A regeneração de defeitos ósseos continua sendo um grande desafio na área de Odontologia e Medicina. É bem estabelecido que células-tronco mesenquimais (CTMs) e osteoblastos (OBs) desempenham um papel crítico na osteogênese, tornando-se candidatos a utilização em procedimentos de terapia celular que visam otimizar o processo de reparação óssea. Porém, pouco se sabe sobre a interação entre CTMs e OBs, e a maioria dos estudos enfatiza o efeito dos OBs sobre CTMs, fazendo com que a influência das CTMs na atividade osteogênica dos OBs continue sendo uma questão desafiadora. Baseados em nossos estudos anteriores, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de CTMs e OBs poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente, principalmente como resultado da estimulação de OBs por CTMs. Para tal, foi realizado estudo in vitro para avaliar os efeitos das CTMs sobre os OBs e in vivo para avaliar os efeitos dessas células, isoladamente e combinadas, sobre a reparação óssea. CTMs da medula óssea de rato foram cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs ou em meio osteogênico para diferenciarem-se em OBs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas in vitro em três diferentes condições: (1) co-cultura direta de CTMs e OBs usando três proporções celulares (1:1, 1:2 e 2:1), (2) co-cultura indireta de CTMs e OBs usando insertos e (3) OBs cultivados em meio condicionado por CTMs. Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN) e migração celular. Para os experimentos in vivo, as células foram carreadas em esponja de colágeno através de vários ciclos de centrifugação. Após, defeitos ósseos em calvária de rato foram preenchidos com (1) esponja de colágeno sem células, (2) esponja de colágeno com CTMs, (3) esponja de colágeno com OBs e (4) esponja de colágeno com associação de CTMs e OBs. Para avaliação da reparação óssea in vivo após 4 semanas, foram realizadas análises histomorfométricas através de cortes histológicos e microtomografia computadorizada. Os dados foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e, se necessário pelo teste de Mann-Whitney (p≤0,05). Foi observado que CTMs têm efeito repressivo sobre a proliferação e as expressões fenotípicas e genotípicas de OBs (P≤0,05). Em relação ao reparo dos defeitos ósseos, somente naqueles tratados com células observou-se formação óssea predominantemente como ilhotas isoladas e diferenças, principalmente qualitativas, entre os tipos celulares utilizados, com tendência de maior formação óssea em defeitos tratados com OBs em comparação ao uso de CTMs. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que as CTMs apresentam efeito inibitório sobre OBs e que a terapia celular com OBs parece ser mais eficaz no reparo do tecido ósseo. / The regeneration of bone defects remains a major challenge in the field of Dentistry and Medicine. It is well known that mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoblasts (OBs) play critical roles in osteogenesis, making them promising alternatives to be employed in cell therapy procedures to enhance the process of bone regeneration. Studies about the crosstalk between MSCs and OBs are mainly focused on the effect of OBs on MSCs, thus how MSCs may affect OBs phenotype expression remains a challenging question. Based on our previous studies, we have hypothesized that cell therapy using a combination of MSCs and OBs could be more effective for the bone repair than these cells separately, mainly due to the stimulation of OBs by MSCs. For this, we carried out in vitro experiments to evaluate the effects of MSCs on the OBs and in vivo experiments to assess the effects of these cells either isolated or combined on bone repair. Rat bone marrow MSCs were cultured either in growth medium to keep MSCs features or in osteogenic medium to differentiate into OBs. After reaching subconfluence, cells were grown in vitro in three different conditions: (1) direct coculture of MSCs and OBs using three cell proportions (1:1, 1:2 and 2:1), (2) indirect coculture of MSCs and OBs using transwell porous filters and (3) OBs cultured in MSCs conditioned medium. Cell responses were evaluated by assaying cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation, gene expression of osteoblast markers, immunolocalization of bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), and cell migration. For in vivo experiments, cells were seeded into collagen sponge by a centrifugation method. After, calvarial defects were implanted with (1) collagen sponge without cells, (2) collagen sponge with MSCs, (3) collagen sponge with OBs, and (4) collagen sponge and association of MSCs with OBs. To evaluate bone repair at the end of 4 weeks, histomorphometric analyzes were carried out using histological slides and micro-computed tomography. Data were compared by Kruskal-Wallis test and, if appropriated, by Mann-Whtiney test (p≤0.05). It was observed that MSCs repressed proliferation, phenotypic and genotypic expressions of OBs (P≤0.05). Bone formation was observed only in cell treated defects as isolated islets and qualitative differences were noticed among cell types, with a tendency of more bone formation in OBs treated defects compared with MSCs ones. Based on these results, we can conclude that MSCs exhibited inhibitory effect on OBs and that cell therapy with OBs seemed to be more effective for bone repair.

O tecido ósseo possui potencial regenerativo e capacidade em restaurar completamente sua estrutura e função original. Há situações em que o organismo não consegue por si só, a reparação desejada dos defeitos ósseos. Vários métodos são propostos para a reparação de defeitos ósseos, entre eles, o uso de diferentes tipos de enxertos os quais demonstram capacidade em promover a formação óssea. Por muitos anos o osso autógeno foi considerado a referência padrão como enxerto ósseo, devido as suas vantagens biológicas e potencial osteogênico. Entretanto, por este material apresentar limitações, estimulou-se a pesquisa para um substituto ósseo ideal para o enxerto ósseo autogênico. O advento de um novo biomaterial xenogênico, como o osso bovino, que se comporta como promotor de reparação e é portador de fatores de indução óssea parece representar o futuro da reconstrução de defeitos ósseos. Mas pelo pequeno potencial de regeneração óssea produzida pelos enxertos alógenos e xenógenos, os pesquisadores tem utilizado a bioengenharia tecidual óssea para reconstrução de defeitos ósseos. Diante destas informações, este estudo teve como objetivo quantificar histomorfometricamente a reparação óssea após o enxerto de uma associação de osso autógeno e/ou osso bovino composto (Gen-Mix) associados a células- tronco mesenquimais em defeitos ósseos produzidos pela extração dental de ratos. 108 ratos foram separados em 6 grupos : Controle (c) - o defeito ósseo foi preenchido só por sangue; Osso autógeno (oa) - o defeito ósseo foi preenchido por sangue e osso autógeno; Gen-Mix (G-mix) o defeito ósseo foi preenchido por osso bovino composto (osso medular e cortical), liofilizado, desproteinizado, desmineralizado com aglutinante de colágeno bovino, na forma de grânulos de 0,25 a 1.0 mm (Gen-Mix, Baumer, Mogi Mirim, SP, Brasil); Célula-tronco (ctr)o defeito ósseo foi preenchido por sangue e células- tronco obtidas da medula óssea;Osso autógeno + células-tronco(oa+ctr)- o defeito foi preenchido pela associação destes dois compostos; Gen-Mix + células-tronco (G-mix+ctr)- o defeito foi preenchido pela associação dos dois produtos. Os animais foram sacrificados nos períodos de 7, 21 e 42 dias pós-cirurgia (n=6 por grupo) e as amostras teciduais foram processadas para a obtenção de secções finas (5 µ) e coradas com HE. Através de um sistema de análise de imagens se estimou a fração de volume do osso trabecular (%) nas vizinhanças do enxerto no interior do alvéolo. Os resultados histológicos mostraram que os materiais enxertados apresentaram uma osteointegração progressiva e sem reação de corpo estranho. A histometria revelou que o grupo enxertado com G-mix sozinho ou associado as célula- tronco produziu menor formação de osso, ao passo que, o osso autógeno sozinho ou associado ás células-tronco foi superior em volume de tecido ósseo em relação aos demais grupos. Conclui-se que o osso autógeno e o Gen-mix isoladamente ou associados ás célula- tronco foram biologicamente compatíveis desenvolvendo osteointegração progressiva e que o osso autógeno foi superior no processo de reparação do defeito ósseo. Estes resultados ainda sugerem que a associação das células-tronco aos enxertos ósseos acelerou a neoformação óssea, principalmente quando associadas ao osso autógeno. / Bone tissue has a regenerative potential as well as a capacity to fully restore its original structure and function. There are situations in which the body cannot repair in a proper way bone defects by itself. Several methods are proposed for repairing bone defects, among them there is the use of different types of grafts that demonstrates the capacity to promote bone formation. For many years, autogenous bone was considered the standard reference as bone grafts, due to its biological advantages and osteogenic potential. However, due to these material limitations, an ideal bone substitute research was encouraged for an autogenous bone graft. The advent of new xenogenic biomaterials, such as bovine bone, that behaves as a repair promoter and also has an induction bone factors, seems to represent the future reconstruction of bone defects. Researchers have used the bioengineered bone tissue for reconstruction of bone defects, due to the short potential produced by xenogeneic and allogenic grafts for bone regeneration. As the previous information show, this study aimed to quantify the histomorphometric bone healing after grafting a combination of autogenous bone and / or bovine bone composite (Gen-Mix) associated with mesenchymal stem cells in bone defects produced by tooth extraction in rats. 108 rats were divided into 6 groups: control (c) - the bone defect was filled only by blood, autogenous bone (oa) - the bone defect was filled with blood and autogenous bone graft; Gen-Mix (G-mix) bone defect were filled by bovine bone composite (marrow and cortical bone), lyophilized, deproteinized, demineralized with bovine collagen binder, in form of 0.25 to 1.0 mm granules (Gen-Mix, Baumer, Mogi Mirim, SP, Brazil); stem cells (ctr), the bone defect was filled with blood and stem cells obtained from bone marrow, autogenous bone + stem cells (oa + ctr) - the defect was filled by the association of these two compounds; Gen-Mix + stem cells ( G-mix + ctr) - the defect was filled by the association of both products. The animals were sacrificed at 7, 21 and 42 days post-surgery (n = 6 per group) and tissue samples were processed to obtain thin sections (5 µ) and stained with HE. The fraction of trabecular bone volume (%) in the vicinity of the graft inside the alveoli was estimated through an image analysis system. Histological findings showed that the grafted material has a progressive osseointegration and no foreign body reaction. The histometric analysis revealed that the group grafted with G-mix alone or associated with stem cells produced less bone formation, while the autogenous bone alone or associated with stem cells was higher in volume of bone tissue in relation to other groups. We conclude that autogenous bone and Gen-mix alone or associated with stem cells are biologically compatible developing progressive osseointegration and the autogenous bone graft was superior in the bone defect repair process. These results also suggested that the association of stem cells to bone grafts accelerated the bone formation, especially when combined with autogenous bone.

Durante e após o processo de reparo alveolar pós-extração, ocorre certa remodelação óssea com reduções dimensionais deste tecido podendo comprometer a terapia em implantodontia. A fim de preservar/reconstruir tal tecido, vários métodos são propostos usando diferentes tipos de biomateriais e técnicas, os quais demonstram capacidade em formar osso. O osso autógeno ainda é considerado a referência padrão como enxerto ósseo, devido ao seu potencial osteogênico, osteoindutor e osteocondutor, mas morbidade relativa a este é conhecida. Por isso algumas biocerâmicas têm sido utilizadas, pois são sintéticas, biocompatíveis e com boas propriedades osteopreenchedoras, mas com baixa osteogenicidade. A engenharia tecidual óssea constituída de células tronco mesenquimais diferenciadas em osteoblastos é uma estratégia para o fornecimento adicional celular ao defeito ósseo em reconstrução. O objetivo deste estudo foi qualificar e quantificar a reparação óssea após o enxerto de uma associação de osso autógeno e células osteoblásticas carreadas por uma biocerâmica em defeitos ósseos produzidos pela extração dentária. Os animais foram divididos de acordo com o material implantado no alvéolo dentário pós-extração em: Controle (c), osso autógeno (oa), células osteoblásticas (co), biocerâmica (bc), osso autógeno + células osteoblásticas (oa+co), osso autógeno + biocerâmica (oa+bc), biocerâmica + células osteoblásticas (bc+co), e biocerâmica + células osteoblásticas + osso autógeno (bc+co+oa). O sacrifício ocorreu aos 7, 21 e 42 dias pós-cirurgia e as amostras teciduais foram processadas para análise em microscopia de luz e eletrônica de varredura. Através de um sistema de análise de imagens foi avaliado a qualidade dos biomateriais implantados e o volume de osso, biocerâmica, conjuntivo e coágulo no defeito ósseo. Os resultados qualitativos revelaram que a biocerâmica implantada foi biocompatível e estava intimamente unida ao osso. O uso das células osteoblásticas, do osso autógeno ou da biocerâmica não desencadearam reações imunogênicas, de corpo estranho ou formação tumoral. Histometricamente as células osteoblásticas carreadas pela biocerâmica mostraram um preenchimento ósseo 19,0% maior do que quando não carreadas. A associação biocerâmica/células osteoblásticas + osso autógeno promoveu, aos 7 dias, uma deposição óssea 56,52% mais efetiva nos arredores do biomaterial do que a enxertia da biocerâmica isoladamente (1%). Conclui-se que a biocerâmica em questão pode ser um viável carreador às células osteoblásticas a serem enxertadas em sítios de reconstrução óssea, e que este composto híbrido recebe um efeito sinérgico quando da associação ao osso autógeno, sendo capaz desta forma de acelerar o processo de neoformação óssea principalmente nos períodos iniciais da reparação alveolar. / During and after the process of alveolar repair post-extraction, bone remodeling occurs with certain dimensional reductions of this tissue that can compromise the therapy in implantology. In order to preserve/reconstruct such tissue, various methods are proposed using different types of biomaterials and techniques which demonstrate the capacity to form bone. The autogenous bone is still regarded as the gold standard bone graft, due to their osteogenic, osteoinductive and osteoconductive potential, but morbidity is known about it. Therefore some bioceramics have been used, as they are synthetic, biocompatible and with good properties of bone fill, but with low osteogenic potential. The bone tissue engineering consists of mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts is a strategy for providing additional cell in the bone defect reconstruction. The aim of this study was to qualify and quantify bone healing after grafting of an association of autogenous bone and osteoblastic cells carried by a bioceramic in bone defects produced by tooth extraction. The animals were divided according to the implanted material in dental socket after extraction: Control (c), autogenous bone (ab), osteoblastic cells (oc), bioceramic (bc), autogenous bone + osteoblastic cells (ab+oc), autogenous bone + bioceramic (ab+bc), bioceramic + osteoblastic cells (bc+oc), and bioceramic + autogenous bone + osteoblastic cells (bc+oc+ab). The animals were sacrificed at 7, 21 and 42 days post-surgery and tissue samples were processed for light microscopy and scanning electron microscopy. Through an image analysis system the quality of implanted biomaterials and the volume of bone, bioceramic, conjunctive tissue and blood clot was evaluated inside the bone defect. Qualitative results revealed that the grafted bioceramic was biocompatible and intimately bonded with the bone. The use of osteoblastic cells, autogenous bone or bioceramic didnt trigger immunogenic reactions, foreign body or tumor formation. Histometrically, the osteoblast cells carried by bioceramic showed a bone filling 19.0% higher than when not carried. The bioceramic/osteoblastic cells + autogenous bone association promoted, at 7 days, a bone deposition 56.52% more effective around the biomaterial than the grafting of bioceramic alone (1%). It was concluded that the bioceramic in question may be a viable carrier to osteoblastic cells to be grafted on sites of bone reconstruction, and this hybrid compound receives a synergistic effect when associated to autogenous bone, thus being able to accelerate the bone formation especially in the early periods of alveolar repair.

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No. of bitstreams: 1 TeseHWK.pdf: 5259387 bytes, checksum: 72d4bd1fcb3174ede9d168165f46252a (MD5) Previous issue date: 2015-03-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The present study aimed to evaluate the effect of two different Biosilicate® (P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system) presentations - highly porous scaffold and composite material – on a tibial bone defect model in rats. Two studies were performed; the first one aimed at evaluating the effect of highly porous scaffolds on bone regeneration using histopathological analysis, immunohistochemistry and immunoenzymatic assay. In this study, 80 male Wistar rats (12 weeks old and body weight of approximately 300 g) were divided in two groups (control and Biosilicate®) and euthanized after 3, 7, 14 and 21 days post-surgery. The histopathological evaluation revealed that both groups presented similar inflammatory responses after 3 and 7 days. At all time points, the scaffold degradation was observed, mainly in the border of the material, allowing the ingrowth of newly formed bone. The immunohistochemical analysis showed that the Biosilicate® scaffolds induced the synthesis of (i) ciclooxigenase 2 (COX-2), (ii) vascular endothelial growth factor (VEGF) and (iii) runt-related transcription factor 2 (RUNX-2). Additionally, the immunoenzymatic assay indicated that the Biosilicate® group did not presented significant statistical difference in the levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in all evaluated periods compared to the control group. In addition, the Biosilicate® group presented a higher concentration of interleukin 4 (IL-4) at day 14 and a lower concentration of interleukin 10 (IL-10) 21 days after the surgery when compared to the control group. The second study aimed at investigating the effects of Biosilicate®/poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) composites on the process of bone repair using histopathological, morphometric, immunohistochemical and gene expression (Real-Time PCR, qRT-PCR) analyses. In this study, 80 male Wistar rats were distributed in two groups (Biosilicate® and Biosilicate®/PLGA) and euthanized 3, 7, 14 and 21 days after the material implantation. The main findings showed that the incorporation of PLGA into the Biosilicate® had a significant effect in the material morphological structure, leading to a pH decrease and accelerating the mass loss upon incubation in phosphate buffered saline (PBS). Moreover, the histological evaluation revealed that the Biosilicate®/PLGA group presented a higher material degradation accompanied by a higher bone formation when compared to the plain Biosilicate® after 21 days. The immunohistochemical analysis did not show any difference in the immunolabeling for Runx2, RANKL and OPG between Biosilicate® and Biosilicate®/PLGA. In addition, the qRT-PCR indicated that the Biosilicate®/PLGA induced the osteogenic gene expressions (bone morphogenetic protein 4, Runtrelated transcription factor 2 and osteocalcin) at 21 day after surgery. The results evidenced by the present studies suggest that both materials (highly porous Biosilicate® scaffolds and Biosilicate®/PLGA composites) were effective in inducing the repair of tibial bone defects in rats, demonstrating that these materials are promising alternatives for treating bone fractures. / O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a ação de duas diferentes apresentações (scaffold altamente poroso ou compósito contendo PLGA) de uma vitrocerâmica bioativa do sistema quaternário P2O5-Na2O-CaO-SiO2 (Biosilicato®) sobre o processo de reparação óssea em um modelo de defeito ósseo tibial em ratos. Para isto, foram realizados dois estudos, sendo que o primeiro teve como objetivo avaliar os efeitos dos scaffolds altamente porosos de Biosilicato® sobre o processo de regeneração óssea por meio da avaliação histopatológica, imunohistoquímica e ensaio imunoenzimático. Neste estudo, 80 ratos machos Wistar (12 semanas de idade e peso corporal de aproximadamente 300 g) foram divididos em dois grupos (controle e Biosilicato®) e eutanasiados após 3, 7, 14 e 21 dias do procedimento cirúrgico. A avalição histopatológica revelou que ambos os grupos apresentaram uma resposta inflamatória similar no período de 3 e 7 dias após a cirurgia. Durante todos os períodos experimentais, a degradação dos scaffolds de Biosilicato® foi observada principalmente na região periférica do material, o que possibilitou o desenvolvimento do tecido ósseo neoformado para o interior destes materiais. A Análise imunohistoquímica demonstrou que os scaffolds de Biosilicato® estimularam a síntese da ciclooxigenase 2 (COX-2), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de transcrição relacionado a runt-2 (Runx2). Além disso, o ensaio imunoenzimático revelou que o grupo Biosilicato® não apresentou diferença estatística significativa nos níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em todos os períodos avaliados quando comparado ao grupo controle. Ainda, o grupo Biosilicato® apresentou uma maior concentração da interleucina 4 (IL-4) 14 dias e uma menor concentração da interleucina 10 (IL-10) 21 dias após a cirurgia, quando comparado ao grupo controle. O segundo estudo teve como objetivo investigar os efeitos do compósito de Biosilicato® e ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) sobre o processo de reparo ósseo através das análises histopatológica, morfomética, imunohistoquímica e de expressão gênica (PCR em tempo real, qRT-PCR). Neste estudo, 80 ratos machos Wistar foram distribuídos em dois grupos (Biosilicato® e Biosilicato®/PLGA) e eutanaziados após 3, 7, 14 e 21 dias do processo de implantação dos materiais. Os achados principais mostraram que a incorporação do PLGA na vitrocerâmica Biosilicato® teve um efeito significativo na estrutura morfológica do material, levando a diminuição do pH e acelerando a perda de massa após incubação do material em solução tampão fosfato (PBS). Além disso, a avaliação histológica revelou que o grupo Biosilicato®/PLGA apresentou uma maior degradação do material, acompanhada pela maior formação de osso quando comparado ao grupo somente com Biosilicato® no período de 21 dias. Na analise imunohistoquímica nenhuma diferença na imunomarcação de Runx2, receptor ativador do ligante nuclear fator kappa-B e osteoprotegerina foram observadas entre o grupo Biosilicato® e Biosilicato®/PLGA. Ainda, a análise de qRT-PCR demonstrou que o grupo Biosilicato®/PLGA induziu a expressão de genes osteogênicos (proteína morfogenética óssea 4, fator de transcrição relacionado a runt-2, e osteocalcina) 21 dias após cirurgia. Diante dos resultados encontrados nos dois estudos, é possível concluir que ambos os materiais utilizados neste estudo, scaffold de Biosilicato® altamente poroso e compósito de Biosilicato® e PLGA, foram eficazes em estimular o reparo de um defeito ósseo tibial em ratos, demonstrando serem alternativas promissoras para tratamento de fraturas ósseas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1063440 bytes, checksum: ef0168134cd45f44f68dc164d454613b (MD5) Previous issue date: 2008-02-27 / This study aimed to evaluate the composite made of synthetic hydroxyapatite associated with lignin, as a promoter of integration between a metal implant (intra-medullar pin, Schanz) and bone tissue. Twenty New Zealand rabbits were used, each of them had both tibia operated: the left one was treated with the composite and the right was not treated, serving as control. A 4mm diameter defect was made in the lateral side of the proximal tibia, reaching the medullar canal. Ten drops of saline solution were added to 1000mg of the composite, resulting in a mass, part of it was used to cover the thread end of the Schanz steel F 138 intra-medullar pin for cortical bone, size 2.5mm. Te other party was inserted in the medullar canal of the treated group with the help of a size 16 catheter and disposable syringe. After the insertion of the 7cm pin in the medullar canal, the cortical defect was filled with 400mg of the composite. The same procedure was done in the tibia control, without the composite. The animals were daily evaluated for 15 days, assessing the wound dehiscence, lameness, painful sensitivity and the tibia s circumference measured. Radiographs were performed immediately after surgery and 8, 30, 60, 90 and 120 days post-operative characterizing the radioopacity of cortical defect and around the intramedullary pin in both tibias, comparing to the surrounding bone. On the same dates, except on the day of surgery, 4 animals was euthanized and the region of the defect examined: measure of the cortical defect, mechanical traction test of the intramedullar pin, measure the material on the pin threads, medullar canal macroscopic evaluation, X-ray diffraction of the material obtained from the pin thread and the medullar canal, and histological evaluation. Most of the animals had normal clinical development in both groups. In treated group, both radiopacity of the defect and the surface around the pin decreased reaching a similarity to the adjacent bone, while the opposite was observed in the control group, but in this, the area around the pin remained radioluscent until the last observation date. The cortical defect was completely filled by new bone in both groups at the last evaluation date. No significant difference was found between groups for the mechanical traction test, although the values from treated group doubled the control group. Medullar canal macroscopic evaluation in the treated group showed regeneration of bone marrow and visibility loss of the composite on each observation date, almost complete at 120 days, suggesting phagocytosis of the composite. Regeneration of the bone marrow was observed in the control group, since the first day of their assessment. The circumference measures of the material on the threaded surface showed a linear increase with time in both groups, but presented a difference in the 90 and 120 days tissue s characteristic in the group treated: a hard material with macroscopic characteristics of bone. X-ray diffraction showed the evolution on the composite absorption and that the peaks observed in the last two dates presented characteristics consistent with the bone crystalline mineral part. The histological results showed normal bone regeneration in both groups, although the treated groups defect presented an earlier process and the presence of trabecular and compact bone in the medullar canal at the end of the evaluation. It can be concluded that the synthetic hydroxyapatite associated to lignin can guide the process of bone regeneration in the medullar cavity. / O objetivo deste trabalho foi avaliar o compósito de hidroxiapatita sintética associada à lignina, como promotor de integração entre um implante metálico (pino intramedular de Schanz) e o tecido ósseo. Foram utilizados 20 coelhos da raça Nova Zelândia, em cada um, a tíbia esquerda foi tratada com o compósito e a tíbia direita não foi tratada, servindo como controle. Foi realizada uma falha óssea de aproximadamente 4mm de diâmetro na face lateral proximal da tíbia, até atingir o canal medular. Do compósito, 1000mg foram amolecidos com 10 gotas de solução fisiológica utilizando parte da massa para revestir a extremidade rosqueada do pino intramedular de Schanz em aço F 138 de tamanho 2.5mm para osso cortical e a outra parte introduzida no canal medular do grupo tratado com o auxilio de cateter calibre 16 e seringa descartável. Após a introdução de 7cm de comprimento do pino no canal medular, o defeito cortical foi preenchido com 400mg do compósito. O mesmo foi realizado nas tíbias controle, sem a utilização do compósito. Os animais foram submetidos à avaliação clinica diária por 15 dias, avaliando deiscência da ferida, claudicação, sensibilidade dolorosa e circunferência tibial. Foram realizadas radiografias imediatamente após o procedimento cirúrgico e aos 8, 30, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório caracterizando a radiopacidade do defeito cortical e a radiopacidade ao redor do pino intramedular em ambas as tíbias, sempre comparadas ao osso circunvizinho. Nas mesmas datas, exceto no dia da cirurgia, 4 animais eutanasiaram-se e a região do defeito analisada: medida do defeito cortical, teste mecânico de tração do pino intramedular, medida do material aderido na rosca do pino, avaliação macroscópica do canal medular, teste de difração de raios X do material obtido da rosca do pino e do canal medular e avaliação histológica. A maioria dos animais teve evolução clinica normal. Nas radiografias do grupo tratado, houve um decréscimo da radiopacidade tanto no defeito como na superfície ao redor do pino até se tornar semelhante à do osso circunvizinho, quadro inverso observado no defeito cortical do grupo controle, mas a superfície ao redor do pino se manteve radiotransparente até o final da avaliação. Observou- se preenchimento completo do defeito cortical com tecido ósseo novo em ambos os grupos ao final da avaliação. No teste mecânico de tração, não se observaram diferenças significativas entre o grupo tratado e o controle, apesar de no primeiro o resultado obtido ser o dobro da resistência do no segundo. Na avaliação macroscópica do canal medular, o grupo tratado mostrou regeneração da medula óssea e perda da visibilidade do compósito em cada data de avaliação, sendo quase total na observação de 120 dias, sugerindo a fagocitose do compósito. Regeneração da medula óssea foi observada no grupo controle, desde o primeiro dia de sua avaliação. Observou-se nas medidas da circunferência do material aderido à rosca dos pinos uma tendência linear crescente com o tempo em ambos os grupos, com diferença na característica do tecido que desenvolveu aos 90 e 120 dias, sendo no grupo tratado um tecido de consistência dura com características macroscópicas de osso. Na difração de raios-X notou-se que o compósito foi absorvido com a evolução do tempo e que os picos observados nos dois últimos dias de avaliação, tiveram características cristalinas compatíveis com a parte mineral do osso. Os resultados histológicos mostraram evolução normal no processo de regeneração óssea nos dois grupos. Entretanto, nas tíbias tratadas, o processo de reparação óssea se mostrou mais precoce, a partir de 30 dias, tendo como diferença a presença de osso trabecular e compacto no canal medular ao final da avaliação. Com isso se conclui que é possível utilizar a hidroxiapatita sintética e lignina para guiar o processo regenerativo ósseo até o canal medular.

A regeneração de defeitos ósseos continua sendo um grande desafio na área de Odontologia e Medicina. É bem estabelecido que células-tronco mesenquimais (CTMs) e osteoblastos (OBs) desempenham um papel crítico na osteogênese, tornando-se candidatos a utilização em procedimentos de terapia celular que visam otimizar o processo de reparação óssea. Porém, pouco se sabe sobre a interação entre CTMs e OBs, e a maioria dos estudos enfatiza o efeito dos OBs sobre CTMs, fazendo com que a influência das CTMs na atividade osteogênica dos OBs continue sendo uma questão desafiadora. Baseados em nossos estudos anteriores, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de CTMs e OBs poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente, principalmente como resultado da estimulação de OBs por CTMs. Para tal, foi realizado estudo in vitro para avaliar os efeitos das CTMs sobre os OBs e in vivo para avaliar os efeitos dessas células, isoladamente e combinadas, sobre a reparação óssea. CTMs da medula óssea de rato foram cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs ou em meio osteogênico para diferenciarem-se em OBs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas in vitro em três diferentes condições: (1) co-cultura direta de CTMs e OBs usando três proporções celulares (1:1, 1:2 e 2:1), (2) co-cultura indireta de CTMs e OBs usando insertos e (3) OBs cultivados em meio condicionado por CTMs. Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN) e migração celular. Para os experimentos in vivo, as células foram carreadas em esponja de colágeno através de vários ciclos de centrifugação. Após, defeitos ósseos em calvária de rato foram preenchidos com (1) esponja de colágeno sem células, (2) esponja de colágeno com CTMs, (3) esponja de colágeno com OBs e (4) esponja de colágeno com associação de CTMs e OBs. Para avaliação da reparação óssea in vivo após 4 semanas, foram realizadas análises histomorfométricas através de cortes histológicos e microtomografia computadorizada. Os dados foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e, se necessário pelo teste de Mann-Whitney (p≤0,05). Foi observado que CTMs têm efeito repressivo sobre a proliferação e as expressões fenotípicas e genotípicas de OBs (P≤0,05). Em relação ao reparo dos defeitos ósseos, somente naqueles tratados com células observou-se formação óssea predominantemente como ilhotas isoladas e diferenças, principalmente qualitativas, entre os tipos celulares utilizados, com tendência de maior formação óssea em defeitos tratados com OBs em comparação ao uso de CTMs. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que as CTMs apresentam efeito inibitório sobre OBs e que a terapia celular com OBs parece ser mais eficaz no reparo do tecido ósseo. / The regeneration of bone defects remains a major challenge in the field of Dentistry and Medicine. It is well known that mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoblasts (OBs) play critical roles in osteogenesis, making them promising alternatives to be employed in cell therapy procedures to enhance the process of bone regeneration. Studies about the crosstalk between MSCs and OBs are mainly focused on the effect of OBs on MSCs, thus how MSCs may affect OBs phenotype expression remains a challenging question. Based on our previous studies, we have hypothesized that cell therapy using a combination of MSCs and OBs could be more effective for the bone repair than these cells separately, mainly due to the stimulation of OBs by MSCs. For this, we carried out in vitro experiments to evaluate the effects of MSCs on the OBs and in vivo experiments to assess the effects of these cells either isolated or combined on bone repair. Rat bone marrow MSCs were cultured either in growth medium to keep MSCs features or in osteogenic medium to differentiate into OBs. After reaching subconfluence, cells were grown in vitro in three different conditions: (1) direct coculture of MSCs and OBs using three cell proportions (1:1, 1:2 and 2:1), (2) indirect coculture of MSCs and OBs using transwell porous filters and (3) OBs cultured in MSCs conditioned medium. Cell responses were evaluated by assaying cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation, gene expression of osteoblast markers, immunolocalization of bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), and cell migration. For in vivo experiments, cells were seeded into collagen sponge by a centrifugation method. After, calvarial defects were implanted with (1) collagen sponge without cells, (2) collagen sponge with MSCs, (3) collagen sponge with OBs, and (4) collagen sponge and association of MSCs with OBs. To evaluate bone repair at the end of 4 weeks, histomorphometric analyzes were carried out using histological slides and micro-computed tomography. Data were compared by Kruskal-Wallis test and, if appropriated, by Mann-Whtiney test (p≤0.05). It was observed that MSCs repressed proliferation, phenotypic and genotypic expressions of OBs (P≤0.05). Bone formation was observed only in cell treated defects as isolated islets and qualitative differences were noticed among cell types, with a tendency of more bone formation in OBs treated defects compared with MSCs ones. Based on these results, we can conclude that MSCs exhibited inhibitory effect on OBs and that cell therapy with OBs seemed to be more effective for bone repair.

O presente estudo teve por objetivo avaliar por meio da análise de freqüência de ressonância (AFR) o efeito da irradiação com laser de GaAlAs na estabilidade de implantes de titânio, como cociente de estabilidade do implante (ISQ) instalados em pacientes parcialmente edentados na região posterior da mandíbula; assim como avaliar a evolução da estabilidade dos implantes, durante o período de osseointegração. Foram selecionados 8 pacientes adultos, com boa saúde para a instalação cirúrgica de 30 implantes Xive S® (Dentsply). Portanto, foram instalados de 2 a 5 implantes por paciente, distribuídos bilateralmente. Cada paciente atuou como seu próprio controle. Os implantes do lado controle não foram irradiados, e os do lado experimental foram submetidos a terapia com laser de diodo GaAlAs com ?= 830 nm, densidade de energia de 8 j/cm2, potência de 100 mW, modo contínuo, de forma pontual em 20 pontos, durante 3 segundos por ponto. A primeira sessão de irradiação foi no pós-operatório imediato, sendo repetida a cada 48 horas nos primeiros 14 dias, totalizando 7 irradiações. Após a instalação dos implantes foi medida a estabilidade primária destes com o aparelho Osstell?. Novas medidas de ISQ foram realizadas após 10 dias, e 3, 6, 9 e 12 semanas. No momento da instalação, os valores de ISQ na região posterior da mandíbula oscilaram de 65-84 com média de 76, sofrendo queda significativa da estabilidade do 100 dia para a 6a semana no grupo irradiado e apresentando um aumento gradual a partir da 6a semana até a 12a semana. Os valores mais altos de ISQ foram observados no 100 dia no grupo irradiado, embora sem significância estatística, e os mais baixos foram observados na 6a semana em ambos os grupos. Não foi evidenciado o efeito do laser de GaAlAs na estabilidade dos implantes com o aparelho OsstellTM, porém não se pode afirmar que os padrões de reparação óssea e a taxa de osseointegração entre os implantes irradiados e não irradiados tenham sido similares. / JThe present study was carried out to evaluate the effect of irradiation with the GaALAs laser in the stability of titanium implants (ISQ), inserted in partially edentulous patients, by means of resonance frequency analysis (RFA); as well as to evaluate the evolution of the stability during the osseointegration processs. A group of 8 patients were seleted for the insertion of 30 implants (Xive S® - Dentsply). The implants in the control site were not irradiated, and the implants in the experimentall site were submitted to laser therapy with a GaAlAs with ?= 830 nm, energy density of 8 j/cm2, power of 100 mW, continuing mode, in 20 points, for 3 seconds per point. The first irradiation was immediately after the surgery, and it was repeated every 48 hours in the first 14 days, totalizing 7 irradiations. After the implants insertion, the primary stability was measured using Osstell?. New measurements were carried out after 10 days, 3, 6, 9, 12 weeks. The incial ISQ values ranged from 65-84, with a mean of 76, showing a significative decrease in the stability from the 10th day to the 6th weeks in the irradiated group, and showing a gradual increase from 6th to 12th week. The highest ISQ values were observed in the 10th day in the irradiated group, and the lower ISQ values were observed in the 6th week in both groups. The effect of the irradiation with GaAlAs laser in implant stability was not evicenced; however, it can not be affirmed that irradiated and not irradiated implants have similar bone repair patterns and osseointegration rates.

O presente estudo teve por objetivo avaliar por meio da análise de freqüência de ressonância (AFR) o efeito da irradiação com laser de GaAlAs na estabilidade de implantes de titânio, como cociente de estabilidade do implante (ISQ) instalados em pacientes parcialmente edentados na região posterior da mandíbula; assim como avaliar a evolução da estabilidade dos implantes, durante o período de osseointegração. Foram selecionados 8 pacientes adultos, com boa saúde para a instalação cirúrgica de 30 implantes Xive S® (Dentsply). Portanto, foram instalados de 2 a 5 implantes por paciente, distribuídos bilateralmente. Cada paciente atuou como seu próprio controle. Os implantes do lado controle não foram irradiados, e os do lado experimental foram submetidos a terapia com laser de diodo GaAlAs com ?= 830 nm, densidade de energia de 8 j/cm2, potência de 100 mW, modo contínuo, de forma pontual em 20 pontos, durante 3 segundos por ponto. A primeira sessão de irradiação foi no pós-operatório imediato, sendo repetida a cada 48 horas nos primeiros 14 dias, totalizando 7 irradiações. Após a instalação dos implantes foi medida a estabilidade primária destes com o aparelho Osstell?. Novas medidas de ISQ foram realizadas após 10 dias, e 3, 6, 9 e 12 semanas. No momento da instalação, os valores de ISQ na região posterior da mandíbula oscilaram de 65-84 com média de 76, sofrendo queda significativa da estabilidade do 100 dia para a 6a semana no grupo irradiado e apresentando um aumento gradual a partir da 6a semana até a 12a semana. Os valores mais altos de ISQ foram observados no 100 dia no grupo irradiado, embora sem significância estatística, e os mais baixos foram observados na 6a semana em ambos os grupos. Não foi evidenciado o efeito do laser de GaAlAs na estabilidade dos implantes com o aparelho OsstellTM, porém não se pode afirmar que os padrões de reparação óssea e a taxa de osseointegração entre os implantes irradiados e não irradiados tenham sido similares. / JThe present study was carried out to evaluate the effect of irradiation with the GaALAs laser in the stability of titanium implants (ISQ), inserted in partially edentulous patients, by means of resonance frequency analysis (RFA); as well as to evaluate the evolution of the stability during the osseointegration processs. A group of 8 patients were seleted for the insertion of 30 implants (Xive S® - Dentsply). The implants in the control site were not irradiated, and the implants in the experimentall site were submitted to laser therapy with a GaAlAs with ?= 830 nm, energy density of 8 j/cm2, power of 100 mW, continuing mode, in 20 points, for 3 seconds per point. The first irradiation was immediately after the surgery, and it was repeated every 48 hours in the first 14 days, totalizing 7 irradiations. After the implants insertion, the primary stability was measured using Osstell?. New measurements were carried out after 10 days, 3, 6, 9, 12 weeks. The incial ISQ values ranged from 65-84, with a mean of 76, showing a significative decrease in the stability from the 10th day to the 6th weeks in the irradiated group, and showing a gradual increase from 6th to 12th week. The highest ISQ values were observed in the 10th day in the irradiated group, and the lower ISQ values were observed in the 6th week in both groups. The effect of the irradiation with GaAlAs laser in implant stability was not evicenced; however, it can not be affirmed that irradiated and not irradiated implants have similar bone repair patterns and osseointegration rates.