2.2.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.2.2 Übertragung 2.2.3 Epidemiologie 2.2.4 Pathogenese und Immunologie 2.2.5 Diagnostik 2.2.6 Klinische Symptomatik 2.3 Das Usutu-Virus 2.3.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.3.2 Übertragung 2.3.3 Epidemiologie 2.3.4 Pathogenese und Immunologie 2.3.5 Diagnostik 2.3.6 Klinische Symptomatik 3 Ziele der Studie 4 Publikation 4.1 Stellungnahme zum Eigenanteil 4.2 Ergänzende Daten der Publikation 4.2.1 Tabelle 1: Beschreibung teilnehmender Betriebe 4.2.2 Tabelle 2: Deskriptive Statistik auf Pferde-Ebene 4.2.3 Tabelle 3: Laborergebnisse Serologie 4.2.4 Tabelle 4: Univariate Analyse 4.2.6 Tabelle 5: Logistische Regression 5 Diskussion 5.1 WNV-Seroprävalenz 5.1.1 Vergleich innerhalb Europas 5.1.2 Vergleich zwischen Fall- und Kontroll-Landkreisen 5.2 Verbreitung FSMEV 5.3 Verbreitung USUV 5.4 Risikofaktoren für WNV-Seropositivität 5.4.1 Typus 5.4.2 Landkreise 5.4.3 Haltungsform und die Existenz eines Unterstandes 5.4.4 WNV Impfdichte im Betrieb 5.4.5 Nutzung einer Fliegendecke 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Danksagung

Einleitung: Das West Nil-Virus (WNV) und das Usutu-Virus (USUV) zirkulieren seit vielen Jahren in Europa und sind auch in Deutschland endemisch geworden. Beide Viren können schwere Erkrankungen in Vögeln auslösen. Zudem kann insbesondere WNV auch zu schweren neurologischen Erkrankungen bei Menschen und Pferden führen, und unentdeckte WNV-Infektionen sind ein Risiko für die Sicherheit von Blutspenden. WNV und USUV werden von Stechmücken als biologische Vektoren übertragen, wobei sich verschiedene Mückenspezies in ihrer Vektorkompetenz unterscheiden können. Die Kenntnis über die Vektorkompetenz von Mückenspezies ist essentiell für die effiziente Überwachung und Bekämpfung dieser Viren. Weitgehend unbekannt ist jedoch, welche Auswirkungen Ko-Infektionen mit WNV und USUV auf die Vektorkompetenz von Stechmücken haben. Ziele der Untersuchungen: Ziel der ersten Studie war es, die Vektorkompetenz der bislang wenig untersuchten Mückenspezies Aedes punctor für WNV zu bestimmen. Mit der zweiten Studie sollten Mono- und simultane Ko-Infektionen mit WNV und USUV in verschiedenen Stechmückenarten (Culex pipiens Biotyp pipiens, Culex pipiens Biotyp molestus, Aedes vexans) durchgeführt werden, um die Auswirkungen von Ko-Infektionen auf die Übertragung beider Viren zu bestimmen. Tiere, Material und Methoden: Die für die Versuche verwendeten Stechmücken wurden entweder in Deutschland gesammelt oder stammten aus den Laborkolonien am Friedrich-Loeffler-Institut. Die Infektionen erfolgten oral über Blut, welches ein oder beide Viren enthielt und über Wattestäbchen angeboten wurde. Blutgesogene Weibchen wurden über einen definierten Zeitraum unter definierten Umweltbedingungen inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die noch lebenden Tiere durch das Entfernen der Beine und Flügel immobilisiert, um die Gewinnung von Speichel zu ermöglichen. Ein Teil der Speichelprobe wurde auf eine Zellkultur gegeben, um infektiöse Viruspartikel nachzuweisen. Zur Bestimmung der Infektion, Dissemination und potenzieller Übertragung wurden die Körper, die Beine und Flügel, die Speichelproben sowie der Überstand der Zellkultur mit einer quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) auf virale RNA untersucht. Im Falle der Ko-Infektionsstudie wurden zeitgleich Mono-Infektionen durchgeführt und die Ergebnisse verglichen, um potenzielle Veränderungen in Empfänglichkeit oder Übertragung feststellen zu können. Ergebnisse: In der ersten Studie zeigte sich, dass Ae. punctor nicht vektorkompetent für WNV ist. Von insgesamt 155 untersuchten Weibchen waren nur 7 Tiere mit WNV infiziert. In den Speichelproben wurden weder infektiöse Viruspartikel noch virale RNA nachgewiesen. In der zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass sowohl Cx. pipiens Biotyp pipiens als auch Cx. pipiens Biotyp molestus effektive Vektoren für WNV und USUV sein können. Im Gegensatz dazu waren Ae. vexans Weibchen nicht empfänglich für eine Infektion durch WNV oder USUV. In den Ko-Infektionen zeigte sich, dass die Empfänglichkeit für USUV in Cx. pipiens Biotyp pipiens verringert und in Ae. vexans erhöht war. In Cx. pipiens Biotyp molestus waren hingegen keine Unterschiede zwischen Mono- und Ko-infektionen festzustellen. Bei Cx. pipiens Biotyp molestus wurden infektiöse Partikel beider Viren in Speichelproben gefunden, was auf eine potenzielle Ko-Übertragung hindeutet. Schlussfolgerung: Aufgrund der Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass Ae. punctor und Ae. vexans derzeit keine Rolle bei der Übertragung von WNV oder USUV spielen und daher vorerst bei Überwachungsprogrammen in Deutschland nicht berücksichtigt werden müssen. Für Cx. pipiens Mücken konnte hingegen die Rolle als Hauptvektoren für WNV und USUV durch Infektionsstudien bestätigt werden. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen WNV und USUV in der Stechmücke speziesabhängig variiert. Aufgrund dessen ist eine Untersuchung von Ko-Infektionen in weiteren potenziellen Vektorspezies notwendig, um ein besseres Verständnis der Interaktionen zu bekommen. Die Studie zeigt auch, dass unter Umständen auch nicht vektorkompetente Spezies durch eine Ko-Infektion eine Rolle in der Übertragung der Viren spielen könnten. In Gebieten, in denen WNV und USUV sympatrisch zirkulieren, sollte diese Erkenntnis in den Überwachungs- und Bekämpfungsstrategien berücksichtigt werden. Eine potenzielle Ko-Übertragung beider Viren wurde zwar beobachtet, trat innerhalb dieser Studie aber selten auf und scheint daher eher eine geringe Rolle spielen. / Introduction: West Nile virus (WNV) and Usutu virus (USUV) have been circulating in Europe for many years and have also become endemic in Germany. Both viruses can cause severe diseases in birds. In addition, WNV in particular can also lead to severe neurological diseases in humans and horses, and undetected WNV infections pose a risk to the safety of blood donations. Both WNV and USUV are transmitted by mosquitoes as biological vectors, whereby different mosquito species can differ in their vector competence. Knowledge of the vector competence of various mosquito species is essential for efficient surveillance and control of these viruses. What is largely unknown, however, is the impact of co-infections with WNV and USUV on the vector competence of mosquitoes. Objective: The aim of the first study was to determine the vector competence of the mosquito species Aedes punctor for WNV, which has so far been little studied. The second study aimed to perform mono- and simultaneous co-infections with WNV and USUV in different mosquito species (Culex pipiens biotype pipiens, Culex pipiens biotype molestus, Aedes vexans) in order to determine the impact of co-infections on the transmission of both viruses. Animals, material and methods: The mosquitoes used for the experiments were either collected in Germany or were taken from the laboratory colonies at the Friedrich-Loeffler-Institute. Mosquitoes were orally infected via a blood that contained one or both viruses using cotton sticks. Engorged females were incubated over a defined period of time under defined environmental conditions. At the end of the incubation period, surviving animals were immobilized by removing the legs and wings, and saliva was obtained. Part of each saliva sample was placed on cell culture to detect infectious virus particles. To determine infection, dissemination and potential transmission, the bodies, legs and wings, saliva samples and supernatant of the cell culture were analyzed for viral RNA by a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR). During the co-infection study, mono-infections were carried out at the same time as the co-infections and results were compared in order to be able to determine potential changes in susceptibility or transmission. Results: In the first study, Ae. punctor showed to be not susceptible for WNV. Of a total of 155 females examined, only 7 females were found infected. Neither infectious viral particles nor viral RNA was found in saliva samples. In the second study it could be shown that Cx. pipiens biotype pipiens as well as Cx. pipiens biotype molestus can be effective vectors for WNV and USUV. In contrast, Ae. vexans was not susceptible to an infection with WNV or USUV. In Co-infections, it was shown that the susceptibility to USUV was reduced in Cx. pipiens biotype pipiens and increased in Ae. vexans. In Cx. pipiens biotype molestus, however, no differences were found between mono- and co-infections. In Cx. pipiens biotype molestus mosquitoes, infectious particles of both viruses were found in saliva samples, indicating a potential co-transmission by this species. Conclusion: Based on the results, it can be assumed that Ae. punctor and Ae. vexans do not play a role in WNV and USUV transmission and therefore currently do not need to be included in a surveillance in Germany. In contrast, the role of Cx. pipiens mosquitoes as main vectors for WNV and USUV could be confirmed by infection studies. It could also be shown that the interaction between WNV and USUV in the mosquito vector varies and is species dependent. Therefore, an investigation of co-infections in various potential vector species and even different populations is essential to get a better understanding of the interactions between both viruses within the mosquito. The study also showed that, under certain circumstances, non-vector-competent species might also play a role in the transmission of the viruses in the event of a co-infection. Thus, in areas where WNV and USUV are both endemic, surveillance and control programs should take this knowledge into account. Potential co-transmission of both viruses was observed, but was rare in this study and therefore seems to play a rather minor role.