Das West-Nil-Virus (WNV) ist eine Zoonose mit weltweit zunehmender Verbreitung. Natürliches Reservoir dieses Flavivirus sind Vögel, aber auch Säugetiere wie z.B. Menschen können infiziert werden. In einigen Fällen führt eine WNV-Infektion zu schweren neurologischen Erkrankungen. Infolgedessen werden effektive und biologisch sichere Impfstrategien gegen dieses Virus benötigt. Eine Alternative zu herkömmlichen Impfmethoden beschreibt die DNA-Immunisierung. In dieser Arbeit wurde ein potentieller DNA-Impfstoff gegen das WNV hergestellt. Die Immunisierung des DNA-Vektors induzierte starke zelluläre und humorale Immunantworten in Mäusen. Zudem waren die Tiere gegen eine WNV-Infektion geschützt. Zusätzliche Impfungen mit rekombinantem WNV-Protein führten zu einer weiteren Steigerung der Immunogenität des DNA-Impfstoffkandidaten. Des Weiteren sollte der nicht-virale Gentransfer im Allgemeinen optimiert werden. Ein neu entwickeltes Transportsystem für Plasmid-DNA, bestehend aus natürlichen Histonextrakten und Polyethylenimin, resultierte in einer verbesserten Proteinexpression in in vitro transfizierten Zellen und wurde von diesen sehr gut toleriert. Daher wäre diese Strategie auch für zukünftige DNA-Impftechniken denkbar. Der Einfluss von WNV auf die Expression zellulärer miRNAs in Wirtszellen wurde bisher noch nicht untersucht. Dennoch könnten auf diese Weise potentielle molekulare Biomarker für eine frühe WNV-Diagnose identifiziert werden. Mittels Microarray-Technik wurde die Expression zellulärer miRNAs analysiert. Verschiedene miRNA-Spezies waren infolge einer WNV-Infektion leicht herunter- bzw. hochreguliert und stellen mögliche diagnostische Biomarker für das Virus dar.

Das West-Nil-Virus (WNV) ist eine Zoonose mit weltweit zunehmender Verbreitung. Natürliches Reservoir dieses Flavivirus sind Vögel, aber auch Säugetiere wie z.B. Menschen können infiziert werden. In einigen Fällen führt eine WNV-Infektion zu schweren neurologischen Erkrankungen. Infolgedessen werden effektive und biologisch sichere Impfstrategien gegen dieses Virus benötigt. Eine Alternative zu herkömmlichen Impfmethoden beschreibt die DNA-Immunisierung. In dieser Arbeit wurde ein potentieller DNA-Impfstoff gegen das WNV hergestellt. Die Immunisierung des DNA-Vektors induzierte starke zelluläre und humorale Immunantworten in Mäusen. Zudem waren die Tiere gegen eine WNV-Infektion geschützt. Zusätzliche Impfungen mit rekombinantem WNV-Protein führten zu einer weiteren Steigerung der Immunogenität des DNA-Impfstoffkandidaten. Des Weiteren sollte der nicht-virale Gentransfer im Allgemeinen optimiert werden. Ein neu entwickeltes Transportsystem für Plasmid-DNA, bestehend aus natürlichen Histonextrakten und Polyethylenimin, resultierte in einer verbesserten Proteinexpression in in vitro transfizierten Zellen und wurde von diesen sehr gut toleriert. Daher wäre diese Strategie auch für zukünftige DNA-Impftechniken denkbar. Der Einfluss von WNV auf die Expression zellulärer miRNAs in Wirtszellen wurde bisher noch nicht untersucht. Dennoch könnten auf diese Weise potentielle molekulare Biomarker für eine frühe WNV-Diagnose identifiziert werden. Mittels Microarray-Technik wurde die Expression zellulärer miRNAs analysiert. Verschiedene miRNA-Spezies waren infolge einer WNV-Infektion leicht herunter- bzw. hochreguliert und stellen mögliche diagnostische Biomarker für das Virus dar.

Die Entwicklung eines effektiven HIV-Impfstoffes ist bis heute nicht gelungen.Konventionelle Immunisierungsstrategien mit rekombinant hergestellten Hüllproteinen des Virus in verschiedensten Formen induzierten keine subtypenübergreifende, protektive Immunantwort gegen HIV. Die Gewinnung und Charakterisierung der gp41-spezifischen breit neutralisierenden monoklonalen Antikörper 2F5 und 4E10 bildete die Grundlage einer Reihe neuer epitopgerichteter Ansätze für die HIV-Impfstoffentwicklung. Bisherige Immunisierungsstudien basierten auf der Verwendung des linearen Hauptepitopes (E2) der beiden Antikörper aus dem C-terminalen Teil der Ektodomäne von gp41. Nach neueren Erkenntnissen, reicht für eine effektive Neutralisation durch 2F5 oder 4E10 die Bindung dieser Antikörper an ihr lineares Epitop in der membran proximalen externen Region (MPER) von gp41 allein nicht aus. Vielmehr wurde die Beteiligung einer N-terminalen Domäne (E1) von gp41 an der neutralisationsaktiven Bindung von 2F5 bzw. 4E10 postuliert. In dieser Arbeit wurden die beiden 2F5 und 4E10 spezifischen Epitopbereiche E1 und E2 des gp41 erstmals in das strukturell verwandte transmembrane Hüllprotein des Koala Retrovirus (KoRV) eingebracht. Die Applikation der hergestellten Antigene erfolgte sowohl in Form der codierenden DNA mittels ballistischer Immunisierung (GeneGun®) als auch durch bakteriell exprimierte Proteine. Mit beiden Strategien konnten für drei Hybridproteine in den ersten Studien eine HIV-1 gp41 spezifische, breit neutralisierende humorale Immunantwort induziert werden. Diese Ergebnisse konnten jedoch in späteren Studien nicht reproduziert werden. Die Analyse der induzierten Immunantworten zeigte eine Verlagerung der Hauptimmunantwort als deren Ursache eine bakterielle Fremdinfektion der Versuchtiere diskutiert wurde. Zur Evaluierung der Immunisierungsstudien wurde ein neuartiger real time PCR basierter in vitro Neutralisationstest um Kontrollen zur Virusspezifität und Cytotoxizität erweitert. / The development of an effective HIV vaccine is considered the to play a key role in controlling the HIV pandemic. Conventional immunisation strategies using recombinant envelope proteins of the virus did not lead to the induction of a broad range protective immunity. A new target sequence for the induction of a broadly neutralising humoral immune response has been discovered through the characterization of the gp41 specific broadly neutralising monoclonal antibodies 2F5 and 4E10. Until now all attempts to induce 2F5/4E10 like neutralising antibodies failed. So far only the linear main epitope (E2) of 2F5 and 4E10, located in the C-terminal part of the gp41 ectodomain was used as the target sequence. However, it was recently shown that an N-terminal domain (E1) of gp41 increases the avidity of 2F5 to its epitope. The E1 domain may therefore be involved in the mediation of a neutralisation active binding. For the first time immunisation strategies have been developed that target both previously identified domains (E1 and E2) of gp41. The sequences corresponding to E1 and E2 have been introduced at homologous positions in the structurally related transmembrane envelope protein p15E of the Koala Retrovirus (KoRV). These generated hybrid antigens have been used for immunisation of wistar rats. They were applied as recombinant proteins expressed in E.coli and as DNA using a ballistic immunisation (GeneGun®) approach. Although in first trials neutralising antibodies specific for gp41 of HIV-1 were induced, these results could not be reproduced. Analysis of the induced antibodies showed a shift of their binding specifity. A bacterial infection of the used animals was identified as the cause of the unexpected shift in the antigen specific humoral immune response. For evaluation of the immunisation studies a new neutralisation assay based on the measurement of provirus integration by duplex real time PCR has been extended for controls of virus specifity and cytotoxicity.